专利名称：用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种在血清/浆等生物样品中去除高丰度蛋白的方法。
技术背景人类血清/浆等生物样品中含有机体组织细胞分泌、脱落至血中的多种低丰 度蛋白质，它们可能是一些信号传导和调控的关键蛋白。例如，坏死、凋亡或 溶血过程中，都会有一些细胞内蛋白质释放到血中。开展疾病的血清蛋白质组 学研究，寻找低丰度蛋白质，将有利于阐明发病机理，并有可能发现一些与疾 病特定状态相关的标志性蛋白质，从而为疾病的诊断提供新方法。血清蛋白质 组学的研究成果可应用于疾病的临床诊断、病程监测、疗效监控和药物治疗等 方面。然而一些高丰度蛋白质的存在，尤其是白蛋白和抗体，使得低丰度蛋白 质的分辨率下降，严重影响低丰度蛋白质的鉴定和检测。提高对低丰度蛋白检测的灵敏度和分辨率，关键在于去除样品中的高丰度 蛋白质。常用的两种方法一种是以树脂为载体对高丰度蛋白进行去除的方法， 另一种是以磁性微粒为载体通过亲和层析原理对高丰度蛋白进行去除的方法。以树脂为载体对高丰度蛋白进行去除的方法，分离柱需要一定的活化时间 及前处理步骤，并且所需反应体积较大，之后还需样品的浓縮，对小体积样品 处理时不能得到理想的结果。以磁性微粒为载体通过亲和层析原理对高丰度蛋 白进行去除的方法则非常简便快捷，没有磁性微粒载体和生物样品的前处理和 耗时的柱层析处理及离心步骤，可根据实验需要调整反应体积，也适合于对小 体积生物样品的去除。由于磁性微粒本身的超顺磁性，实验时只需一个磁性分 离器，就可实现对高丰度蛋白的去除。然而，现有磁性微粒载体方法对高丰度 蛋白的去除种类少，只能对白蛋白和抗体进行去除。而且其对亲和配基采用共 价偶联的方法固定到载体上，使得亲和配基的活性造成了一定的损失。组装型磁性复合微�：秃�/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组
成已经在中国专利ZL 03153486. 4和ZL 03124061. 5分别进行了公开，但其应用 中主要包括分子固定以及相关检测的内容，未涉及到对高丰度蛋白去除方面的内容。发明内容本发明的目的在于提供一种用金磁微粒去除血清/浆等生物样品中白蛋白/ 抗体等高丰度蛋白的方法，其解决了现有去除高丰度蛋白方法去除种类少、去 除效率低的缺点。本发明的技术解决方案是一种用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法，包括以下步骤-l]用金磁微粒固定高丰度蛋白的亲和配基取金磁微粒置于离心管中，磁 性分离，弃上清；用偶联缓冲液清洗两次，磁性分离，弃上清；加入溶解在偶 联缓冲液中的高丰度蛋白亲和配基，20 4(TC条件下，充分反应10min 30min, 磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；加入保存缓冲 液，2 8°(:保存备用；2]稀释待处理生物样品对待处理生物样品用去除缓冲液进行稀释； 3]将金磁微�：痛砩镅饭餐从潭烁叻岫鹊鞍浊缀团浠慕鸫盼⒘４判苑掷耄锨澹尤肴コ撼逡海旌暇龋判苑掷耄锨澹患尤胂∈秃蟮拇砩镅罚�20 4(TC条件下，充分反应5min 60min; 4]去除高丰度蛋白将反应后的金磁微粒磁性分离，移取分离后上清即为去除了白蛋白或/和抗体的生物样品。上述方法还包括金磁微粒的封闭步骤在固定了高丰度蛋白亲和配基的金磁微粒加入保存缓冲液之前，先加入封闭剂，在20 4(TC条件下，充分反应2h， 磁性分离，弃上清；再加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清，重复清洗三次。上述方法还包括金磁微粒的再生步骤将去除了高丰度蛋白的金磁微粒用 再生缓冲液清洗，将吸附到金磁微粒上的高丰度蛋白洗脱下来，再将金磁微粒加入保存缓冲液，2。C 8。C保存备用。上述待处理生物样品是血清、血浆、脑脊液；所述高丰度蛋白是浓度高于10ug/ml的高丰度蛋白，包括白蛋白、IgG、转铁蛋白、C3补体、IgA、 IgM、 胰蛋白、珠蛋白、脂蛋白、F因子、C9补体、C4补体、铜蓝蛋白、载脂蛋白B、 载脂蛋白A-1、 ci-l-酸性糖蛋白、H因子、补体因子B、前白蛋白或Clq补体； 所述高丰度蛋白的亲和配基包括蛋白A/G及其衍生物、相应高丰度蛋白的抗体 或者多肽。