专利名称：一种自体脂肪干细胞抗衰老效果的评价体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及再生医学领域。具体地，本发明涉及一种自体脂肪干细胞抗衰老效果的评价体系，用本发明的体系能够准确、客观、及时地对脂肪干细胞的抗衰老的效果进行评价。
背景技术：
人类从胚胎发育、生命诞生到发育成熟、衰老直至死亡的整个生命过程中，不可避免地会发生组织、器官的损伤和功能衰退。在正常生理过程中，人体每天都有大量细胞死亡，同时伴有大量细胞的新生，以维持各种组织和器官的完整性，保证功能处于正常状态。 如果细胞的死亡与新生失去平衡，死亡细胞增多或新生细胞减少，就会导致组织器官功能的减退、疾病发生，甚至死亡。衰老是人体随着年龄增长、环境影响而发生的组织、器官、细胞的功能退行性变化，表现为机体的功能活动能力进行性下降，对环境的适应能力逐渐降低，体内代谢平衡失调，进而导致面色苍老、皮肤松弛、皱纹增多、易疲劳、脑力和体力劳动能力下降、性功能减退等一系列衰老症状。由于衰老是全身系统性组织、器官功能退化，因此，抗衰老和整形的策略也应考虑从整体水平改善功能。再生医学的兴起激发了人们对各种干细胞、组织工程支架和细胞生长因子的研究热潮。干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下， 它可以分化成多种功能性细胞。干细胞可以对多种组织、器官、系统的老化退行性病变进行再生性修复，使其结构和功能正常化、年轻化，从整体上调控机体状态，是一种全身性、系统性、根本性的保健。脂肪组织通常被认为是贮存能量及内分泌器官，是软组织填充和吸脂处理的必要组织，脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便。脂肪组织含有多种祖细胞，可分化为多种谱系，主要包含脂肪细胞、脂肪干细胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)、血管内皮细胞、 成纤维细胞、巨噬细胞及细胞外基质。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) 是一种具有多向分化潜能的干细胞，ADSCs在体外稳定增殖且衰亡率低，在体内体外具有多向分化潜能，在不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。脂肪干细胞来源广泛、取材容易、对机体损伤�。迥诖⒈噶看�、少量组织即可获取大量干细胞，且适宜自体移植和大规模培养，因此脂肪干细胞逐渐成为近年来的研究热点之一，同时也为一系列疾病的治疗提供了新的思路。研究证明，脂肪干细胞对新陈代谢和抗衰老有重要的调节功能，脂肪干细胞保健和治疗能提高机体对各种脂蛋白的代谢功能，具有例如降低血中总胆固醇浓度，提高机体糖代谢功能，降低血糖水平，降低体重等功能。因此尽管用于抗衰老的脂肪干细胞发展很快，但是由于生物体的内外环境的作用，阻碍了自体脂肪干细胞抗衰老的评价体系的建立，因此本领域需要开发和建立一种快速、准确、经济的脂肪干细胞抗衰老的评价方法和体系。
发明内容
本发明的目的就是提供一种简便和/或高效的一种自体脂肪干细胞抗衰老效果的评价体系。本发明提供了一种脂肪干细胞抗衰老的评价方法，对回输了脂肪干细胞的个体， 在回输结束一段时间后进行血清学检测，所述的血清学检测包括检测选自下组的一个或多个指标维生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲状腺激素、睾酮、雌二醇。(a)当Ra彡5%时，则该指标有效，其中，Ra= (Ral-RaO) ^-RaO X 100%,式中，Ral为个体回输后血清中的维生素D浓度，RaO为回输结束前的维生素D浓度；(b)当1 彡5%时，则该指标有效，其中，Rb = (Rbl-RbO)+RbOX 100%，式中，Rbl为个体回输后血清中的高密度脂蛋白浓度，RbO为回输结束前的高密度脂蛋白浓度；(c)当Rc彡5%时，则该指标有效，其中，Rc = (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO为回输结束前的低密度脂蛋白浓度，Rcl为个体回输后血清中的低密度脂蛋白浓度；(d)当Rd彡5%时，则该指标有效，其中，Rd = (RdO-Rdl)+RdOX 100%，式中，RdO为回输结束前的促甲状腺激素的浓度，Rdl为个体回输后血清中促甲状腺激素的浓度；(e)当个体是男性时，且当Re彡5 %时，则该指标有效，其中，Re = (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel为个体回输后血清中的睾酮的浓度，ReO为回输结束前的睾酮的浓度；(e)当个体是女性时，且当Rf彡5%时，则该指标有效，其中，Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl为个体回输后血清中的雌二醇的浓度，RfO为回输结束前的雌二醇的浓度；并且，当所述指标中至少一个指标为有效时，则表示所述脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当所述指标中有2、3和4个指标为有效时，则所述脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，所述的回输结束前，包括回输开始之前、回输过程中以及回输结束时。在另一优选例中，所述的一段时间为> 1个月。
