专利名称：化学发光底物溶液和含其的试剂盒及应用其的检测方法
技术领域：
本发明涉及蛋白的免疫检测，特别是一种用于蛋白免疫检测的化学发光底物溶液，和含有所述溶液的蛋白质定量测定试剂盒以及应用所述溶液或试剂盒的蛋白检测方法。
背景技术：
卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率为第三位，仅次于子宫颈癌和子宫体癌，但死亡率却居首位，因卵巢位于盆腔深部不易扪及，患者出现临床症状就诊时多数已是晚期，其五年生存率徘徊于25-30%之间。而早期卵巢癌患者5年生存率可达90%，因此，提高卵巢癌的早期诊断水平对于早期治疗、延长患者生存期具有重要意义。血清肿瘤标志物检测简便且创伤�。蚨谥琢錾覆�、诊断、治疗等方面广泛应 用。目前CA125是临床上最常用的肿瘤标记物，但由于CA125在生理期和一些盆腔良性病变中也有升高，限制了它的应用。因此，需要一种更加灵敏和特异的肿瘤标记物来提高卵巢癌的早期诊断水平。人附睾蛋白4(HE4)基因最初是在人附睾远端上皮细胞中发现的，并认为HE4是WFDC2基因的编码产物，其为弱酸性小分子分泌蛋白，是乳酸蛋白(WAP)结构域家族中的一员。WAP结构域是由近50个氨基酸组成的保守序列和由8个半胱氨酸为特点的4个二硫键核心区组成，其编码产物为具有各种不同功能的小分子分泌性蛋白，分子量为llKDa，远小于CA125，这可能是在卵巢癌早期HE4比CA125更容易分泌进入外周血的主要原因。HE4在正常卵巢组织及良性肿瘤中含量极低，但在卵巢癌中含量较高，因此，血清HE4含量的测定将有助于卵巢癌的早期诊断及治疗效果的监测，联合CA125可提高卵巢癌诊断的敏感度和特异性。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。但是，化学发光方法因其所用发光底物溶液稳定性差、光子强度平台期段、信噪比高等缺点，其应用受到很大的局限。本发明提供了一种新的可用于蛋白免疫检测的化学发光底物溶液，其具有稳定性好、灵敏度高、光子强度平台期长等优点。同时，本发明还提供了含有所述溶液的蛋白定量测定试剂盒。
发明内容
本发明第一方面提供了一种化学发光底物溶液，其包括发光液A和发光液B,其中发光液A含有0. 3-lg/l鲁米诺或异鲁米诺、O. 01-0. lg/1 4-碘苯酚、O. 01-0. lg/11，2-环己二胺四乙酸、4-8g/l硼酸、8-llg/l硼砂、10 — 12g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为 8. 0—10. O ;发光液 B 含有0. 01—0. 05g/l 过氧化脲、O. 5—2ml/l Tween20、4一8g/l硼酸、8 — llg/1硼砂、10 — 12g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. O —10. O。其中所述的发光液A和发光液B等量混合使用。本发明第二方面提供了一种HE4化学发光定量测定试剂盒,其含有本发明第一方面所述的化学发光底物溶液。本发明的试剂盒还可以含有酶标记的HE4第一单克隆抗体、HE4第二单克隆抗体包被的固相载体、HE4校准品和洗涤液，其中所述的HE4第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别与HE4蛋白的不同抗原表位结合，所述的酶能够与所述的化学发光底物溶液中的鲁米诺或异鲁米诺反应产生光信号。
本发明第三方面提供了一种HE4蛋白含量测定的方法，其包括如下步骤1)将待测样品和HE4校准品分别与酶标记的HE4第一单克隆抗体混合，然后与HE4第二单克隆抗体包被的固相载体接触，使其发生抗原抗体结合反应；2)用洗涤液洗去游离的HE4蛋白和酶标记的HE4第一单克隆抗体；3)将发光液A和发光液B等量混合后加入前述的反应体系中，使发光底物溶液中的底物与所述的酶发生反应；4)用化学发光仪分别检测固相载体上结合的待测样品和校准品对应的发光值；5)将待测样品的测定值与校准品确定的标准曲线比较，确定待测样品中的HE4含量。
图I是本发明试剂盒标准曲线，以校准品浓度为横坐标，发光值(RLU)为纵坐标绘出的标准曲线。
