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专利名称：隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体elisa检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供一种隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体ELISA检测方法及试剂盒，用于动物及人隐孢子虫感染血清抗体的检测，本发明还公开了上述ELISA试剂盒的制备方法，属于血清学检测技术领域。
背景技术：
隐孢子虫是普遍存在的胃肠道寄生性原虫，能引起人类与家畜的腹泻。含有隐孢子虫卵囊的人类、家畜、宠物和野生动物的粪便，直接威胁着人类饮用水安全，导致隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)。分子流行病学研究结果显示出大多数人隐孢子虫病是由人隐 ？包子虫禾口微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum, C. parvum genotype II)弓|起的。目前，还没有有效的方法治疗人的隐孢子虫感染。而现行的诊断方法直接镜检和染色镜检法费时、费力、检出率低；间接荧光抗体试验和PCR方法对仪器设备和试剂的要求较高，因此建立一种快速、特异性较高且可直接判定结果的诊断方法是十分必要的。隐抱子虫病毒(Cryptosporidium parvum virus, Cryspovirus, CSpV)是 1997 年Khramtsov在牛犊中分离出来的C. parvum卵囊中发现的，该病毒含有含长的dsRNA (L-dsRNA)和短的dsRNA(S-dsRNA)，其中S-dsRNA编码病毒衣壳蛋白。之后，Khramtsov 又发现所有C. hominis和C. parvum都含此dsRNA病毒，而Cryptosporidium其他种中不存在。因此可以把CSpV的分子特征和抗原特性作为检测C. hominis和C. parvum卵囊的一个依据。而该病毒衣壳蛋白基因S-dsRNA就可作为对人具有感染性的隐孢子虫(C. hominis 和C. parvum)与其它种类隐孢子虫鉴别的一个分子标记和含病毒虫株的分离和鉴定的依据。目前尚无利用抗隐孢子虫病毒检测感染动物血清中抗体的报道。

发明内容
本发明公开了一种隐孢子虫病毒衣壳蛋白血清中抗体ELISA检测试剂盒，解决了当前粪便检测灵敏度低、费时、费力的缺点，能检测感染人的隐孢子虫。本发明还提供了上述ELISA检测试剂盒的制备方法，利用在大肠杆菌E. coli BL2KDE3)表达的S-dsRNA蛋白作为抗原，建立了检测人的隐孢子虫感染血清中抗体的间接ELISA方法。本发明的隐孢子虫病毒衣壳蛋白血清中抗体ELISA检测方法，其特征在于抗原为隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白，用于检测血清中隐孢子虫病毒抗体。本发明的隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，组成包括隐孢子虫病毒标准阳性血清、隐孢子虫病毒标准阴性血清、酶标二抗、包被病毒衣壳蛋白的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、封闭液和酶标物稀释液及样品稀释液。上试剂盒的制备方法，其特征在于以隐孢子虫病毒衣壳蛋白为抗原包被于酶标板，隐孢子虫病毒蛋白标准阳性血清和标准阴性血清、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液、样品稀释液和封闭液，组成ELISA试剂盒。所述抗原为隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白。本发明ELISA试剂盒检测方法，包括以下步骤
(1)样品前处理将被检血清用样品稀释液1 200稀释；
(2)用本发明的ELISA试剂盒检测，向包被隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白的酶标板孔中加入封闭液，再加入血清，孵育60分钟，洗涤液洗涤，加入酶标二抗，孵育60分钟，洗涤液洗涤，加入显色液孵育10分钟，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值；
(3)分析检测结果
当0D490nm ^ 0. 32时，样品判定为阳性；当0D490nm < 0. 268时，样品判定为阴性。本发明的积极效果在于检测的样品为血清，检测特异性高、灵敏度高、稳定性好， 能检测人隐孢子虫的感染，适合于临床的快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。