在另一优选例中，所述的一段时间为2-6个月，较佳地为3个月。在另一优选例中，所述回输的脂肪干细胞为培养0-90天的脂肪干细胞。在另一优选例中，所述回输的脂肪干细胞为培养30天的脂肪干细胞。在另一优选例中，所述脂肪干细胞是自体脂肪干细胞。在另一优选例中，当Ra ^ 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Ra ^ 20%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rb ^ 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rb ^ 20%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rc ^ 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rc ^ 20%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rd ^ 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rd ^ 20%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Re ^ 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述男性个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Re ^ 20%时，提示回输的脂肪干细胞在所述男性个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rf ^ 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述女性个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，当Rf ^ 20%时，提示回输的脂肪干细胞在所述女性个体中产生抗衰老效果。在另一优选例中，所述的回输的脂肪干细胞的具有以下一个或多个特征(i) 95%以上的细胞具有表面抗原⑶四；(ii) 90%以上的细胞具有表面抗原⑶73 ；(iii) 90%以上的细胞具有表面抗原⑶49d ；和(iv) 90%以上的细胞具有表面抗原⑶90。在另一优选例中，99%以上的细胞具有表面抗原⑶四。在另一优选例中，95%以上的细胞具有表面抗原⑶73。在另一优选例中，95%以上的细胞具有表面抗原⑶49d在另一优选例中，95%以上的细胞具有表面抗原⑶90。在另一优选例中，所述脂肪干细胞还具有以下特征(ν) 5%以下的细胞具有表面抗原CD34 ；和/或
(vi)O. 05%以下的细胞具有表面抗原CD45。在另一优选例中，3%以下的细胞具有表面抗原⑶34在另一优选例中，0%的细胞具有表面抗原⑶45。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再--累述。
图1显示了用流式细胞仪法对制备的SVF进行表面抗原标记表达的分析结果。图2显示了用流式细胞仪法对经培养的脂肪干细胞群进行表面抗原标记表达的分析结果。图3显示了分离和培养的脂肪干细胞具有分化为脂肪的能力，其中，图3A显示在成脂诱导剂作用下，脂肪干细胞能够生成脂质，胞浆中可见生产大量的红色脂滴；图3B为成脂实验的阴性对照，在没有成脂诱导剂的作用下，脂肪干细胞不能够自发生成脂质。图4显示了分离和培养的脂肪干细胞具有分化为骨的能力，其中，图4A显示脂肪干细胞在成骨诱导剂作用下，经茜素红染色，可见细胞浆中有红色的钙化基质沉积；图4B 显示成骨实验的阴性对照，在没有成骨诱导剂的作用下，脂肪干细胞不能够自发成骨。图5显示了回输脂肪干细胞的受试者，其血液中维生素D的浓度显著上升。图6显示了回输脂肪干细胞的受试者，高密度脂蛋白(HDL)的浓度显著上升。图7显示了回输脂肪干细胞的受试者，低密度脂蛋白(LDL)的浓度均显著下降。图8显示进行脂肪干细胞回输后的男性受试者，其血清中睾酮的浓度显著上升。图9显示进行脂肪干细胞回输后的女性受试者，其血清中雌二醇的浓度显著上升。图10显示了回输脂肪干细胞的受试者，其血清中促甲状腺激素的浓度均显著下降。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，在可供检测的大量的血清学指标中，维生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲状腺激素、睾酮(男性)、雌二醇(女性)的含量变化可以作为评价自体脂肪干细胞抗衰老效果的有效性指标，当所述指标中至少一个指标为有效时，则表示所述脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。与此相反，胆固醇， 血糖，总脂蛋白等的浓度不能作为评估脂肪干细胞抗衰老效果的有效性指标。用本发明的评价体系能够客观地对脂肪干细胞的抗衰老的效果进行评价，并且具有快速、准确、经济的优点。在此基础上完成了本发明。术语