具体实施例方式本发明第一方面提供了一种新的化学发光底物溶液，其包括发光液A和发光液B,其中发光液A含有0. 3 — lg/Ι鲁米诺或异鲁米诺、O. 01—O. lg/1 4-碘苯酚、O. 01—O. Ig/I I, 2-环己二胺四乙酸、4一8g/l硼酸、8 — llg/1硼砂、10 — 12g/l氯化钠，余量为纯化水，其 pH 值为 8. O—10.0 ;发光液 B 含有:0. 01—O. 05g/l 过氧化脲、O. 5 — 2ml/l Tween20、4一8g/l硼酸、8— I lg/1硼砂、10 — 12g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. 0—10. O。其中所述的发光液A和发光液B等量混合使用。在一个优选的实施方案中，所述的发光液A含有O. 41g/l鲁米诺、O. 10g/l 4_碘苯酚、O. 12g/l 1,2-环己二胺四乙酸、4. 95g/l硼酸、11.44g/l硼砂、11.6g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. 7。在一个优选的实施方案中，所述的发光液B含有0.23g/l过氧化脲、lml/1Tween20、4. 95g/l硼酸、11. 44g/l硼砂、11. 6g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. 7。本发明第二方面提供了一种HE4化学发光定量测定试剂盒,其含有本发明第一方面所述的化学发光底物溶液。本发明的试剂盒还可以含有酶标记的HE4第一单克隆抗体、HE4的第二单克隆抗体包被的固相载体、HE4校准品和洗涤液，其中所述的HE4第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别与HE4蛋白的不同抗原表位结合，所述的酶能够与所述的化学发光底物溶液中的鲁米诺或异鲁米诺反应产生光信号。在一些实施方案中，所述的酶包括但不限于碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶。在一个优选的实施方案中，所述的酶为辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，所述的固相载体包括但不限于微孔板、塑料珠、塑料管、或磁性颗粒。在一个优选的实施方案中，所述的载体为48或96孔的微孔板。在一些实施方案中，所述HE4校准品是以组分V的牛血清白蛋白缓冲液为溶剂，加入HE4蛋白纯品(纯度不低于90%)配制而成。在一个优选的实施方案中，所述的HE4校准品是配成的具有多于I个浓度的浓度梯度的HE4校准品。在一些实施方案中，所述的洗涤液为浓缩洗涤液。在一个优选的实施方案中，所述的浓缩洗涤液为20 X PBS。
本发明第三方面提供了一种HE4蛋白含量测定的方法，其包括如下步骤1)将待测样品和HE4校准品分别与酶标记的HE4第一单克隆抗体混合，然后与HE4第二单克隆抗体包被的固相载体接触，使其发生抗原抗体结合反应；2)用洗涤液洗去游离的HE4蛋白和酶标记的HE4第一单克隆抗体；3)将发光液A和发光液B等量混合后加入前述的反应体系中，使发光底物溶液中的底物与所述的酶发生反应；4)用化学发光仪分别检测固相载体上结合的待测样品和校准品对应的发光值；5)将待测样品的测定值与校准品确定的标准曲线比较，确定待测样品中的HE4含量。在一些实施方案中，所述的酶为碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶、所述的底物为鲁米诺或异鲁米诺。在一个优选的实施方案中，所述的酶为辣根过氧化物酶、所述的底物为鲁米诺。提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明，所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。实施例I化学发光底物溶液制备本发明化学发光底物溶液的制备步骤如下(I)称量O. 41g鲁米诺、O. IOg 4_碘苯酚、0.12g 1，2_环己二胺四乙酸、4. 95g硼酸、11. 44g硼砂、11. 6g氯化钠，将上述试剂放入洁净容器中，加纯化水溶解，调节pH值至