图1为重组蛋白的纯化SDS-PAGE电泳图中M:低分子量蛋白标志物；1:纯化的重组蛋白；M :DL 2000 Marker ；lanel :the protein purfiecL
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。实施例1
隐孢子虫病毒衣壳蛋白CSpV表达 1材料和方法
1.1菌株隐孢子虫病毒CSpV衣壳蛋白表达菌pET48a(+)-S。隐孢子虫病毒CSpV衣壳蛋白的表达、纯化及复性
将CSpV衣壳蛋白阳性表达菌按1 %的比例接种于500 mL LB培养基中，37 °C振荡培养2 3 h，至菌液0D_nm值为0. 4 0. 6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4 h， 诱导表达结束后，收集菌液。按照Ni-NTA说明书进行目的蛋白的纯化。用含有8，6，4，2，0 mol/L尿素，0.5 mol/L L-Arg的PBS溶液进行梯度透析复性。用BCA蛋白含量分析试剂盒测定蛋白浓度。1.3鼠抗隐孢子虫阳性血清的制备
取纯化的2X107个微小隐孢子虫卵囊溶于PBS中，超声粉碎，期间间隔取样，直至显微镜下看不见卵囊为止，12 000 r/min离心20 min，上清即为抗原。用BCA蛋白含量分析试剂盒测定蛋白浓度。用该抗原腹腔免疫6只6、周龄的BALB/c小鼠(100 Pg/只)，按常规免疫程序制备阳性血清。结果
2. 1隐孢子虫病毒CSpV衣壳蛋白的纯化重组蛋白阳性表达菌经IPTG诱导表达后，用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的目的蛋白经SDS-PAGE分析，可见在37 ku处有一条单一的蛋白带，见附图1。实施例2
以重组蛋白为抗原建立检测人的隐孢子虫感染血清中抗体的间接ELISA方法 1材料和方法 1. 1、封闭剂的选择
用重组蛋白包被酶标板，4 0C过夜。以10 %胎牛血清、10 %正常兔血清、5 %脱脂奶粉为封闭剂，用PBST稀释，每孔加200 UL, 37。C孵育2 h。洗涤后封闭2 h，分别加阳性血清对照和阴性血清对照，37 0C孵育1 h。洗涤，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37 °C孵育1 h。洗涤后加入底物，观察颜色变化。显色后，用2 mol/L 终止反应。酶标仪测定OD49tlIim值。同时设阳性对照(P)、阴性对照(N)和空白对照，P/N > 2，判为阳性。选择封闭效果最佳者。1. 2抗原和一抗工作浓度的确定
用不同浓度1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 0125、0. 00 625 Pg/孔的重组蛋白包被酶标板，用不同稀释倍数1:200、1 :400、1:800、1:1 600,1:3 200的阳性血清孵育，进行间接ELISA，确
定抗原和一抗最佳工作浓度。1.3 HRP标记的羊抗鼠二抗工作浓度的确定
选择最佳封闭剂，抗原和一抗按最佳工作浓度稀释，将HRP标记羊抗鼠二抗稀释为不同浓度 1:500、1:1 000、1:2 000,1:4 000,1:8 000,1:16 000。加底物缓冲液显色，测定 OD49tlIim值，确定二抗最佳工作浓度。1. 4间接ELISA结果判定标准的确定
检测12份健康小鼠血清，测定OD49tlIim值，计算平均值T和标准差SD。结果
2.1微小隐孢子虫抗体检测ELISA方法的建立
根据测定的结果，选择最佳封闭液为5 %脱脂奶粉的PBST溶液，最佳抗原包被浓度 0. 25 μ g/孔、被检血清稀释度1 200，羊抗鼠二抗稀释倍数1:2 000为最佳检测条件。2.2间接ELISA结果判定标准的确定
经间接ELISA检测12份健康小鼠血清OD49tlIim值平均值T力0. 216，标准差SD为 0.026，因此阳性样品检出下限为I +3SD=0J94。为了减少假阳性和假阳性的出现，将临界值加减一个标准差作为可疑区间。因此当OD49tlIim ^ 0. 32时，样品判定为阳性；当0D49(1nm < 0. 268时，样品判定为阴性；当0. 268 ^ OD490Iim < 0. 32时，样品判定为阳性，但是需要重新检测。若重检时，OD49tlIim ^ 0.四4，样品判定为阳性；OD49tlIim < 0.四4，样品判定为阴性(见附表1)。
附表1间接ELISA结果判定标准的确定实施例3
检测人的隐孢子虫感染血清中抗体间接ELISA试剂盒组装
1、隐孢子虫病毒标准阳性血清、隐孢子虫病毒标准阴性血清
2、包被病毒重组蛋白酶标板
3、HRP标记的羊抗鼠二抗