上述偶联缓冲液是0. 005 M l M的pH7. 0 9. 0的Tris-HCl缓冲液，或者 是0. 005 M l M的pH9. 0 11. 0的碳酸盐缓冲液，或者是0. 005 M l M的pH5. 6 的醋酸盐缓冲液，或者是0.005 M l M的pH3.0 7.0的柠檬酸盐缓冲液，或 者是0. 005 M 1 M的pH7. 0 9. 0的TBS缓冲液，或者是0. 005 M l M的pH3. 0 7.0的TE缓冲液，或者是0.5X 10X的pH5.0 8.0的PBS缓冲液；所述清 洗缓冲液为上述偶联缓冲液或者是含0. 02 0. 2%吐温的偶联缓冲液；所述封闭 剂是偶联缓冲液与1% 10%外加成份的混合溶液，外加成份是牛血清白蛋白、赖 氨酸、脱脂奶粉、乙醇胺和动物血清中的一种或多种的混合物；所述去除缓冲 液是0.005 M l M的pH7. 0 9. 0的Tris-HC1缓冲液或者0. 5X 20X的 PH5. 0 8. 0的PBS缓冲液;所述再生缓冲液是0. 01 M l M的pH2 5的Gly-HCl 缓冲液或者O.Ol M l M的pH2 5的柠檬酸盐缓冲液，所述保存缓冲液是上述偶联缓冲液或者是上述偶联缓冲液、防腐剂和保护剂的混合溶液，所述防腐剂 是0.01 0. 1%的叠氮钠或者0.01 0. 1%的硫柳汞，所述保存缓冲液是0.05 1%BSA或者0. 05 1%的动物血清或者0. 05% 1%的蛋白酶抑制剂。上述偶联缓冲液优选0. 2 M的pH8. 0的Tris-HC1缓冲液，清洗缓冲液优选 含0. 1%吐温，pH8.0的1XPBS缓冲液；封闭剂优选含1%牛血清白蛋白和1% 赖氨酸的偶联缓冲液；去除缓冲液优选pH6. 0的1 XPBS缓冲液；再生缓冲液优 选0. 05 M， pH3. 5的Gly-HCl缓冲液；保存缓冲液优选含0. 1%叠氮钠和0. 1%BSA 的1XPBS缓冲液。上述金磁微�：透叻岫鹊鞍浊缀团浠姆从μ跫欠从ξ露忍跫�37°C， 反应转速是在摇床中180r/min，反应时间是10 miri;所述固定了高丰度蛋白亲 和配基的金磁微�：痛砩镅返姆从μ跫欠从ξ露忍跫�37"C，反 应转速是在摇床中180r/min，去除抗体时的反应时间是10 min，去除白蛋白的 反应时间是30 min。
本发明的优点是-1、 去除效率高。因为金磁微粒是通过将亲和配基非共价偶联到其表面的方 法固定亲和配基，且具有较大的比表面积，所以具有固定化容量高，亲和配基活性强的优点。比如对抗体的固定，lmg的金磁微粒能够固定0.3mg以上的抗 体。由于此种金磁微粒对生物分子的固定化容量很高，使得利用此种固定了血 清/浆等生物样品中高丰度蛋白的相关亲和配基的金磁微粒对血清/浆等生物样 品中高丰度蛋白的去除效率很高。2、 去除的特异性强。金磁微粒兼具超顺磁性微粒在磁场作用下易于分离和 金、银表面极易与巯基化生物活性物质结合而易被修饰的优点，此外该复合微 粒具有极强的对外加磁场的响应性，从而增加了去除的特异性。以金磁微粒为 载体对样品中高丰度蛋白去除的种类不仅限于白蛋白和抗体IgG，还包括其它高 丰度蛋白如转铁蛋白，C3补体，IgA, IgM，胰蛋白，珠蛋白，脂蛋白，F因 子，C9补体，C4补体，铜蓝蛋白，载脂蛋白B,载脂蛋白A-1, a-1-酸性糖蛋 白，H因子，补体因子B，前白蛋白，Clq补体等。3、 去除过程便捷。本发明方法不需要对血清/浆等生物样品进行白蛋白或/ 和抗体等高丰度蛋白去除前的处理，直接对血清/浆等生物样品用去除缓冲液进 行适度倍数的稀释即可进行相应的去除步骤；而且本发明方法不需要对去除白 蛋白或/和抗体所用的载体基质即金磁微粒进行使用前的活化处理及离心操作， 可直接使用，操作方便快捷，縮短了去除所需时间，也无需使用昂贵的实验仪 器。
图1为金磁微粒对血清中白蛋白去除后样品所做的SDS-PAGE考马斯亮蓝染 色电泳图，其中泳道1为样品1去除白蛋白后的电泳图，泳道2为样品2去 除白蛋白后的电泳图，泳道3为血清样品的电泳图，泳道4为marker分子量标 准(14 97KD)电泳图。图2为金磁微粒对血清中抗体去除后样品所做的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色 电泳图，其中泳道l为marker分子量标准(14 97KD)电泳图，泳道2和3为 抗体IgG条带，泳道4为血清样品去除抗体后的电泳图。
