专利名称：一种人Pif1基因、其编码蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，特别涉及一种能抑制端粒DNA加长的人Pif1基因、其编码蛋白及其应用。
背景技术：
端粒是真核细胞内染色体末端的蛋白质-DNA结构，在保护染色体的完整性和维持细胞的复制能力方面起着重要作用。其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体遭融合、重组和降解。
发明人发现酵母的Pif1蛋白(5’到3’DNA解旋酶)可抑制端粒DNA的加长，而且是通过抑制端粒酶而起作用的。Pif1蛋白的突变和Pif1蛋白的缺失的表型是一样的，都使端粒变长。如果过量表达有酶活性的Pif1蛋白，端粒DNA会缩短。发明人还进一步证明了，在酵母细胞内Pif1蛋白和端粒DNA是直接相互作用的。尤为重要的是，发明人发现PIF1基因家族在进化上是非常保守的，从酵母、线虫到果蝇都有Pif1同源蛋白。
人们在代表不同肿瘤类型的大约1000多个活检样品中发现大约85％的样品呈端粒酶阳性反应。相反，90％以上的邻近正常组织却是端粒酶阴性。从而将这个酶与永生化和肿瘤的形成密切联系在一起！在正常的人体细胞中，端粒程序性地缩短限制了转化细胞的生长能力，这很可能是肿瘤形成的一个抑制机制。端粒酶的重新表达在细胞永生化及癌变过程中起着重要的作用。有人甚至认为表达端粒酶的正常细胞更易癌变，端粒酶活性与肿瘤的这种特殊关系使之在诊断与治疗方面具有重要的应用价值。对端粒酶活性的抑制可能对某些类型的肿瘤来说是一个很有意义的治疗方法。
因此，本领域迫切需要研究开发人Pif1基因、其编码蛋白及其应用。
发明内容
本发明的目的是提供了一种人Pif1基因(hPif1)及其编码蛋白。
本发明的另一目的是提供一种利用所述基因或蛋白筛选促进或抑制端粒DNA加长的化合物的方法。
本发明的另一目的是提供了一种检测个体Pif1表达水平的试剂盒及治疗肿瘤的组合物。
本发明的第一方面，提供了一种分离的人Pif1蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳的，所述多肽选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有DNA解旋酶活性的由(a)衍生的多肽。
本发明的第二方面，提供了一种人Pif1多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
较佳的，所述人Pif1多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1923位的序列(b)具有SEQ ID NO1中1-2052位的序列。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有上述的多核苷酸。
本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述载体。
本发明的第五方面，提供了一种具有人Pif1蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达人Pif1蛋白的条件下，培养上述宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人Pif1蛋白活性的多肽。
本发明的第六方面，提供了一种能与上述人Pif1蛋白特异性结合的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。优选的，所述抗体为单克隆抗体。
本发明的第七方面，提供了一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的上所述Pif1蛋白、或上述多核苷酸，以及药学上可接受的载体。
本发明的第八方面，提供了一种筛选促进或抑制端粒DNA加长的化合物的方法，其特征在于，它包括步骤(1)将人Pif1基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达Pif1蛋白的细胞株(2)向步骤(1)中的表达Pif1蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测Pif1蛋白表达量的变化；抑制Pif1蛋白表达量增加的化合物就是促进端粒DNA加长的化合物，促进Pif1蛋白表达量增加的化合物就是抑制端粒DNA加长的化合物。
本发明的第九方面，提供了一种检测个体Pif1表达水平的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增人Pif1基因或转录本的引物，或者与人Pif1蛋白特异性结合的抗体。