如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95%以上“指彡95%, "0.2% 以下”指彡0.2%。脂肪自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、 腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织，包括 (但不限于)抽吸、手术分离等方法。间质血管碎片(SVF)SVF是干细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化，从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片。间质血管碎片中含有丰富的间充质细胞，可分化为多种谱系的细胞，是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞，本领域的技术人员能够使用通用的方法进行SVF的纯化，在一个优选的实施例中，分离SVF可以包括以下步骤(但不限于)将吸脂后的脂肪用PBS反复冲洗两次，然后在37°C条件下用胶原酶消化30min，用含10%胎牛血清的DMEM终止消化，1200g离心IOmin后即获得高密度的SVF碎片，其中主要包括间质细胞、血管内皮细胞和壁细胞。另外，SVF中也包括一些血管来源的细胞，如白细胞和红细胞等，各种细胞之间具有协同效应。脂肪干细胞如本文所用，术语“脂肪干细胞”、“本发明脂肪干细胞”、或“本发明的干细胞”可以互换使用，都是指分离自脂肪组织的干细胞。脂肪干细胞(ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，它取材容易、体内储备量大、适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。在本发明中，脂肪组织或脂肪的原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。干细胞抗原检测脂肪干细胞群具有多种特异性抗原和受体，主要有D29、⑶73、⑶49d、⑶90、⑶14、 CD45、CD34、CD3、CD13、CD59、CD105 等。⑶34抗原是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞 (HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，是脂肪干细胞的阴性指标，带有CD34的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为< 5%，更佳地，<3%。⑶45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞，是脂肪干细胞的阴性指标，带有⑶45的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为< 0. 1%，更佳地，为0%。⑶四、⑶73、⑶90、⑶49d等主要存在于脂肪间充质干细胞表面。带有⑶四的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为> 95%，更佳地> 97%，最佳地彡 99%。带有⑶73的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为> 80%，更佳地> 85%，最佳地彡 88%。带有⑶90的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为> 75%，更佳地> 78%，最佳地彡 80%。
带有⑶49d的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为彡90%，更佳地彡95%，最佳地彡99%。本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪干细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链； 遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。成脂诱导及检测由于脂肪干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下对脂肪干细胞进行分化诱导，能够得到特定功能的已分化的细胞。本领域内技术人员可以使用通用的方法对脂肪干细胞进行成脂诱导。一种优选的诱导方法是向培养液中加入地塞米松。含地塞米松的诱导剂主要有3种，1.地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)，2.地塞米松加胰岛素，3.地塞米松加茚甲新 (indomethacin,消炎痛)、1_甲基_3_异丁基黄嘌呤及胰岛素。低浓度的地塞米松是无血清或低血清培养间充质干细胞的必需成分之一，能够促进间充质干细胞的体外快速增殖； 较高浓度的地塞米松则可以诱导间充质干细胞向脂肪细胞分化。本领域内技术人员可以使用通用的方法和染料(如Oil Red、苏丹红5B和溶剂红 27等)对脂肪干细胞诱导成脂进行检测。一种优选的染料是Oil Red(O)，即油红0。油红 0的结构为1-[2，5_ 二甲基-4-(2，5-二甲基苯偶氮)苯偶氮]-2萘酚，是一种红色粉末，油溶性偶氮染料，易溶于苯、乙醇和丙酮。