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专利名称：将烟囱顶96孔pcr板用于批量测定氨基酸含量的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种将烟囱顶96孔PCR板用于茚三酮比色法批量测定样品中氨基酸含量的方法。
背景技术：
氨基酸与茚三酮在加热条件下的反应是一种可定量的显色反应。反应产物所呈现的颜色随氨基酸、酸碱度、温度、还原剂和金属离子强度等的不同而异。多数氨基酸与茚三酮反应产生蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，通过测定该显色化合物在其吸收峰(通常在570nm)的吸光度，可以测定氨基酸的含量。茚三酮比色法简便可靠而被广泛地应用于检测食品、饮品、调味品和保健品中的氨基酸含量。当前质检部门需要检测大量样品，常规的茚三酮比色法进行茚三酮反应是将样品溶液与茚三酮试剂放在玻璃试管中用沸水加热，这种操作方式不易同时检测大量样品。通常，将常规比色法批量化来检测样品中某物质的含量是将微量体积的样品溶液和显色剂溶液加入96孔微孔板的小孔中进行显色反应，用酶标仪检测各孔中显色产物的吸光度，但这种方式并不适用于需要沸水加热的茚三酮反应。常规的透明微孔板的材质是不耐热的聚苯乙烯，在沸水中会变形。一般耐热的聚丙烯材质的塑料制品透明度差，不能满足检测孔内溶液吸光度的要求。最近已有制造商，如德国Eppendorf公司，用聚丙烯制成了高透明的微孔板(目前的价格约是常规聚苯乙烯微孔板的两倍)，能够用来检测孔内溶液的吸光度；但其整个底部与常规的微孔板一样是平的，当用沸水加热时，板周边孔的底部和板边缘侧面可同时受热，而内部的孔仅底部受热，导致周边与内部孔内的溶液在受热、显色速率和蒸发量上都有差异，结果同样的样品溶液经反应后在周边孔和内部孔的吸光度不同，产生较大的检测误差。而且，沸水有时会进入微孔内干扰比色测定。另外，用已预热的可精确控温的烘箱能均勻加热耐热的微孔板，但为了防止溶液在烘烤下蒸发，需要在反应液上覆盖一层不参与反应且透明的油(Efewmonkiekie W. Iyamu, Toshio Asakura, Gerald Μ. Woods. Analytical Biochemistry 2008,383 :332-334)，在操作上不够简便。因此，目前还欠缺简便、可靠且实用的能用茚三酮比色法批量检测样品中氨基酸含量的方法。

发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种简便可靠的、将聚丙烯材质的烟囱顶96孔 PCR板用于茚三酮比色法批量测定样品中氨基酸含量的方法。本发明的解决方案是，提供一种将聚丙烯材质的烟囱顶96孔PCR板用于批量测定氨基酸含量的方法该方法通过茚三酮比色法测定样品溶液中的氨基酸含量，将烟囱顶 96孔PCR板上的各小管作为盛装样品溶液和茚三酮试剂的容器，用镂空的乙烯乙酸乙烯酯 (EVA)塑料垫(俗称“水漂”)架着浮在沸水中加热进行茚三酮反应，在显色完全后将小管中的反应液转入聚苯乙烯材质的96孔微孔板的板孔中，再用全波长酶标仪在显色物的吸收峰(通常在570nm)测定吸光度来测定样品液中氨基酸的含量。本发明中，所述聚丙烯材质的烟囱顶96孔PCR板在结构上是一个平板嵌着纵8X 横12个锥形小管；每个小管中下部垂直凸出在板平面下方，而顶端高出板平面约5mm;平板在由小管组成的矩阵阵列外有一周边沿(见图1)；板的边沿可用EVA塑料垫架着使板浮在沸水上，各锥形小管在板平面下的凸出部分可浸入水中均勻受热，高出板平面的“烟囱顶” 不仅能部分减少各小管内溶液的蒸发，免去在反应液上覆油来阻止蒸发，而且能防止沸水进入小管内。本发明中，用乙二醇作茚三酮的溶剂并添加抗坏血酸还原剂，这些物质无毒且有效地稳定了茚三酮和显色产物，并防止还原茚三酮被氧化，提高了检测的可重复性。本发明中，所述聚丙烯材质的烟囱顶96孔PCR板是分子生物学研究和诊断中用来扩增核酸片段的聚合酶链式反应(PCR)所用的一种特殊的批量反应容器；烟囱顶的特殊设计主要用来防止PCR扩增核酸片段时各管孔间样品的交叉污染。