4、底物显色液A液pH值为5.0的0. lmol/L醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0. 3%过氧化氢储备液。B液四甲基联苯胺，先制备成0. 2mg/mL溶液，用0. Imol/LpH值为5. 0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0. 2mg/L溶液。5.洗涤液pH值为7. 4的0. 1%吐温-20的PBST缓冲液。6.酶标物稀释液:pH值为7. 4的0. 01%吐温-20的PBST缓冲液。7.样品稀释液pH值为7. 4的0. 1%吐温-20的PBST缓冲液，。8.终止液2mol/L 硫酸。试验例1
间接ELISA方法性能测定 1材料和方法 1.1材料
鼠抗安氏隐孢子虫ip. mdersoni)阳性血清、鼠抗弓形虫ij. gondii)阳性血清、鼠抗蓝氏贾第虫(P-Iamblia)阳性血清、鼠抗鸡柔嫩艾美尔球虫広tenella)阳性血清均按常规方法制备。1. 2 方法
1.2.1敏感性试验将鼠抗Cparra 阳性血清按1:200、1 :400、1:800、1:1 600,1:3
200倍比稀释，应用已建立的间接ELISA，确定其敏感性。1. 2. 2特异性试验以鼠抗C. parvum阳性血清和阴性血清为对照，用已建立的间接ELISA方法测定鼠抗C. andersoni阳性血清、鼠抗T. gondii阳性血清鼠、抗Iamblia 阳性血清、鼠抗五tenella阳性血清，观察血清交叉反应情况，来确定反应的特异性。1. 2. 3重复性试验在同一块板内检测7份阳性血清样品，每份血清样品重复3 孔，按照间接ELISA的操作程序进行测定，计算每份血清样品OD49tlIim值的变异系数(CV)， 以检验批内被检测样品的重复性；另取3块用纯化重组蛋白包被好的酶标板，在相同条件下检测7份阳性血清样品，按照间接ELISA的操作程序进行测定，计算同一份血清样品在不同板间OD49tlIim值的变异系数(CV)，以检验批间被检测样品的重复性。附表2 ELISA检测的敏感性
权利要求
1.一种隐孢子虫病毒衣壳蛋白血清中抗体ELISA检测方法，其特征在于抗原为隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白，可检测血清中隐孢子虫病毒抗体。
2.一种隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，组成包括隐孢子虫病毒标准阳性血清、隐孢子虫病毒标准阴性血清、酶标二抗、包被病毒衣壳蛋白的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、封闭液和酶标物稀释液及样品稀释液。
3.如权利要求2所试剂盒的制备方法，其特征在于以隐孢子虫病毒衣壳蛋白为抗原包被于酶标板，隐孢子虫病毒蛋白标准阳性血清和标准阴性血清、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液、样品稀释液和封闭液，组成ELISA试剂盒。
4.权利要求3所述ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于所述抗原为隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白。
5.ELISA试剂盒检测方法，包括以下步骤(1)样品前处理将被检血清用样品稀释液1 200稀释；(2)用权利要求2所述的ELISA试剂盒检测，向包被隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白的酶标板孔中加入封闭液，再加入血清，孵育60分钟，洗涤液洗涤，加入酶标二抗，孵育60分钟，洗涤液洗涤，加入显色液孵育10分钟，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值；(3)分析检测结果当0D490nm ^ 0. 32时，样品判定为阳性；当0D490nm < 0. 268时，样品判定为阴性。
全文摘要
本发明提供一种隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体ELISA检测方法及试剂盒，用于动物及人隐孢子虫感染血清抗体的检测，以隐孢子虫病毒衣壳蛋白为抗原包被于酶标板，隐孢子虫病毒蛋白标准阳性血清和标准阴性血清、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液、样品稀释液和封闭液，组成ELISA试剂盒。本发明的积极效果在于检测的样品为血清，检测特异性高、灵敏度高、稳定性好，能检测人隐孢子虫的感染，适合于临床的快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。
文档编号G01N33/535GK102221619SQ20111015090
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者任文陟, 刁玉梅, 宫鹏涛, 张国才, 张楠, 张西臣, 李建华, 李淑红, 李 赫, 杨举, 高华义 申请人:吉林大学