成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。油红0作为生物染色剂，易与油脂结合，但与细胞本身的结构着色力差。在显微镜下可以清楚地进行成脂染色观察。成骨诱导及检测由于脂肪干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下对脂肪干细胞进行成骨分化诱导，能够得到成骨细胞。本领域内技术人员可以使用通用的方法对脂肪干细胞进行成骨诱导。一种优选的化学成骨诱导液配方为DMEM培养液，甘油磷酸钠，维生素C和地塞米松。成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，即“钙结节”。一种优选的鉴定钙结节的染料未“茜素红”。茜素红染色液一般包括以下组分 茜素磺酸钠，茜素S，茜素红S，茜素胭脂红，1,2- 二羟基蒽醌-3-磺酸钠，1,2- 二羟基蒽醌-3-磺酸钠盐。茜素红为橙黄色或黄棕色粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿能与许多金属离子生成带色化合物，能与锆、钍、铝、钛及铍和钙的显色反应。茜素红染色的原理就是茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。维生素D (Vitamin D，VD)维生素D(Vitamin D，VD)为固醇类衍生物，脂溶性，由于具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素，VD能够维持血清钙磷浓度的稳定。在本发明中，当Ra彡5%时，则该指标有效，其中，
Ra= (Ral-RaO) ^-RaO X 100%,式中，Ral为个体回输后血清中的维生素D浓度，RaO为回输结束前的维生素D浓度。本发明人发现，维生素D水平的提高，有助于提高个体的健康水平。当个体回输自体脂肪干细胞后，其血液中的维生素D的含量有大幅上升，其原因可能是脂肪干细胞可以分化为骨细胞，刺激并诱导甲状旁腺素分泌的分泌，导致血清中的维生素D浓度上升。脂蛋白(Lipoprotein)脂蛋白是一种与脂质复合的水溶性蛋白质。通常根据其密度分为极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、极高密度脂蛋白和乳糜微粒。每一种脂蛋白中均含有相应的载脂蛋白。高密度脂蛋白(HDL)可将蓄积于末梢组织的游离胆固醇与血液循环中脂蛋白或与某些大分子结合而运送到各组织细胞，主要是肝脏。实际上是胆固醇逆转(RCR)，RCT促进组织细胞内胆固醇的清除，维持细胞内胆固醇量的相对衡定，从而限制动脉粥样硬化的发生发展，起到抗动脉粥样硬化作用。LCAT通过转酯化反应完成新生盘状HDL向HDL3、HDL2 的转化，减少血浆HDL中游离胆固醇的浓度，构成胆固醇从细胞膜流向血浆脂蛋白的浓度梯度，降低组织胆固醇的沉积。低密度脂蛋白(LDL)是富含胆固醇的脂蛋白，主要作用是将胆固醇运送到外周血液，是动脉粥样硬化的危险因素之一，被认为是致动脉粥样硬化的因子。在本发明中，当Rb彡5%时，则该指标有效，其中，Rb= (Rbl-RbO) ^-RbO X 100%,式中，Rbl为个体回输后血清中的高密度脂蛋白浓度，RbO为回输结束前的高密度脂蛋白浓度。当Rc彡5%时，则该指标有效，其中，Rc = (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO为回输结束前的低密度脂蛋白浓度，Rcl为个体回输后血清中的低密度脂蛋白浓度。本发明人发现，自体回输脂肪干细胞，有助于提高血清中高密度脂蛋白的浓度，降低低密度脂蛋白浓度，从而提高个体的健康水平。促甲状腺激素(Thyrotropin, thyroid stimulating hormone)促甲状腺激素是腺垂体分泌的促进甲状腺的生长和机能的激素。人类的TSH为一种糖蛋白，含211个氨基酸，糖类约占整个分子的15%。整个分子由两条肽链-α链和β 链组成。TSH全面促进甲状腺的机能，稍早出现的是促进甲状腺激素的释放，稍晚出的为促进Τ4、Τ3的合成，包括加强碘泵活性，增强过氧化物酶活性，促进甲状腺球蛋白合成及酪氨酸碘化等各个环节。TSH促进甲状腺上皮细胞的代谢及胞内核酸和蛋白质合成，使细胞呈高柱状增生，从而使腺体增大。在本发明中，当Rd彡5%时，则该指标有效，其中，Rd = (Rdl-RdO)+RdOX 100%，式中，Rdl为个体回输后血清中促甲状腺激素的浓度，RdO为回输结束前促甲状腺激素的浓度。TSH和甲状腺的产生和功能之间是一个反比关系，高的促甲状腺激素，标志着低甲状腺的生成和功能。本发明人发现，自体脂肪干细胞回输治疗后，TSH的水平在1个月和3 个月期间内显著下降，表明甲状腺激素的产生和功能有显著改善，自体脂肪干细胞的回输缓解了年龄相关疾病。睾酮(Testosterone)睾酮是由雄性睾丸或雌性卵巢分泌的一种类固醇激素。是人体内主要的雄激素， 包括增强性欲、力量、免疫功能等功效。睾酮作为一种激素原，还能够在芳香化酶的作用下可转变为17 β-雌二醇。在本发明中，当个体为男性，且Re ^ 5%时，则该指标有效，其中，Re = (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel为个体回输后血清中的睾酮浓度，ReO为回输结束前的睾酮浓度。