本发明利用分子生物学中批量扩增核酸的PCR反应容器的特性，创新性地将烟囱顶96孔PCR板用于批量进行分析化学中的茚三酮反应，解决了用沸水或烘箱直接加热微孔板时遇到的问题或不便，建立了用茚三酮比色法批量测定样品中氨基酸含量的新方法。本发明的有益效果在于本发明提供的将聚丙烯烟囱顶96孔PCR板用于茚三酮比色法批量测定样品中氨基酸含量的方法，在检测准确度、灵敏度和可重复性上与常规的茚三酮比色法相同，但比常规茚三酮比色法操作更简便，节省了人力、时间及试剂的用量，可广泛应用于批量检测食品、饮品、调味品和保健品中氨基酸的含量。同时，本发明将分子生物学研究和诊断中用来批量扩增核酸的烟囱顶PCR板用于分析化学的茚三酮比色测定，为烟囱顶PCR板提供了一种全新的用途。


图1为烟囱顶96孔PCR板的示意图。(图中的A_H、1_12表示各小管位置序号)图2为本发明方法用烟囱顶96孔PCR板作茚三酮反应容器测定L-谷氨酸浓度的标准曲线。图3为常规方法用玻璃试管作茚三酮反应容器测定L-谷氨酸浓度的标准曲线。
具体实施例方式本发明用聚丙烯烟囱顶96孔PCR板的小管作反应容器，用镂空的EVA塑料垫将 PCR板浮在沸水上，加热小管中的样品和茚三酮试剂进行显色反应，在显色完全后将小管中的反应液转入聚苯乙烯材质的96孔微孔板的板孔中，再用全波长酶标仪在显色物的吸收峰(通常在570nm)测定吸光度来测定样品液中氨基酸的含量。当空白、7个工作浓度标准样和样品各设三个重复，一个烟囱顶96孔PCR板可以同时测定M个样品，实现了批量检测样品中氨基酸的含量。而且，本发明在配制茚三酮溶液时用乙二醇作溶剂稳定茚三酮和显色产物，并加了抗坏血酸作还原剂来防止还原茚三酮被氧化；配制时每克茚三酮用120ml 乙二醇溶解并加30mg抗坏血酸。
实施例所需仪器有精密电子天平、单道移液器、8道移液器、电磁炉及配套用锅、721型可见光分光光度计、全波长酶标仪或可检测微孔板样品的分光光度计。所需其它材料有容量瓶、试管、三角瓶、移液槽、EVA塑料垫、烟@顶96孔PCR板和96孔微孔板。配制茚三酮溶液称取l.Og茚三酮和30mg抗坏血酸溶解于120ml乙二醇， 在-20°C保存。配制柠檬酸缓冲液称取19. 21g无水柠檬酸溶解于双蒸水，定容至IOOml配成IM 柠檬酸溶液；称取29. 41g 二水合柠檬酸三钠溶解于双蒸水，定容至IOOml配成柠檬酸钠溶液。分别取配比的柠檬酸和柠檬酸钠溶液混合成适合特定氨基酸进行茚三酮反应的最适PH 值的IM柠檬酸缓冲液。如对于L-谷氨酸进行茚三酮反应，用41ml柠檬酸溶液和59ml柠檬酸钠溶液混合成100ml pH 5. 0的IM柠檬酸缓冲液。配制氨基酸标准溶液称取氨基酸标准品溶于双蒸水并定容成氨基酸母液，再用双蒸水稀释到氨基酸标准曲线制作工作浓度。以L-谷氨酸为例，称取73. 6mg L-谷氨酸溶解于双蒸水定容至IOOml配成5mM L-谷氨酸母液，再吸取5ml用双蒸水稀释10倍得到50ml 0. 5mM的L-谷氨酸标准液，再分别吸取8. 0、6. 0、4. 0、2. 0、1. 0和0. 5ml的0. 5mM L-谷氨酸标准液，用双蒸水稀释定容到10ml，配成0. 4,0. 3,0. 2,0. 1,0. 05和0. 025mM的L-谷氨酸系列标准液。用烟囱顶96孔PCR板作茚三酮反应容器制作氨基酸浓度测定标准曲线和测定样品液中氨基酸的浓度或含量用单道移液器在烟囱顶96孔PCR板的小管中分别加入60 μ 1 的双蒸水、氨基酸系列标准液(如0. 025,0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4和0. 5mM 7个浓度的L-谷氨酸系列标准液)和样品液，各3个重复；将IOml茚三酮溶液和IOml IM柠檬酸缓冲液混勻倒入移液槽，用8道移液器吸取120 μ 1的茚三酮试剂加入96孔PCR板的每个小管，并在小管中吸排溶液几次混勻反应液；用镂空的EVA塑料垫架着96孔PCR板浮在沸水上加热， 显色完全(如检测L-谷氨酸需加热15分钟)后，将96孔PCR板从沸水中取出放在室温水浴上冷却2分钟；用8道移液器吸取100 μ 1各反应液加入96孔微孔板的相应孔中，用全波长酶标仪在显色物的吸收峰(通常在570nm)测定吸光度，通过氨基酸系列标准液反应液的吸光度制作标准曲线并计算出回归方程和相关系数，利用回归方程来计算测定样品液中氨基酸的含量。