如本文所用，术语“人Pif1蛋白”和“人Pif1多肽”可互换使用，指人Pif1氨基酸序列(SEQ ID NO2)有70％以上，较佳地80％以上，更佳地90％，最佳地95％以上同源性的多肽。此外，人Pif1的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物可用于本发明。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的人Pif1蛋白或多肽”是指人Pif1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人Pif1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人Pif1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人Pif1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人Pif1多肽”指具有人Pif1蛋白活性的SEQ IDNO2序列的多肽。该术语还包括具有与人Pif1蛋白相同功能的、SEQ IDNO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能(如不改变其DNA解旋酶活性区域，SEQ ID NO233-243)。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人Pif1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人Pif1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人Pif1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人Pif1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人Pif1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人Pif1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人Pif1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人Pif1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人Pif1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Pif1蛋白的多聚核苷酸。而反义的核酸片段可作为Pif1的拮抗剂，用于抑制遗忘和促进记忆。
Pif1核苷酸全长序列或其片段通�？梢杂肞CR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已知的酵母Pif1、小鼠Pif1或本发明所公开人Pif1的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Pif1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Pif1多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人Pif1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
具体而言，本发明的人Pif1蛋白可通过将相应的编码序列引入宿主细胞(直接引入或通过引入含人Pif1编码序列的载体)，并在合适的条件下培养转化的宿主细胞以表达人Pif1蛋白，然后分离和纯化出人Pif1蛋白。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
具体而言，本发明的人Pif1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)抑制端粒DNA的加长，和用于筛选促进或抑制人Pif1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体或化合物。用表达的重组人Pif1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人Pif1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人Pif1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Pif1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Pif1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Pif1蛋白的分子，也包括那些并不影响Pif1蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人Pif1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人Pif1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用人Pif1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人Pif1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗Pif1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人Pif1蛋白。