8.7，定容至1000ml，制成发光液A，然后用8. Oml规格塑料瓶按3. Oml/瓶分装，置于2—8 °C保存。(2)称量O. 23g过氧化脲、Iml Tween20、4. 95g硼酸、11. 44g硼砂、11. 6g氯化钠,将上述试剂放入洁净容器中，加纯化水溶解，调节pH值至8. 7，定容至IOOOml制成发光液B。然后用8. Oml规格塑料瓶按3. Oml/瓶分装，置于2 — 8°C保存。实施例2辣根过氧化物酶标记的HE4第一单克隆抗体的制备用过碘酸钠氧化法标记HE4第一单克隆抗体。标记过程如下(I)称取5mg HRP溶解于I. Oml蒸馏水中。(2)于上述溶液中加入O. 2ml新配的O. IM NaI04溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，用ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜。(4)加入20 μ I O. 2Μ ρΗ9· 5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9. O—
9.5，然后立即加入IOmg HE4第一单克隆抗体至ImlO. OlM碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加入O. Iml新配制的4mg/ml NaBH4溶液，混勻，置于4°C 2小时。(6)将上述溶液装入透析袋中，用O. 15M pH7. 4PBS透析，4°C过夜。(7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次，最后沉淀物溶于 Iml O. 15M ρΗ7· 4 的 PBS 中。(8)将上述溶液装入透析袋中，用O. 15Μ ΡΗ7. 4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测铵离子)，10, OOOrpm离心30分钟去除沉淀，上清液加入等量丙三醇充分混匀即为酶标记物(HE4-HRP )，分装后，-20 °C保存。实施例3 ΗΕ4校准品制备(I)将 O. 2g/l Na H2PO4 · 2Η20、2· 9g/l Na2HPO4 · 12H20、9g/l NaClU0g/l 牛血清白蛋白、lg/1海藻糖、lml/1 Proclin 300,用纯化水溶解,配制成校准品稀释液。(2)将HE4校准品纯品用校准品稀释液配制成六个浓度点0pmol/ml (SO)、50pmol/ml(SI)、100pmol/ml(S2)、250pmol/ml(S3)、500pmol/ml(S4)、lOOOpmol/ml (S5)。(3)用2ml规格的管式玻璃瓶分装校准品，分装量为0. 5ml/瓶。(4)将管式玻璃瓶压盖。按每套6个浓度点，每个浓度点一瓶的规格整理成套，置于2 —8°C保存。实施例4固相包被板制备(I)用 0. 2g/l NaH2PO4 ·2Η20、2· 9g/l Na2HPO4 · 12H20、9g/lNaCl，用纯化水溶解，配制成磷酸盐缓冲液(PH7. 4)，即为包被缓冲液。(2)将HE4第二单克隆抗体用包被缓冲液配制成浓度2. 5 μ g/ml溶液，即为包被液。(3)用纯化水配制生理盐水(0. 9%NaCl),即为包被板洗涤液。(4)用 0. 2g/l NaH2PO4 ·2Η20、2· 9g/l Na2HPO4.2H20、10g/l BSA 和 lml/1 Proclin300,5. 0g/l蔗糖、10g/l明胶，用纯化水溶解，配制成封闭液，pH值为7. 0—7. 5。(5)将包被液按100 μ I/孔加入发光板的孔中，震荡后静置于2—8°C过夜以包被发光板。(6)用包被板洗涤液将其洗涤3次，每次300 μ I/孔。(7)将封闭液按250 μ I/孔加入发光板中，于18—26°C静置3小时,然后甩去包被板孔中封闭液，并将所述的包被板置于干燥车间内晾干。(8)用铝箔进行真空包装，置于2 — 8°C保存。实施例5酶结合物制备酶结合物制备步骤如下(I)用 0. 2g/l NaH2PO4 · 2Η20、2· 9g/l Na2HPO4 · 2H20、10g/lBSA、10g/l 酪蛋白、3g/I氨基吡啉和lml/1 Proclin 300，用纯化水溶解，配制成酶稀释液，pH值为7. 0—7. 5 ；(2)按I :9000 (V/V)的比例向酶稀释液中加入酶标记物(HE4-HRP)，配制成酶结合物；(3)用IOml规格塑料瓶按6ml/瓶分装所述的酶结合物，置于2 — 8°C保存。实施例6浓缩洗涤液制备用4g/l 磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20)、58g/l 磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20)、180g/l氯化钠(NaCl)，用纯化水溶解，配制成浓缩洗涤液，用30ml规格塑料瓶按30ml/瓶分装，置于2 —8°C保存。