具体实施方式
实施例1是金磁微粒表面的蛋白A的固定过程及用金磁微粒对血清/浆等生物样品中抗体进行去除的具体过程l]蛋白A在金磁微粒表面的固定及金磁微粒的封闭取l ml金磁微粒悬液 加入到一个2 ml容量的离心管中，轻摇重悬。置于磁性分离器上，磁性分离， 弃上清。加入1 ml偶联缓冲液(0. 2 M的pH8. 0的Tris-HC1缓冲液)，轻摇重 悬。置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清。重复操作一次。将蛋白A配置成 浓度为1 mg/ml的溶液，取100 200 "1加入金磁微粒中，在摇床中37°C， 180r/min反应30 min。反应完毕，磁性分离，弃上清。加入1 ml清洗缓冲液 (含O. 196吐温的pH8.0的PBS缓冲液)，轻摇重悬磁粒。磁性分离，弃上清。加 入1 ml的封闭剂(含1%牛血清白蛋白和1%赖氨酸的偶联缓冲液)，在摇床中 37°C， 180r/min反应2 h。用2 ml的上述清洗缓冲液清洗3次，最后悬于1 ml 保存缓冲液(含O. 1%叠氮钠和0. ly。BSA的PBS缓冲液)中，2 8。C保存备用。2]血清/衆等生物样品中抗体的去除&血清/浆等生物样品的稀释取5 ul血清/桨等生物样品，用去除缓冲 液(pH6.0的1XPBS缓冲液)稀释至50 ul。b.将步骤1]中的金磁微粒磁性分离，弃上清。加入1 ml的去除缓冲液(p服.0 的1XPBS缓冲液)，轻摇重悬金磁微粒，磁性分离，弃上清。加入a步骤中的 血清/浆等生物样品，在摇床中37。C， 180 r/min反应10 min。抗体就被结合到 亲和配基上，再经磁场中磁性分离，从而实现抗体从血清/浆等生物样品中的去 除。移取磁性分离后的上清，即为去除了抗体的样品。3]金磁微粒的再生和保存加入1 ml再生缓冲液(O. 05 M， pH3. 5的Gly-HCl 缓冲液)到上步骤中的金磁微粒中，在摇床中37。C， 180 r/min反应2 min，将 吸附到金磁微粒上的抗体从金磁微粒上洗脱下来，磁性分离，弃上清。加入lml 的上述清洗缓冲液，轻摇重悬金磁微粒，磁性分离，弃上清。加入lml的上述 保存缓冲液2 8°C保存备用。实施例2是金磁微粒表面人血清白蛋白抗体的固定及用其对血清/浆等生物 样品中白蛋白进行去除的具体过程-l]人血清白蛋白抗体在金磁微粒表面的固定及金磁微粒的封闭取4 ml金 磁微粒到一个5ml容量的离心管中，轻摇重悬。置于磁性分离器上，磁性分离， 弃上清。加入4ml偶联缓冲液，轻摇重悬。置于磁性分离器上，磁性分离，弃 上清。重复操作一次。将人血清白蛋白抗体配置成浓度为1 mg/ml的溶液，取 1.5 ml加入金磁微粒中，在摇床中37'C， 180 r/min反应30 min。反应完毕， 磁性分离，弃上清。加入4ml清洗缓冲液，轻摇重悬磁粒。磁性分离，弃上清。 加入4ml的封闭剂，在摇床中37°C， 180 r/min反应2 h。用4 ml的清洗缓冲 液清洗3次，最后悬于2 ml保存缓冲液中，2 8。C保存备用。2]血清/浆等生物样品中白蛋白的去除&.血清/浆等生物样品稀释取5 yl血清/浆等生物样品，用去除缓冲液 稀释至100 ul。b.将l]步骤中的金磁微粒磁性分离，弃上清。加入4ml的去除缓冲液，轻 摇重悬金磁微粒，磁性分离，弃上清。加入a步骤中的血清/浆等生物样品，在 摇床中37。C， 180 r/min反应30 min。白蛋白就被结合到亲和配基上，再经磁 场中磁性分离，从而实现白蛋白从血清/浆等生物样品中的去除。移取磁性分离 后的上清，即为去除了白蛋白的样品。3]金磁微粒的再生和保存加入3 ml再生缓冲液(O. 05 M, pH3. 5的Gly-HCl 缓冲液)到上步骤金磁微粒中，在摇床中37。C， 180r/min反应2min，将吸附 到金磁微粒上的白蛋白从金磁微粒上洗脱下来，磁性分离，弃上清。加入4ml 的清洗缓冲液，轻摇重悬金磁微粒，磁性分离，弃上清。加入2ml的保存缓冲 液2 8。C保存备用。从图1可以看出，泳道1和泳道2中，已无明显的白蛋白条带出现，说明 白蛋白去除较为彻底。从图2可以看出，泳道4中已无明显的抗体条带出现， 说明抗体去除较为彻底。本发明原理本专利以金磁微粒为载体对血清/浆等生物样品中的高丰度蛋白进行去除。 本发明将稀释好的血清/浆等生物样品与固定了白蛋白或/和抗体等高丰度 蛋白亲和配基的金磁微粒与血清/浆等生物样品共同反应一段时间后，即可实现 白蛋白或/和抗体等高丰度蛋白亲和吸附到固定有白蛋白或/和抗体等高丰度蛋10