多克隆抗体的生产可用Pif1蛋白或多肽免疫动物，如家兔，羊等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与人Pif1蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。在筛选时，可以将人Pif1蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响Pif1蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。此外，还可将Pif1基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备高表达Pif1蛋白的细胞株并以此细胞株中的人Pif1蛋白为靶位点，筛选对人Pif1蛋白有激活或抑制作用的药物。并向所述的表达人Pif1蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测人Pif1蛋白表达量的变化。促进人Pif1蛋白表达的化合物就是抑制端粒DNA加长的化合物，而抑制人Pif1蛋白表达的化合物可用作促进端粒DNA加长的化合物。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、皮下、口服、或局部给药。
正常的人Pif1多肽可直接用于疾病治疗，例如，应用于治疗肿瘤。在使用本发明Pif1基因或蛋白的激动剂时，可以抑制端粒DNA的加长，从而抑制肿瘤细胞的生长。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明人Pif1蛋白、其编码核酸以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.01微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的Pif1蛋白或其激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.01微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
Pif1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于Pif1蛋白的无表达或异常/无活性的Pif1蛋白的表达所致的细胞的无限生长。构建携带Pif1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人Pif1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还涉及定量和定位检测Pif1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的Pif1蛋白水平，可以用作解释Pif1蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断Pif1蛋白起作用的疾病。
一种检测样品中是否存在Pif1蛋白的方法是利用Pif1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与人Pif1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Pif1蛋白。
人Pif1蛋白的多聚核苷酸可用于Pif1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，Pif1蛋白的多聚核苷酸可用于检测Pif1蛋白的表达与否或在疾病状态下Pif1蛋白的异常表达。如人Pif1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断人Pif1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用人Pif1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人Pif1基因的转录产物。
检测Pif1基因的突变也可用于诊断Pif1蛋白相关的疾病。人Pif1蛋白突变的形式包括与正常野生型人Pif1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