本发明人发现，自体脂肪干细胞可以有助于提高个体的睾酮浓度，原因可能是脂肪干细胞分化为骨细胞，刺激破骨细胞和成骨细胞的分化，诱导骨骼与睾酮间关联的形成， 导致血清中的睾酮浓度上升。雌二醇Estradiol)雌二醇是一种留体雌激素。女性雌二醇是主要由卵巢成熟滤泡分泌的一种天然雌激素，能促进和调节女性性器官及副性征的正常发育。其主要作用为①促使子宫内膜增生；②增强子宫平滑肌的收缩；③促使乳腺导管发育增生；；④抗雄激素作用；⑤降低血中胆固醇，增加钙在骨中的沉着。在本发明中，当个体为女性时，且Rf > 5%时，则该指标有效，其中，Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl为个体回输后血清中雌二醇浓度，RfO为回输结束前雌二醇浓度。本发明人发现，自体脂肪干细胞可以有助于提高个体的雌二醇浓度，达到抗衰老的效果。随着年龄的衰老，雌二醇呈下降趋势，而LH作为雌二醇的负反馈是上升的，如果雌二醇升高，可使LH下降，达到抗衰老目的.本发明的主要优点包括(1)安全抽取血清对少量指标进行检测，无副作用；(2)便捷在一个小时内就可以作出脂肪干细胞抗衰老的效果的评价；(3)准确维生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲状腺激素、雌二醇、睾酮等可以作为评价脂肪干细胞抗衰老的重要指标，血清检测学方法成熟可靠。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例1基质血管组分(SVF)的获得1.获得脂肪组织
用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁，无菌针管从人体吸取脂肪组织，Ih内将其移至接收容器内。2.分装脂肪组织每一个培养瓶分装脂肪组织为50ml，用IOml移液管在脂肪采集瓶吸取下层红色液体，弃掉，剩余的上层脂肪混勻后进行分装。3.洗涤脂肪组织除去血细胞向培养瓶中加入IOOml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。4.胶原酶I消化加入等量新配制的预热(提前半小时于37°C的气浴摇床预热)的胶原酶I溶液， 封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5-10秒，置于振动气浴锅中，370C，70rpm,消化60分钟，每隔 15分钟剧烈晃动培养瓶5-10秒，直到看起来较为平滑。5.分离基质血管组分(SVF)将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。6.净化沉淀离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。需要在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。用适量的生理盐水重悬细胞，吹散，在室温下400g离心10分钟。IOml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml 离心管中，过100目筛，再次室温300g离心10分钟，得到经净化的SVF沉淀。实施例2脂肪干细胞种植和培养1.细胞种植离心后的SVF加20ml培养基，并充分混勻，根据培养瓶的面积，用基于组织块法进行细胞种植，按照每平方厘米接种0. 16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，每IOOml脂肪组织， 最终可以接种8个T75培养瓶。2.原代细胞培养将平置的培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养，培养条件为 37士0.5°C，二氧化碳体积分数为5士0.2%。原代培养第M小时，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。3.原代细胞收获7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70% _80%，消化收获。在培养瓶中加入消化酶(消化酶为0. 125% Trypsin-O. 01% EDTA溶液，使用前室温放置 15min,每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化时间为1. 5min,加入培养基^iil，反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入5ml氯化钠注射液，并冲洗瓶壁， 将洗液加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬�。�100 μ m无菌滤网过滤，将过滤液收集到50ml离心管中，lOOOrpm，IOmin离心。4.原代细胞传代