白亲和配基的金磁微粒表面。经在磁场中磁性分离后，即可实现白蛋白或/和抗 体等高丰度蛋白从血清/浆等生物样品中分离和去除的目的。而且本发明所用的亲和配基不仅仅局限于蛋白A/G及相应高丰度蛋白的抗体，而是包括蛋白A/G及其衍生物，抗体，多肽等生物材料和非生物材料。金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包 覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性 纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe:A、 Y- FeA等铁的氧化物粒子，单质Fe、 Co、 Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚 集体是指经修饰后形成的Fe:A、 Y- FeA等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后 形成的单质Fe、 Co、 Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形 成的正铁酸盐粒子聚集体。
权利要求
1、一种用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤1]用金磁微粒固定高丰度蛋白的亲和配基取金磁微粒置于离心管中，磁性分离，弃上清；用偶联缓冲液清洗两次，磁性分离，弃上清；加入溶解在偶联缓冲液中的高丰度蛋白亲和配基，20～40℃条件下，充分反应10min～30min，磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；加入保存缓冲液，2～8℃保存备用；2]稀释待处理生物样品对待处理生物样品用去除缓冲液进行稀释；3]将金磁微�：痛砩镅饭餐从潭烁叻岫鹊鞍浊缀团浠慕鸫盼⒘４判苑掷耄锨澹尤肴コ撼逡海旌暇龋判苑掷耄锨澹患尤胂∈秃蟮拇砩镅罚�20～40℃条件下，充分反应5min～60min；4]去除高丰度蛋白将反应后的金磁微粒磁性分离，移取分离后上清即为去除了白蛋白或/和抗体的生物样品。
2、 根据权利要求1所述的用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法，其特征在于-所述方法包括金磁微粒的封闭步骤在固定了高丰度蛋白亲和配基的金磁微粒加入保存缓冲液之前，先加入封闭剂，在20 40'C条件下，充分反应2 h,磁 性分离，弃上清；再加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清，重复清洗三次。
3、 根据权利要求1所述的用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法，其特征在于:所述方法包括金磁微粒的再生步骤将去除了高丰度蛋白的金磁微粒用再生缓冲液清洗，将吸附到金磁微粒上的高丰度蛋白洗脱下来，再将金磁微粒加入保存缓冲液，20C 8。C保存备用。
4、 根据权利要求3所述的用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法，其特征在于: 所述方法包括金磁微粒的封闭步骤在固定了高丰度蛋白亲和配基的金磁微粒加入保存缓冲液之前，先加入封闭剂，在20 4(TC条件下，充分反应2 h，磁 性分离，弃上清；再加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清，重复清洗三次。