发明人研究发现人的Pif1同源蛋白也有7个解旋酶的保守区域图3。为了弄清人的Pif1蛋白是否类似酵母的可以抑制端粒酶介导的端粒延长活性，以及Pif1蛋白表达和癌症发生的关系，发明人将进一步筛选与人的Pif1蛋白相互作用的蛋白因子，希望这一系列的研究将有助于更深入地了解端粒复制的机制和端粒酶的调控机理，从而筛选到能抑制肿瘤生长的物质。
1999年10月22日，普林斯顿的Weinmann，Roberto所报道的美国第425335号专利中(Human homologue of yeast helicase and uses thereof，October22，1999)的人Pif1序列与发明人实验室报道的不一致。他们的序列为708氨基酸残基，而发明人的序列为641氨基酸残基，且C段完全异源，其序列的等同性为88％，其中在233-243氨基酸区域他们的序列出现缺失，而这一段是hPif1蛋白作为DNA解旋酶最重要的活性区。发明人的实验表明这段区域甚至单氨基酸突变都会使解旋酶失去活性。
图1.Pif1蛋白的人同源蛋白基因的核苷酸序列图2.Pif1蛋白的人同源蛋白的氨基酸序列(641aa)图3.Pif1蛋白家族各成员之间的序列比对由图可知，七个解旋酶结构域从酵母、果蝇、小鼠到人都是高度保守的。
图4.人Pif1蛋白的四种多克隆抗体效价及特异性的鉴定图5、人Pif1蛋白有ATP水解酶活性和DNA解旋酶活性A图，N端缺失的hPif1与GST融合蛋白在半乳糖诱导GAl1启动下在芽殖酵母中表达。酵母蛋白在7％的SDS-PAGE电泳，Coomassie染色。泳道1为分子量Marker，泳道2泳道3为半乳糖诱导前后的酵母粗抽提物，泳道4为半乳糖诱导后的酵母粗抽提物被50％硫酸铵沉淀部分，泳道5为Glutathione sepharose 4B亲和纯化的组分。
B图，PEI层析板分析酶活反应并磷屏成像泳道5含有γ-ATP32(AmerPharcia.Co)，M13单链DNA，Mg2+和hPif1，其他泳道成分都一致除泳道1用yPif1(酵母Pif1)代替hPif1，泳道2用BSA替代hPif1，泳道3无Mg2+，泳道4无M13单链DNA。
C图，对解旋酶活性试验来说，36碱基(36mer)的寡核苷酸序列用PNKinase(AEBioLab.Co)进行同位素末端标记，然后于单链M13 DNA复性褪火。泳道1样品煮变性过，泳道7含有hPif1_N(140-641位氨基酸)，DNA底物，ATP，及Mg2+，其它泳道于7泳道相同除过泳道3是BSA而非hPif1_N，泳道2含有酵母Pif1而非hPif1-N；泳道4是hPif1(K234A)-N泳道5无ATP，泳道6无Mg2+图6、Northern显示hPIF1在各细胞株中的表达分布图7、人内源性hPif1蛋白的检测图8、人hPif1蛋白在稳定转染株的表达情况将稳定株分别表达hPif1(表达hPif1蛋白的稳定转染株)，hPif1-Myc(表达带Myc标签hPif1蛋白的稳定转染株)，hPif1(K234A)(表达点突变hPif1蛋白的稳定转染株，第234位氨基酸由K(赖氨酸)突变为A(丙氨酸))，及其HT1080对照(没有做转染的原HT1080细胞株)，用识别hPif1蛋白N端的抗体进行免疫沉淀，识别hPif1蛋白C端的抗体进行Western鉴定，control为纯化的hPif1蛋白。
图9、人hPif1蛋白的亚细胞定位图10、人hPif1蛋白过表达使细胞端粒变短泳道1为1kb的分子量Marker，泳道2为0代HT1080细胞，泳道3为40代HT1080细胞，V代表0代空载体细胞，V40为40代空载体细胞，MO代表点突变hPif1的O代细胞，M10点突变hPif1的10代细胞……。S0为表达hPif1的0代细胞，S40表达hPif1的40代细胞。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook、Russell等人，分子克隆实验室手册III(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一人PIF1基因的克隆与鉴定发明人以前报导人PIF1蛋白质与酵母PIF1蛋白在438个氨基酸区域中有32％的同源性(Zhou，etc Science 2000)。从数据库中并没有搜索到人PIF1基因的全长克隆。但是发明人找到了果蝇的cDNA克隆基因。然后用果蝇的克隆基因在NCBI数据库过行比对，发明人找到了两个人的基因克隆AK026045和BC033254。这两个序列与酵母PIF1进行比对，N端有9％的同源性，C端有43％的等同性。另外这两个克隆片段都同时分布在人15号染色体上11Kb的范围内，暗示它们是人PIF1基因的两部分。因此，发明人设计两组引物，从Hek293的cDNA文库中进行PCR扩增，得到2.1Kb的片段。这两个独立克隆的测序结果显示，它们都在同一个阅读框架内。但有几个核苷酸差异，这可能是PCR差错。将克隆的序列进一步与基因组数据库和EST数据库比对，将这两片段拼接成人PIF1cDNA全长(SEQ ID NO1)图1。推出hPIF1编码641个氨基酸的蛋白质(SEQ ID N02)图2，其分子量为71KD，含有完整的解旋酶结构域。人PIF1蛋白的cNDA做成各种亚克隆载体，进行过表达。