实施例7本发明试剂盒的检测准确度本发明人进行了 1000例血清样本的临床试验研究，样本来源为辽宁省本溪市金山医院，其中310例血清样本经取样医院鉴定为阳性，另外690例鉴定为阴性，检验本发明的人附睾蛋白4 (HE4)定量测定试剂盒(以下称为“本发明试剂盒”)的检测准确度，以FujirebioDiagnostics AB公司的人附睾蛋白4(HE4)检测试剂盒(药监局注册文号国食药监械(进)字2009第3402246号)(以下称为“对照试剂盒”)作为对照，试验采用盲法。(2)试验步骤自2— 8°C取出试剂，室温平衡不少于15分钟，液体组分混匀；按下表I进行加样和操作。表I.试验样品及操作步骤
抗体包被板空白孔标准孔样品孔
醇结合物—Si ftl50 μ
M 5ft RH_—CA ,.I_
ftp OU ijJ~~~JV |A1~~~
用微量震荡器充分振荡混匀，3rc温育I小时。甩去反应液,用稀释后的洗涤液(IxPBS)洗板S次，最后扣在千净的吸水纸上睡干》
化学发光底物溶液50 μ!50 μΙ50 pi
用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(Ι8 — 2fTC)避光反应3分钟,_
M 量必须于加入化学发光底物溶液后的第3—丨O分钟内测量，用BHP9SM型微孔板化学复光微(购自北京滨松光子技术股翁 眼公司)像序_量各孔的发光值(BLU),
测量时间I秒/孔._*:加入发光底物溶液前应保证吸干微孔中的残留物。发光底物溶液A和B用前等体积混匀后每孔加50 μ 1，于室温(18°C—250C )测量。(3)试验结果试验结果见表2和表3。表2为本发明试剂盒和对照试剂盒分别对所述1000例血清样本进行检测的结果；表3为根据表2计算的本发明试剂盒与对照试剂盒检测结果的符合率。表2 :本发明与对照试剂盒检测结果病例数__对照^!盒__合计
___W性W性__
本发明 W性__31§__§__310
试剂盒調性O690690
___Mt__69 __IOflO表3 :本发明试剂盒与对照试剂盒检测结果符合率
阳性符合率％ 阴性符合率％ 总符合率％
100% 100% 100%
结果表明本发明试剂盒与对照试剂盒检测结果的阳性符合率为100%，阴性符合率为100%。临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力，临床灵敏度是将实际有病的人正确地判定为阳性的比例；临床特异性是衡量试验正确地判定无病者的能力，临床特异性是将实际无病的人正确地判定为阴性的比例(见如下公式及表4)。临床灵敏度=a/(a+c);临床特异性=d/ (b+d)；
_表4评价诊断试验性能归纳表_
疾病状态·
--- 合计
有病无病
谖验阳性iba+b
~鐵驗_性
- -
合计霾+cb+ia+b+c+d本发明试剂盒卵巢癌的临床灵敏度为79. 0%，临床特异性为95. 5% ;对照试剂盒卵巢癌的临床灵敏度为75. 0%，临床特异性为85. 5%。见表5。表5本发明试剂盒与对照试剂盒对卵巢癌检测结果比较
盒临床灵敏度(%) 临床特异性(%^~
本发明试剂盒 79. O__9^5_
~对照试剂盒I 75.0 85.5上述结果表明，本发明的试剂盒具有良好的检测准确性，这与对照试剂盒非常接近。但是，本发明试剂盒具有生产成本低、临床灵敏度高、临床特异性好的优势，所以具有很好的应用前景。实施例8本发明试剂盒检测的精确度按照实施例7所述的方法，对不同浓度的HE4校准品进行3次重复测定，然后用双对数log (X) -log (Y)模型进行拟合。结果发现，在50pmol/ml到1000pmol/ml浓度范围内，剂量-反应曲线相关系数(r)不低于0.9900 (见表6及图I)。表6发光值与HE4浓度的相关性
^xXAAfpnwiZiiiiI
IJ5*I禱25i500 I(MM)r
批次^~~~~__
20120306__571206615277J974611SJJ66 3783860.9982
20120322 605W3396379393339196251 353 4<1.9971
20120413__5S321520| S3691109244186883 3778800.9992结果显示本发明试剂盒检测发光值(RLU)与校准品的浓度具有很好的相关性。
