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专利名称：：一种快速测定奶牛亚临床酮病的试纸制备方法
技术领域：
：本发明涉及动物疾病检测试剂开发领域，特别是一种制备快速测定奶牛亚临床酮病测试试纸的方法。二、
背景技术：
随着奶牛产量的不断提高和集约化饲养程度的不断加强，奶牛营养代谢病的发病率逐年上升，其中酮病是高产奶牛常见的一种代谢性疾病，它主要是由糖类和脂类代谢紊乱引起，通常发生于产后一个月。调查显示，我国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的10%-30%,亚临床酮病的发生率则更高，据研究报道，在泌乳前九周，奶牛亚临床酮病的发病率达59%。亚临床酮病的发病率是临床酮病的10-20倍，但由于缺乏可见的临床症状而不易被发现，因此给我国奶牛业造成很大的经济损失。对亚临床酮病可进行血清学检测，目前普遍认为，血清中β-羟丁酸含量超过1.2mm0l/L就可认为奶牛患亚临床酮病。然而，对农户来说，采集血样十分不易，采集尿样或乳样检测亚临床酮病就比较简单。国外对酮病比较重视，研究出了许多快速检测尿和乳中酮体的方法及防治手段，如欧洲这种检测试条被称为KetolacBHB,在日本被称为Sanketopaper，在加拿大被称为Keto-Test0此外，还有用于人医上的商品尿酮体试剂带和酶法酮体试剂盒等，在人类糖尿病和酮症酸中毒的诊断取得了较好的效果。但这类试剂用于奶牛的酮病检测价格高昂。而国内对酮病的重视不够，快速检测方法单一，防治手段跟不上，多年来，碱性亚硝基铁氰化钠(酮粉法)试验一直用于酮体的半定量分析，是临床上初步诊断奶牛亚临床酮病的一种简便方法，但其灵敏度和特异性较低，而且定量测定乳汁酮体含量来检测亚临床酮病的报道几乎没有。为此，研究开发成本低、简便易行的测试方法应用于奶牛亚临床酮病检测具有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一种快速测定奶牛亚临床酮病的试纸制备方法，以血中β_羟丁酸浓度>1.2mmol/L为阳性标准，开发尿酮体试剂，具有高特异性和灵敏度，同时成本低，简便易行，结果迅速，可检测多种受测样品如血、尿、血清、血浆及乳。具体为一种快速测定奶牛亚临床酮病的试纸制备方法为步骤一，将用热水浴中溶解的阿拉伯树胶中加入硼酸、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二钠溶液并用氢氧化钠调整PH值为7.0后，趁热浸泡试纸20min，最后于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱内过夜；步骤二，热水浴中溶解聚乙二醇、亚硝基铁氰化钠、无水乙醇，趁热浸泡上述试纸20min，取出试纸用滤纸吸干后置于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱过夜，即成。本发明是一种经生产实践证明的可用于快速筛选奶牛亚临床酮病的试纸制备方法，该试剂条以血中β-羟丁酸浓度>1.2mmol/L为阳性标准，经生产实践证明成本低，简便易行，结果迅速，具有高特异性和灵敏度，多种受测样品如血、尿、血清、血浆及乳均可采用，适用范围较广。具体实施例方式一种快速测定奶牛亚临床酮病的试纸制备方法，其具体组分为阿拉伯树胶、硼砂、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇2000、亚硝基铁氰化钠和无水乙醇。具体制备方法为步骤一，取阿拉伯树胶60g于烧杯中，加蒸馏水600ml将烧杯置于热水浴中使溶解，放置过夜。第二天取清亮液(去杂质)加热后，加入硼砂60g、氨基乙酸100g、乙二胺四乙酸二钠30g，溶解后溶液温度约40°C，pH约为7.0(可用pH5.5-9试纸测定)，用氢氧化钠调整PH值为7.0后，趁热浸泡试纸20min，最后于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱内过夜。步骤二，聚乙二醇60g、亚硝基铁氰化钠12g、置于烧杯中，加无水乙醇600ml，在热水浴中溶解，溶解后的总体积用无水乙醇补充到672ml，趁热浸泡上述试纸20min，取出试纸用滤纸吸干后置于60°C干燥箱烘干，并置干燥箱过夜。将上述试纸剪成长0.25cm，宽0.25cm的小块，用双面胶粘在长约5cm，宽约0.25cm的硬纸板上备用即成。