实施例二制备针对人Pif1蛋白的四种多克隆抗体为检测hPIF1在蛋白水平上的表达，发明人做了一些多克隆抗体。分别是N端的(76aa-230aa)Ag0，中间的(309aa-435aa)Ag1，近C端(438aa-549aa)Hp43，C端(550aa-641aa)Ag2。四种多克隆抗体经鉴定特异性强而且效价高。并将这些抗体进行了亲和纯化。
将四个肽段对应的的基因克隆到pGEX(AmerPharmarcial Co)原核表达载体中，转染到B121菌株进行表达，利用GST凝胶珠进行亲和纯化，透析后免疫兔子取300μg纯化的GST-hPif1(O、1、2、43)融合蛋白，溶解于0.5mL PBS中，加入等体积的弗氏完全佐剂(Sigma Co)，充分混匀，皮内多点注射于2.0kg雌性新西兰大白兔背部。两星期后，再次以同样蛋白量用弗氏完全佐剂充分混匀后，皮内多点注射于背部。第28天，以同样蛋白量用弗氏不完全佐剂混匀后，背部皮内注射以加强免疫。在此一周后，颈动脉放血收集血液，37℃放置1小时，4℃放置过夜以使血清完全析出，离心收集血清，分装，-70℃保存。抗体的特异性检测方法如下将2μg GST-hPif1(0、1、2、43)质粒用8μ1 Lipofectamine 2000(GIBCOL BRL公司产品)混合后转染在35mm的细胞培养皿中培养的293细胞。转染方法见GIBCOL BRL公司提供的实验操作规程(将pc-DNA3.1B(-)mycHis[Invitrogen.Co]载体中克隆hPIF1及hPIF1(K234A)，利用脂质体Lipofectamine2000[Invitrogen.Co]把基因转染到hek293细胞48小时)。48小时后收集细胞，用300μl Triton X-100裂解液(10mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，10mM EDTA，10mM EGTA，1％Triton X-100，1mM PMSF，10mM DTT，5mg/ml aprotinin)裂解。取出50μl裂解物加入等量2×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10分钟，细针头剪切DNA，离心去沉淀。取10μl上样于10％SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶，进行蛋白电泳。电泳结束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司产品)。用抗hPif1的各段对应的抗血清1∶5000稀释进行免疫印迹，再用辣根过氧化物酶(HRP)交联的二抗(Santa Cruz公司产品)进行杂交。最后用化学发光试剂检测，压X光片30秒。
结果见图4，在转染了hPif1的细胞中，检测到专一性的蛋白条带，而在转染了空载体的细胞中，没有检测到蛋白带，这说明得到了专一识别hPif1蛋白的多克隆抗体。
实施例三人PIF1蛋白编码5’-3’的DNA解旋酶既然人PIF1蛋白与酵母的PIF1蛋白有明显的序列同源性，并含有7个解旋酶结构域[图3]，发明人想证明，它是一个DNA解旋酶。hPIF1基因的编码序列同时克隆到细菌、酵母和杆状病毒表达载体。在所有的三个表达载体中，发明人都检测到重组PIF1蛋白质的过表达，但是，发明人仅在酵母表达系统中纯化到hPIF1蛋白。将hPIF1的cDNA克隆酵母表达载体pEG(KT)，[此系统表达过重组的Rrm3p和Pfh1p(Zhou et，al 2003，Teng et，al2003)]，做成pEG(KT)-hPIF1，将此质粒转化到酵母菌株BCY123，如图所示，在半乳糖诱导下，hPif1-GST融合蛋白得到了表达。融合蛋白用GST凝胶珠亲合纯化到。图5a因为解旋酶是以ATP为能量的，发明人用ATP酶活检测重组蛋白hPif1-GST。如图所示，重组的hPif1-GST蛋白具有ATP酶活性，并且这种活性是依赖镁离子的图5b。为进一步分析解旋酶活性，发明人用36mer和25mer的寡核苷酸序列分别在3‘和5’与线状单链M13 DNA匹配。如果重组蛋白有解旋酶活性，它就会在DNA上运动，并至少解下其中一条寡核苷酸链。既然PIF1是从5‘向3’解旋，所以解离下36mer的寡核苷酸链。发明人的结论是，像酵母PIF1一样，人的Pif1有5‘到3’的解旋酶活性。图5c实施例四 检测人PIF1基因在端粒酶阳性细胞株和端粒酶阴性细胞中的表达从数据库搜索，发明人发现hPIF1的mRNA仅仅在人的某些正常组织中表达(Deloukas et al.，1998，science)，但是，据报导的克隆只与发明人的克隆到的基因的N端或是C端匹配，并不清楚PIP1是哪种剪切形式？发明人用12种细胞株，它们分别来自于人的不同组织，例如Wr168，HT1080，HepG2，Hek293，ECV304，Changliver，Be17404，AGS，A431，MRC5，以及HLF1，在mRNA水平上分析PIF1基因的表达，Northern结果显示，PIF1基因在Wr168，HT1080，HepG2，Hek293，ECV304，Changliver，Bel7404，AGS，A431里有表达，而这些细胞都是端粒酶阳性的。