观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混勻，取样计数。计数后 lOOOrpm，IOmin二次离心。去除上清液，在离心管中加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞， 定容后接种至新的培养容器中，传代的细胞密度为5000-6000个/cm2，即(3. 75-4. 5) X IO5 个细胞/T75，按照4. 5 X IO5个细胞/T75进行传代，并置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件37 士 0. 5 °C，二氧化碳体积分数为5 士 0. 2 %，培养至细胞融合达85% -90%。经上述方法分离的细胞得率为5X IO5-I X IO6个/ml脂肪。培养第7天，Pl代细胞扩增的倍数可以达到1-2倍，培养第14天，P2代细胞扩增的倍数可以达到4-6倍，培养第21天，P3代细胞扩增的倍数可以达到10倍。实施例3抗原标记检测分别将SVF和培养后的脂肪干细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为 1 X KfmL-1，800rpm(120g)，离心5min，弃上清，用4°C的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800rpm，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至lmL，加入抗体 5 μ 1，避光，冰上放置30min。用D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2次，确保将未结合抗体除净最后，加入约200 μ 1的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测。加入的抗体分别为人抗CD29、CD73、CD49d、CD90、CD14、CD34、CD45、CD34、Actin 和HLA-DR。抗原检测结果见表1。表1
原细胞CD29CD73CD49dCD90CD14CD45CD34ActinHLA-DRSVF36%68. 7%93. 8%69%4. 5%10. 5%77. 8%2. 2%41%培养后的干细胞99. 1%98. 5%99%97. 6%1. 7%0%2. 9%2. 3%1. 3%表明通过流式细胞仪对脂肪干细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析，新鲜分离的SVF中混合细胞较多(见图1)，其中含有10. 5%的⑶45 ( —种典型的造血干细胞表面抗原)，77.8%的(一种已知位于白细胞表面的典型抗原)。而经过培养的脂肪干细胞(见图2)纯度非常高，基本上都是脂肪间充质干细胞，例如99. 具有CD^表面抗原(公认的脂肪干细胞特异性抗原)，98. 5%具有CD73 (公认的脂肪干细胞特异性抗原)，而具有CD14， ⑶4，⑶34抗原的细胞极少。实施例4脂肪干细胞的成脂诱导1.将培养的干细胞以1.5X IO5每孔的密度接种在六孔板中，进行成脂诱导实验。 具体方法是向基础培养基(DMEM+10%胎牛血清)中加入终浓度分别为lymol/L地塞米松、10 μ mol/L胰岛素、200 μ mol/L吲哚美辛和0. 5mmol/L的异丁基甲基黄嘌呤，配制成脂诱导培养基，以正常培养基培养的样本为成脂分化实验阴性对照组。每周换2次液，直到进行成脂染色观察为止，以上组均做平行实验(n = 3)。2.油红0染色先小心轻缓倒去培养液，用D-hanks轻缓漂洗，加10 %中性甲醛固定细胞膜 30min。加入0.5%油红0(六孔板加1.5ml)，染色Ih左右。3.脱色，75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料。4.复染，淡苏木染色lmin，PBS漂洗。5.甘油明胶封片，显微镜观察每组样本随机选取5-10个视野进行拍照观察以考察共培养方法的成脂诱导分化效果。脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。6.结果图3显示了分离和培养的脂肪干细胞具有分化为脂肪细胞的能力。图3A显示在成脂诱导剂作用下，脂肪干细胞能够生成脂质。图;3B为成脂实验的阴性对照，表明在没有成脂诱导剂的作用下，脂肪干细胞不能够自发生成脂质(大量密集在一起的小脂滴)。实施例5脂肪的干细胞成骨诱导1.成骨细胞分化胰酶消化培养的脂肪细胞后，以IX 105ml密度接种传代，基础培养基培养Id后更换诱导培养基DMEM/10 % FBS, 0. 1 μ mo/L地塞米松，50 μ mo/L维生素C，IOmmol/β -甘油磷酸钠，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素；每3d更换培养基，诱导培养2周。2.茜素红染色细胞以PBS洗涤2次，4%甲醛固定，1 %茜素红染色IOmin，冲洗，干燥，封片。3.观察每组样本随机选取5-10个视野进行拍照观察以考察成骨诱导分化效果。利用沉积的钙于茜素红可以发生显色反应，诱导成骨的细胞经茜素红染色，可见细胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。4.结果图4显示了分离和培养的脂肪干细胞具有分化为骨的能力.图4A显示脂肪干细胞在成骨诱导剂作用下，经茜素红染色，可见细胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。图4B显示成骨实验的阴性对照，在没有成骨诱导剂的作用下，脂肪干细胞不能够自发成骨。实施例6脂肪干细胞抗衰老评价1.将经培养和鉴定的脂肪干细胞细胞注入30ml生理盐水，制备成细胞悬液，以备回输使用。2.三次静脉回输脂肪干细胞分离当天，进行第一次回输，干细胞回输总量为2X107个； 脂肪干细胞培养至第30天，进行第二次回输，干细胞回输总量为2 X IO7个；