效果测试1、标准色板的绘制选取经酮粉法测定结果为(_)、(士)、(+)、(++)、(+++)、(++++)的标准尿样标本6个，依据上述确定的工艺参数制备的尿酮试剂带，在这些标本中试验，参照其颜色变化调制标准色板。2、试验设计(1)采用L9(34)正交设计研究浸泡时间(10min、15min、20min)，溶液PH值(7.0、7.5,8.0)，烘干温度(50°C、55°C、60°C)对尿酮体试剂带检测尿酮体效果的影响，从而筛选出最佳制作工艺参数。试验方案见表1。正交设计试验方案隨___A(浸泡时间)BGI^tpH)C(烘干温度)—D(空白)试验号11(10)1(7.0)1(50)21(10)2(7.5)2(55)31(10)3(8.0)3(60)42(15)1(7.0)2(55)52(15)2(7.5)3(60)62(15)3(8.0)1(50)73(20)1(7.0)3(60)83(20)2(7.5)1(50)93(20)3(8.0)2(55)_任选已经酮粉法测定的尿酮标本50例，将上述试剂带浸入各样本，取出后看它们的颜色变化，比较与酮粉法测定结果的符合情况，确定制备尿酮体试剂带的最佳工艺参数。(2)亚临床酮病快速检测方法的比较选取泌乳期奶牛共286头，采集新鲜尿样，分别用自制尿酮体试剂带和酮粉法检测尿酮含量。以血浆β-羟丁酸的浓度(β-羟丁酸的浓度>1.2mmol/L)作为判定酮体真正阳性率(即亚临床酮病)的标准。自制尿酮体试剂带按上述制备方法制备；酮粉试剂包括亚硝基铁氰化钠、硫酸氨、无水碳酸钠(均为分析纯)，购自昆明杰辉生物技术有限公司；羟丁酸/乙酰乙酸试剂盒购自哈尔滨医科大学第一临床医学院实验诊断教研室。3试验结果(1)确定最佳工艺参数表2正交设计方差分析过程<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表2可知，影响尿酮体试剂带检测效果的因素依次为浸泡时间>溶液？!1值>烘干温度。经方差分析证明，浸泡时间的长短对尿酮体试剂带检测效果有明显的影响(P<0.05)，而溶液ρΗ、烘干温度对其效果的影响不明显(P均>0.05)。由此，确定浸泡时间为20min，溶液ρΗ为7.0，烘干温度为60°C作为制备尿酮体试剂带的最佳工艺参数。(2)亚临床酮病快速检测方法的比较结果自制尿酮体试纸和酮粉法检测尿酮的灵敏度、特异性、阴性预测值，阳性预测值，结果见表3。表3不同检测方法的灵敏度、特异性、阴性估计值、阳性估计值<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在检测尿酮时，如灵敏度较高，特异性较低，会造成非酮病牛假阳性率增高；而特异性较高，灵敏度太低，则会造成真正酮体阳性牛的漏检。从表3中可以看出自制尿酮体试剂带的灵敏度和特异性都较传统酮粉法高。权利要求一种快速测定奶牛亚临床酮病的试纸制备方法，其特征在于其制备方法为步骤一，将用热水浴中溶解的阿拉伯树胶中加入硼酸、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二钠溶液并用氢氧化钠调整PH值为7.0后，趁热浸泡试纸20min，最后于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱内过夜；步骤二，热水浴中溶解的聚乙二醇、亚硝基铁氰化钠、无水乙醇，趁热浸泡上述试纸20min，取出试纸用滤纸吸干后置于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱过夜，即成。全文摘要本发明公开一种快速测定奶牛亚临床酮病的试纸制备方法，通过先将用热水浴中溶解的阿拉伯树胶中加入硼酸、氨基乙酸、乙二胺四乙酸二钠溶液并用氢氧化钠调整pH值为7.0后，趁热浸泡试纸20min，最后于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱内过夜；然后，热水浴中溶解聚乙二醇、亚硝基铁氰化钠、无水乙醇，趁热浸泡上述试纸20min，取出试纸用滤纸吸干后置于60℃干燥箱烘干，并置干燥箱过夜，即成。该试剂条以血中β-羟丁酸浓度＞1.2mmol/L为阳性标准经生产实践证明成本低，简便易行，结果迅速，具有高特异性和灵敏度，多种受测样品如血、尿、血清、血浆及乳均可采用，适用范围较广。文档编号G01N33/64GK101833006SQ20091009421公开日2010年9月15日申请日期2009年3月13日优先权日2009年3月13日发明者冷静,刘鸿,杨舒黎,毛华明,邓卫东申请人:云南农业大学