但PIF1的表达在MRC5和HLF1并未检测到，这两个细胞都是端粒酶阴性细胞图6。为进一步探知hPIF1基因的表达与端粒酶活性之间的关系，发明人检测PIF1在不同组织的表达谱(clontech)。不幸的是，发明人并没有检测到人PIF1在这些组织中的表达。(所有细胞均来自中科院细胞库，上海市岳阳路320号)在端粒酶阳性的细胞株中有约2.5kb的转录本广泛表达，12种细胞株Wr168，HT1080，HepG2，Hepl，Hek293，ECV304，Changliver，Bel7404，AGS，A431，MRC5，HLF1每种两盘(10厘米培养皿)，用Trizol(Invitrogen Inc)抽提，各个细胞株的的总RNA约300ug过0lgotex柱，每条Lane加入mRNA10ug，在1％甲醛变性胶电泳，分别用hPIF1的5‘端(225-691n’t)，中段(671-1305nt)，3’端(1335-1926nt)三部分探针分别进行Northern分析。都在端粒酶阳性的细胞株中看到有2.5kb的带出现。在HLF1，MRC5中没有观察到条带的出现。内参用B-ACTIN显示mRNA的上样量，对照为hPif1在Hek293瞬时表达的总RNA。
为检测hPIF1在蛋白水平上的表达，发明人利用了做的多克隆抗体进行免疫印记实验。将Wr168 MRC5细胞长满10-厘米培养皿，用冷的1×PBS洗涤，加入0.5％NP40裂解缓冲液1毫升，裂解半小时离心，在上清中加入5ul识别hPif1的N端抗体，然后加入protein A beads孵育1小时，免疫沉淀物30ul中取10ul进行SDS-PAGE电泳，在利用识别hPif1的C端抗体进行Western鉴定，对照为71kd的纯化的hPif1蛋白。
Western结果显示在Northern检测到这些组织里，发明人并未检测到蛋白水平的Pif1蛋白，表明hPif1的表达量是很低的。
发明人将亲和纯化抗体在Wr168，HT1080，HepG2，Hek293，ECV304，Changliver，Be17404，AGS，A431，MRC5，以及HLF1的抽提物中进行免疫沉淀，免疫沉淀物用Pif1抗体做Western鉴定。如图所示，hPif1的表达在Wr168细胞里可以检测到，但是在其它细胞中均未检测到。见图7，这表明，人Pif1蛋白的表达量相当有限。
实施例五细胞中Pif1蛋白水平受泛素系统调控既然在大多数细胞中hPif1蛋白的表达量少到难以用Western检测，通过检测内源性的hPif1蛋白来阐明hPif1的细胞功能是非常困难的。发明人利用hPIF1转染的稳定株来解决这个问题(在CMV强启动异源过表达人Pif1蛋白)。将稳定株分别表达hPif1，hPif1-Myc，hPif1(K234A)，及其HT1080对照，用识别hPif1蛋白N端的抗体进行免疫沉淀，识别hPif1蛋白C端的抗体进行Western鉴定，对照为纯化的hPif1蛋白。
Northern结果显示，外源性hPif1的表达远远高于内源性的数十倍。但是，Western仍然检测不到相对分子量的特异条带，表明hPif1蛋白质的表达是转录后调控的。为了确定hPif1蛋白在稳定株中的过表达，发明人在稳定表达株中对hPif1蛋白进行了免疫沉淀，检测到免疫沉淀的Pif1蛋白，未转染细胞中没有检测到，证明外源性的hPif1是过表达的图8。尽管表达量还是相当低，既然发明人以前的结果表明hPif1的低表达是由于转录后调控，一种可能性是hPif1蛋白受泛素调控。为验证此假说，发明人用MG132处理细胞(泛素降解途径中26S蛋白酶复合体的特异抑制剂)(SigmaCo)，发明人用亲和纯化的抗体检测到hPif1片段的积累。
实施例六在体内和体外，hPif1蛋白与端粒DNA结合人Pif1蛋白除了解旋酶活性外，发明人在N端发现了潜在的核定位信号。为确定其亚定位，发明人将hPIF1的GFP融合基因载体转染HT1080细胞，在hPIF1基因的N端或C端融合GFP，发现些融合蛋白定位在细胞核内图9。
将hPif1蛋白的C端或N端用GFP标记的质粒，用Lipofectin2000(Invitrigen Inc)介导转染HT1080细胞，转染48小时后，用4％多聚甲醛固定后，细胞经tritonX100通透后，DAPI染色，用DAPCO封片后，在荧光显微镜观察。第一列，DAPI染核的位置；第二列，GFP-hPif1融合蛋白的位置；第三列，DAPI染核和融合蛋白的重叠图像；第四列，光镜下细胞的形状。
如果hPIF1基因影响端粒的复制，那么它就有可能与端粒DNA直接相互作用。发明人利用凝胶阻滞实验检测hPif1蛋白与端粒DNA的结合情况。
为检测hPif1蛋白在体内与端粒DNA的结合，发明人用染色质免疫沉淀实验(CHIP assay)，用特异抗体与沉淀染色质/蛋白复合体，用端粒DNA探针检测端粒DNA的存在情况(Hsu et al，1999)。