脂肪干细胞培养至第90天，进行第三次回输，干细胞回输总量为2X107个。4.回输前以及回输后的第一个月，第三个月分别用常规方法或市售检测试剂盒进行血清学检测。其中部分数据结果见表2。表 权利要求
1.一种脂肪干细胞抗衰老的评价体系，其特征在于，对回输了脂肪干细胞的个体，在回输结束一段时间后进行血清学检测，所述的血清学检测包括检测选自下组的一个或多个指标维生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲状腺激素、睾酮、雌二醇；(a)当Ra彡5%时，则该指标有效，其中， Ra= (Ral-RaO)+RaO X 100%，式中，Ral为个体回输后血清中的维生素D浓度，RaO为回输结束前的维生素D浓度；(b)当Rb彡5%时，则该指标有效，其中， Rb= (Rbl-RbO)+RbO X 100%，式中，Rbl为个体回输后血清中的高密度脂蛋白浓度，RbO为回输结束前的高密度脂蛋白浓度；(c)当Rc时，则该指标有效，其中， Rc= (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO为回输结束前的低密度脂蛋白浓度，Rcl为个体回输后血清中的低密度脂蛋白浓度；(d)当当Rd彡5%时，则该指标有效，其中， Rd= (Rdl-RdO)+RdOX 100%，式中，Rdl为个体回输后血清中促甲状腺激素的浓度，RdO为回输结束前促甲状腺激素的浓度；(e)当个体是男性时，且当Re> 5%时，则该指标有效，其中， Re= (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel为个体回输后血清中的睾酮的浓度，ReO为回输结束前的睾酮的浓度；(f)当个体是女性时，且当Rf彡5%时，则该指标有效，其中， Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl为个体回输后血清中的雌二醇的浓度，RfO为回输结束前的雌二醇的浓度； 并且，当所述指标中至少一个指标为有效时，则表示所述脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。
2.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，所述的回输结束前，包括回输开始之前、回输过程中以及回输结束时。
3.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，所述的一段时间为>1个月。
4.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，所述的回输的脂肪干细胞为培养0-90 天的脂肪干细胞。
5.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，当Ra> 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。
6.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，当Rb> 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。
7.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，当Rc> 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。
8.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，当Rd> 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述个体中产生抗衰老效果。
9.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，当Re> 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述男性个体中产生抗衰老效果。
10.如权利要求1所述的评价体系，其特征在于，当Rf> 10%时，提示回输的脂肪干细胞在所述女性个体中产生抗衰老效果。
全文摘要
本发明提供了一种自体脂肪干细胞抗衰老效果的评价体系，包括对回输了脂肪干细胞的个体，在回输结束一段时间后进行血清学检测，其中血清学检测包括选自下组的一个或多个指标维生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲状腺激素、睾酮、雌二醇。用本发明的评价体系能够客观地对脂肪干细胞的抗衰老的效果进行评价，并且具有准确、快速、经济的优点。
文档编号G01N33/96GK102486475SQ20111030161
公开日2012年6月6日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者吕伟麟, 张丽, 张炳强, 张露亿, 曹卫 申请人:臻景生物技术(上海)有限公司, 臻景生物技术(无锡)有限公司
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