按常规方法用玻璃试管作茚三酮反应容器制作氨基酸浓度测定标准曲线和测定样品液中氨基酸的浓度或含量用单道移液器在玻璃试管(直径18mm，长度180mm)中分别加入Iml的双蒸水、氨基酸系列标准液(如0. 025,0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4和0. 5mM 7个浓度的L-谷氨酸系列标准液)和样品液，各3个重复；将IOOml茚三酮溶液和100ml IM柠檬酸缓冲液倒入玻璃三角瓶中混勻，用单道移液器吸取2ml茚三酮试剂加入每个玻璃试管； 给试管加盖后振荡几次混勻反应液，将试管放在沸水中加热；显色完全(如检测L-谷氨酸需加热15分钟)后，将试管从沸水中取出放在室温水浴中冷却2分钟；将试管中冷却的反应液振荡几次再静置10分钟后，将试管中的反应液倒入比色皿中，用721型分光光度计在显色物的吸收峰(通常在570nm)测定吸光度，通过氨基酸系列标准液反应液的吸光度制作标准曲线并计算出回归方程和相关系数，利用回归方程来计算测定样品液中氨基酸的含量。
比较用烟囱顶96孔PCR板作茚三酮反应容器和常规方法用玻璃试管作茚三酮反应容器制作L-谷氨酸浓度测定标准曲线发现两种方法都获得了线性的标准曲线，所得回归方程分别为y = 3. 0585x(图2)和y = 3. 4074x(图3)，相关系数R2都达到0. 999 ；两种方法检测L-谷氨酸浓度的下限都是0. 0125mM ；表明本发明方法在检测准确度、灵敏度和可重复性上与常规的茚三酮比色法相同。但是，如果用常规茚三酮比色法检测M个样品中的谷氨酸，每个样品三个重复，制作标准曲线要用M个试管，检测M个样品要用72个试管；如果再用常规电磁炉和配套用锅来进行沸水浴加热，一个人要分四次加热反应才能检测完，费时费力，消耗的茚三酮试剂和柠檬酸缓冲液至少是用烟囱顶96孔PCR板反应的10 倍。而用本发明方法的烟囱顶PCR板进行茚三酮反应，一个板一次反应就可同时完成标准曲线的制作和M个样品的检测，省时、省力、省试剂。
权利要求
1.将烟囱顶96孔PCR板用于批量测定氨基酸含量的方法，是通过茚三酮比色法测定样品溶液中的氨基酸含量；其特征在于，在测定过程中，使用聚丙烯材质的烟囱顶96孔PCR 板上的各小管作为盛装样品溶液和茚三酮试剂的容器，用镂空的乙烯乙酸乙烯酯塑料垫架着PCR板浮在沸水中加热进行茚三酮反应；在配制茚三酮溶液时，使用乙二醇作为溶剂以稳定茚三酮及显色产物，并添加抗坏血酸作为还原剂以防止茚三酮被氧化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的烟囱顶96孔PCR板是一个嵌有纵 8X横12个锥形小管的平板，能批量盛装微量体积溶液进行化学反应；板的材质是耐热的聚丙烯，能用沸水加热小管中的溶液进行化学反应；在由小管组成的矩阵阵列外有一周边沿，能用镂空的EVA塑料垫架着使板浮在沸水上；各小管中下部垂直凸出板平面下方，凸出部分能浸入水中均勻受热；各小管顶端高出板平面5mm，高出的管壁部分能在加热时减少小管内溶液的蒸发，而且能防止沸水进入小管内。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，茚三酮溶液的配比为每克茚三酮用 120ml乙二醇溶解并添加30mg抗坏血酸。
全文摘要
本发明属于分析化学领域，旨在提供一种将烟囱顶96孔PCR板用于批量测定氨基酸含量的方法。该方法是通过茚三酮比色法测定样品溶液中的氨基酸含量，在测定过程中使用聚丙烯材质的烟囱顶96孔PCR板上的各小管作为盛装样品溶液和茚三酮试剂的容器，用镂空的乙烯乙酸乙烯酯塑料垫架着PCR板浮在沸水中加热进行茚三酮反应。本发明比常规茚三酮比色法操作更简便，节省了人力、时间及试剂的用量，可广泛应用于批量检测食品、饮品、调味品和保健品中氨基酸的含量。同时，本发明将分子生物学研究和诊断中用来批量扩增核酸的烟囱顶PCR板用于分析化学的茚三酮比色测定，为烟囱顶PCR板提供了一种全新的用途。
文档编号G01N21/78GK102323259SQ20111016493
公开日2012年1月18日 申请日期2011年6月19日 优先权日2011年6月19日
发明者安千里, 李郑义 申请人:浙江大学