按照实施例7所述的方法，平行测定10孔零校准品(Opmol/ml)的相对发光强度，计算相对发光强度的平均值(Mean)和标准差(SD)，利用剂量一反应曲线计算出相对发光强度为Mean+2X SD时的浓度值为最低检出限用三个批次的试剂各进行十次重复试验，结果发现本发明试剂盒本底检出值小于20pmol/ml (见表7)。表7本底定量检测试验
权利要求
1.一种化学发光底物溶液,其包括发光液A和发光液B,其特征在于 所述的发光液A含有O. 3-lg/l鲁米诺或异鲁米诺、O. 01-0. lg/1 4-碘苯酚、0.01-0. lg/1 1，2-环己二胺四乙酸、4-8g/l硼酸、8-llg/l硼砂、10_12g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. 0-10.0 ； 所述的发光液B含有O. 01-0. 05g/l过氧化脲、O. 5-2ml/l Tween20、4-8g/l硼酸、8-llg/l硼砂、10 — 12g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. 0-10. O。
其中所述的发光液A和发光液B等量混合使用。
2.权利要求I所述的溶液，其特征在于所述的发光液A含有O.41g/l鲁米诺、O. IOg/I 4-碘苯酹、O. 12g/l I, 2-环己二胺四乙酸、4. 95g/l硼酸、11. 44g/l硼砂、11. 6g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. 7。
3.权利要求I所述的溶液，其特征在于所述的发光液B含有O.23g/l过氧化脲、Iml/I Tween20、4. 95g/l硼酸、11. 44g/l硼砂、11. 6g/l氯化钠，余量为纯化水，其pH值为8. 7。
4.一种人附睾蛋白4 (HE4)化学发光定量测定试剂盒，其含有权利要求I到3中任一项所述的化学发光底物溶液。
5.权利要求4所述的试剂盒，其还含有酶标记的HE4第一单克隆抗体、HE4第二单克隆抗体包被的固相载体、HE4校准品和洗涤液，其中所述的酶能够与所述的化学发光底物溶液中的鲁米诺或异鲁米诺反应产生光信号，所述的HE4第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别与HE4蛋白的不同抗原表位结合，所述的洗涤液优选为20 XPBS浓缩洗涤液。
6.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的酶是碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶。
7.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的固相载体是微孔板、塑料珠、塑料管和/或磁性颗粒，其优选为48或96孔的微孔板。
8.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的HE4校准品是以组分V的牛血清白蛋白缓冲液为溶剂，加入HE4蛋白纯品(纯度不低于90%)配制成具有多于一个浓度的浓度梯度的HE4校准品。
9.一种HE4蛋白含量的测定方法，其包括如下步骤 I)将待测样品和HE4校准品分别与酶标记的HE4第一单克隆抗体混合，然后与HE4第二单克隆抗体包被的固相载体接触，使其发生抗原抗体结合反应；2)用洗涤液洗去游离的HE4蛋白和酶标记的HE4第一单克隆抗体；3)将发光液A和发光液B等量混合后加入前述的反应体系中，使发光底物溶液中的底物与所述的酶发生反应；4)用化学发光仪分别检测固相载体上结合的待测样品和校准品对应的发光值；5)将待测样品的测定值与校准品确定的标准曲线比较，确定待测样品中的HE4含量。
10.权利要求9所述的方法，其中所述的酶为碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶、所述的底物为鲁米诺或异鲁米诺。
全文摘要
本发明涉及蛋白的免疫检测，特别是一种用于蛋白免疫检测的化学发光底物溶液，以及含有所述溶液的蛋白质定量测定试剂盒和应用所述溶液或试剂盒的蛋白检测方法。
文档编号G01N21/76GK102890083SQ201210369389
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者刘巨波, 吕鹏辉, 张颖 申请人:辽宁科骏生物有限公司
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