实施例七人Pif1蛋白质的过表达引起端粒缩短，并且此缩短是通过端粒酶途径的酵母Pif1的过表达引起酵母端粒的缩短，这样发明人想知道人Pif1是否会影响人的端粒。将HT1080稳定转染株分别表达hPif1、hPif1(K234A)、空载体对照及其HT1080对照，分别传代至40代。抽提DNA被内切酶AfaI和HinfI消化，每条泳道上样4ug电泳，进行Southern blot。建立稳定表达株后就马上进行端粒长度的检测，比较不同世代端粒的长短，并与未转染的细胞株，转染空载体的，及转染点突变hPif1(将ATP结合区的关键氨基酸Lys突变成Ala)的稳定株进行比较。端粒长短的变化与hPif1的过表达相关，但是与点突变的hPif1不相关，表明，hPIF1基因抑制端粒的加长，并且这种抑制是依赖于解旋酶活性的。发明人追踪了端粒长度有变化的几个克隆端粒的变化情况，结果端粒长度在80代内没有进一步缩短，尽管人Pif1蛋白一直在稳定表达图10。
因为发明人没有看到传代细胞端粒的持续缩短，发明人的解释是，一定量的Pif1蛋白只能在一定程度上抑制端粒酶的活性。因此发明人采用tet-off系统进行外源PIF1的过表达。在培液中增加doxycycline(Chemicon Co)，如图所示。12小时去除dox，Pif1诱导表达，24小时达到峰值。如果Pif1的表达是受控的话，重新加入dox，hPIF1基因就会被关闭。人为控制hPIF1表达的上调与下调，分析细胞端粒的长短。Pif1诱导表达端粒逐渐变短，去除hPif1端粒变长。有趣的是，hPif1表达24小时，端粒长短并没有明显变化，表明hPif1影响端粒的加长是受细胞周期调控的。
在多数真核生物中，端粒的维持是受端粒酶调控或不依赖于端粒酶的重组机制。发明人想知道hPIF1影响端粒是否通过端粒酶。发明人在端粒酶阴性细胞中转染hPIF1基因并筛选到稳定株，稳定株端粒长短。既然端粒长度没有变化，发明人得出的结论是Pif1抑制端粒是依赖于端粒酶的。共转TERT和hPIF1，可以抑制端粒酶阴性细胞的端粒加长。这些实验都证明，hPif1抑制端粒酶活性是依赖于Pif1蛋白质的解旋酶活性的。因为突变的hPif1对端粒长短没有作用。
讨论Pif1影响端粒酶活性端粒长度的维持通�？梢苑从吵龆肆Ｃ富钚�。因为酵母Pif1蛋白抑制端粒加长是通过端粒酶途径的，有可能酵母的Pif1蛋白通过学习解开RNA/DNA双链结构，从而直接抑制了端粒酶活性，因此，进一步探知人Pif1在体外对端粒酶的抑制作用是相当重要的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>一种人Pif1基因、其编码蛋白及其应用<130>040401<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2052<212>DNA<213>Pif1<220>
<221>CDS<222>(1)..(1923)<223>
<400>1atg ctc tcg ggc ata gag gcg gcg gca ggg gaa tat gag gac tcg gag48Met Leu Ser Gly Ile Glu Ala Ala Ala Gly Glu Tyr Glu Asp Ser Glu1 510 15ctg cgg tgc cgc gtg gct gtg gag gag ctg agc ccg ggc ggg cag ccg96Leu Arg Cys Arg Val Ala Val Glu Glu Leu Ser Pro Gly Gly Gln Pro20 25 30cga agg cgc cag gcc ctg cgc acc gcg gag ctg agc ctg ggt cgc aac144Arg Arg Arg Gln Ala Leu Arg Thr Ala Glu Leu Ser Leu Gly Arg Asn35 40 45gag cgc cgc gag ttg atg ctg cgg ctg caa gcg cca ggg ccc gcg ggg192Glu Arg Arg Glu Leu Met Leu Arg Leu Gln Ala Pro Gly Pro Ala Gly50 55 60
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Glu Glu Gln Ala Ala Val Leu Arg Ala Val Leu Lys Gly Gln Ser Ile210 215 220ttc ttc act ggg agt gca gga aca ggg aag tca tat ctg cta aag cga 720Phe Phe Thr Gly Ser Ala Gly Thr Gly Lys Ser Tyr Leu Leu Lys Arg225 230 235 240atc ctg ggc tca ctg ccc ccc aca ggc act gtg gcc act gcc agc act 768Ile Leu Gly Ser Leu Pro Pro Thr Gly Thr Val Ala Thr Ala Ser Thr245 250 255ggg gtg gca gcc tgc cac atc ggg ggc acc acc ctc cat gcc ttt gca 816Gly