5、 根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法， 其特征在于所述待处理生物样品是血清、血衆、脑脊液；所述高丰度蛋白是浓度高于lOix g/ml的高丰度蛋白，包括白蛋白、IgG、转铁蛋白、C3补体、IgA、 IgM、胰蛋白、珠蛋白、脂蛋白、F因子、C9补体、C4补体、铜蓝蛋白、载脂蛋 白B、载脂蛋白A-1、 a-l-酸性糖蛋白、H因子、补体因子B、前白蛋白或Clq 补体；所述高丰度蛋白的亲和配基包括蛋白A/G及其衍生物、相应高丰度蛋白 的抗体或者多肽。
6、 根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法， 其特征在于所述偶联缓冲液是0. 005 M l M的pH7. 0 9. 0的Tris-HC1缓冲 液，或者是0.005 M l M的pH9.0 11.0的碳酸盐缓冲液，或者是0.005 M 1 M的pH5. 6的醋酸盐缓冲液，或者是0. 005 M l M的pH3. 0 7. 0的柠檬酸盐缓 冲液，或者是0.005 M lM的pH7.0 9. O的TBS缓冲液，或者是0.005 M 1M 的pH3. 0 7. 0的TE缓冲液，或者是0.5X 10 X的pH5. 0 8. 0的PBS缓冲 液；所述清洗缓冲液为上述偶联缓冲液或者是含0.02 0.2%吐温的偶联缓冲 液；所述封闭剂是偶联缓冲液与1% 10%外加成份的混合溶液，外加成份是牛血 清白蛋白、赖氨酸、脱脂奶粉、乙醇胺和动物血清中的一种或多种的混合物； 所述去除缓冲液是0. 005 M l M的pH7. 0 9. 0的Tris-HC1缓冲液或者0. 5 X 20X的PH5. 0 8. 0的PBS缓冲液；所述再生缓冲液是0. 01 M l M的pH2 5 的Gly-HC1缓冲液或者0. 01 M l M的PH2 5的柠檬酸盐缓冲液，所述保存缓 冲液是上述偶联缓冲液或者是上述偶联缓冲液、防腐剂和保护剂的混合溶液， 所述防腐剂是0. 01 0. 1%的叠氮钠或者0. 01 0. 1%的硫柳汞，所述保存缓冲液 是0. 05 1%BSA或者0. 05 1%的动物血清或者0. 05% 1%的蛋白酶抑制剂。
7、 根据权利要求6所述的用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法，其特征在于 所述偶联缓冲液是0. 2 M的pH8. 0的Tris-HC1缓冲液，所述清洗缓冲液是含0. 1% 吐温，pH8. 0的1XPBS缓冲液；所述封闭剂是含1%牛血清白蛋白和1%赖氨酸 的偶联缓冲液；所述去除缓冲液是pH6.0的1XPBS缓冲液；所述再生缓冲液是 0. 05 M， pH3. 5的Gly-HC1缓冲液；所述保存缓冲液是含0. 1%叠氮钠和0. 1% BSA 的1XPBS缓冲液。
8、 根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒去除高丰度蛋白的方法, 其特征在于所述金磁微�：透叻岫鹊鞍浊缀团浠姆从μ跫欠从ξ露忍� 件是37t:，反应转速是在摇床中180r/min，反应时间是10min;所述固定了高丰度蛋白亲和配基的金磁微�：痛砩镅返姆从μ跫欠从ξ露忍跫�37t:，反应转速是在摇床中180r/min，去除抗体时的反应时间是10 min，去 除白蛋白的反应时间是30 min。
全文摘要
本发明涉及一种采用金磁微粒去除血清/浆等生物样品白蛋白和/或抗体等高丰度蛋白方法。金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。本发明是通过亲和层析的方法将高丰度蛋白的亲和配基固定到金磁微粒表面，利用白蛋白或/和抗体与其相应亲和配基的亲和作用以及金磁微粒的超顺磁性从而在磁场中将白蛋白或/和抗体等高丰度蛋白从血清/浆等生物样品中分离出来以达到去除的目的。具有去除效率高、去除的特异性强、去除过程便捷的优点。
文档编号G01N1/34GK101165466SQ20061010475
公开日2008年4月23日 申请日期2006年10月19日 优先权日2006年10月19日
发明者唐一通, 崔亚丽, 铮 李, 超 陈 申请人:陕西西大北美基因股份有限公司
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