Val Ala Ala Cys His Ile Gly Gly Thr Thr Leu His Ala Phe Ala260 265 270ggc atc ggc tca ggc cag gct cct cta gcc cag tgt gtg gcc ctg gcc 864Gly Ile Gly Ser Gly Gln Ala Pro Leu Ala Gln Cys Val Ala Leu Ala275 280 285caa agg cca ggc gtg cgg cag ggc tgg ctg aac tgc cag cgg ttg gtc 912Gln Arg Pro Gly Val Arg Gln Gly Trp Leu Asn Cys Gln Arg Leu Val290 295 300att gac gag atc tca atg gtg gag gca gac ctg ttt gac aaa ctg gag 960Ile Asp Glu Ile Ser Met Val Glu Ala Asp Leu Phe Asp Lys Leu Glu305 310 315 320gcc gtg gcc aga gct gtc cgg cag cag aac aag cca ttc gga ggg atc 1008Ala Val Ala Arg Ala Val Arg Gln Gln Asn Lys Pro Phe Gly Gly Ile325 330 335cag ctc atc atc tgt ggg gac ttt ctg cag ctg cca cct gtg acc aag 1056Gln Leu Ile Ile Cys Gly Asp Phe Leu Gln Leu Pro Pro Val Thr Lys340 345 350ggc tcc cag ccc cca cgg ttc tgc ttc cag tcc aag agc tgg aag agg 1104Gly Ser Gln Pro Pro Arg Phe Cys Phe Gln Ser Lys Ser Trp Lys Arg355 360 365
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权利要求
1.一种分离的人Pif1蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有DNA解旋酶活性的由(a)衍生的多肽。
3.一种人Pif1多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
4.权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1923位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2052位的序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.一种具有人Pif1蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达人Pif1蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人Pif1蛋白活性的多肽。
8.一种能与权利要求1所述的人Pif1蛋白特异性结合的抗体。
9.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的Pif1蛋白、或权利要求3所述的多核苷酸，以及药学上可接受的载体。
10.一种筛选促进或抑制端粒DNA加长的化合物的方法，其特征在于，它包括步骤(1)将人Pif1基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达Pif1蛋白的细胞株(2)向步骤(1)中的表达Pif1蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测Pif1蛋白表达量的变化；抑制Pif1蛋白表达量增加的化合物就是促进端粒DNA加长的化合物，促进Pif1蛋白表达量增加的化合物就是抑制端粒DNA加长的化合物。
11.一种检测个体Pif1表达水平的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增人Pif1基因或转录本的引物，或者与人Pif1蛋白特异性结合的抗体。
全文摘要
本发明涉及一种人Pifl基因、其编码蛋白，及其检测个体Pifl表达水平等方面的用途。此外，本发明还涉及人Pifl蛋白的抗体、激动剂、检测试剂盒，以及含有上述物质的组合物。
文档编号G01N33/68GK1680438SQ20041004738
公开日2005年10月12日 申请日期2004年4月6日 优先权日2004年4月6日
发明者周金秋, 张登宏, 黄妤, 徐露霞 申请人:中国科学院上海生命科学研究院
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