专利名称：环保无氰型溶血剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种全自动血细胞分析仪用的溶血剂。
背景技术：
血液细胞分析技术从上世纪七、八十年代至本世纪初已得到迅速应用和普及。血细胞分析仪按白细胞的异质性分为二分群、三分群和五分群分析仪。白细胞的自动分类和血红蛋白仪器测定靠溶血剂按一定组份及其配伍来实现。溶血剂的分析原理是按“国际血液标准化委员会”(ICSH)推行的氰化高铁血红蛋白法而设计的标准方法。由于标准的氰化高铁血红蛋白法溶血剂中含有氰化物，对人员(尤其是操作人员)、仪器及环境均够成污染，排出的废液需特殊处理。在医院日常工作中，因血液分析工作量大，大多医疗机构难以达到剧毒药品的管理要求。发明一种理化及生物学指标与氰化高铁血红蛋白法相同的无氰、环保型溶血剂，并应用于临床血液细胞分析工作变得十分必要。CN1069576A公开了一种溶血剂的配置方法，它是先配缓冲液，在一量筒中，称磷酸二氢钾4.6克，加蒸馏水500毫升，pH值5.5，取30毫升备用。在另一量筒中，称磷酸氢二钠9.5克，加蒸馏水1000毫升，溶解后，取出30毫升不用，pH值控制在8.5，将两个量筒溶液混合，pH值8.5，称十六烷基三甲基溴化铵7.5克、乙二胺四乙酸二钠20克、草酸铵20克将上述缓冲液加至1000毫升，加热溶解后再加冰乙酸25毫升，用过滤纸过滤，滤液pH值5.5至5.8之间。此溶血剂的配制方法较复杂。CN1308235A公开了一种血液分析用无毒溶血剂，是在1升重蒸馏水溶剂中，分别加入有机季胺盐4-120g、羟胺盐1-40g及弱碱性缓冲剂10-100g，组成pH值为7-10的混合液，此技术未在实际中得到应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术之不足，提供一种环保无氰型溶血剂，它适合多种三分群血液分析仪使用，其性能等同和优于氰化高铁血红蛋白法溶血剂，相对于无氰溶血剂其性能得以改善，而且对仪器无损伤，对人体、环境无任何毒害，排出废液不需无害化处理，能在临床广泛应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种环保无氰型溶血剂，其技术方案是所述的溶血剂是由缓冲液和贮存液混合制成溶血剂的应用液，其中，缓冲液组分为磷酸氢二钠、柠檬酸、水，各组分的配比为磷酸氢二钠13.00～17.00g/L，柠檬酸2.00～5.00g/L，水为余量；贮存液组分为十二烷基三甲基氯化铵、磷酸氢二钠、柠檬酸、水，各组分的配比为十二烷基三甲基氯化铵90.00～110.00g/L，磷酸氢二钠13.00～17.00g/L，柠檬酸2.00～5.00g/L，水为余量；溶血剂的应用液中贮存液的体积占18～60％。
上述技术方案中，所述的缓冲液各组分的配比最好为磷酸氢二钠15.63g/L，柠檬酸3.78g/L，水为余量。贮存液各组分的配比最好为十二烷基三甲基氯化铵100.00g/L，磷酸氢二钠15.63g/L，柠檬酸3.78g/L，水为余量。
对于PocH-100i型血液分析仪，溶血剂的应用液中贮存液的体积占18％。
对于CA-800型血液分析仪，溶血剂的应用液中贮存液的体积占30％。
当然，对于其它某一型号血液分析仪，溶血剂的应用液中贮存液的体积占60％。
本发明的溶血剂在制备时，在一量筒中，将磷酸氢二钠、柠檬酸按上述配比混合于一起，加一定量(一定体积)的水制成缓冲液，备用。再用该缓冲液间接制成贮存液，方法是在另一量筒中加入上述配比的十二烷基三甲基氯化铵，加上述一定量(一定体积)的缓冲液即制得贮存液，备用。当然，也可以直接制得贮存液，方法是在另一量筒中将磷酸氢二钠、柠檬酸、十二烷基三甲基氯化铵按上述配比混合于一起，加一定量(一定体积)的水制成贮存液，备用。由于十二烷基三甲基氯化铵的含量为100.00g/L，因此贮存液中十二烷基三甲基氯化铵的浓度大约为10％。进行血细胞分析时，取一定量(一定体积)的贮存液，在其内加入一定量(一定体积)的缓冲液，混合均匀，用直径为0.45Lμm的微孔滤膜(醋酸纤维膜)过滤，可过滤2～3次，制成溶血剂的应用液，溶血剂的应用液中贮存液的体积占18～60％。溶血剂的应用液可按500～1000ml/瓶作为应用溶血剂。对于不同的血液分析仪，缓冲液和贮存液混合时的配比不同，如取150ml贮存液加缓冲液至500ml所制成的溶血剂的应用液，为CA-800型血液分析仪用的溶血剂。再如，取90ml贮存液加缓冲液至500ml所制成的溶血剂的应用液，为PocH-100i型血液分析仪用的溶血剂。
本发明的溶血剂可用于BC-2000、BC-2200、BC-2800、BC-3000型；丹能EXCELL-18、丹能EXCELL-22、丹能EXCELL-1020型；ABX micro-60型；MEK-6318K、MEK-6108K型；CA-800型；Sysmex KX-21型；PocH-100i型；CELL-DYN型；AC-900、AC920；AC-970型等多种三分群血液分析仪。还可作为溶血剂做五分群血液分析仪的基础试剂。
本发明的溶血剂，经北京、天津、华北地区多家三甲医院对比，其线性范围、重复性、稳定性达到原配套试剂指标，有些项目优于原配套试剂指标。结果如下1.材料与方法1.1仪器 Sysmex KX-21型三分群血液分析仪；PocH-100i型三分群血液分析仪；CA-800型三分群血液分析仪；BC-2000型三分群血液分析仪；ABX micro-60型三分群血液分析仪；MEK-6318K三分群血液分析仪；Sysmex SE-9000型五分群血液分析仪。
1.2溶血剂1.2.1含氰溶血剂(溶血剂I)，山东兰桥公司生产。
1.2.2无氰溶血剂(溶血剂II)，上海希森美康公司生产。
1.2.3本发明溶血剂(溶血剂III)。
1.3方法1.3.1血红蛋白最大吸收峰取稀释液10ml、全血20μl三份，加到溶血剂I、II、III各1ml中，室温60秒溶血后，用法国光栅分光光度计连续比色，读取吸光度值，以稀释液调零。可见，三种溶血剂均在波长420nm和540nm处吸收峰最大。混合液置室温60～180min后，其测定值无明显变化。
1.3.2用溶血剂I和溶血剂III在CA-800型血液分析仪分别测定同一份健康人全血20次。统计两种溶血剂的HGB、WBC及分类记数结果。
1.3.3用溶血剂II和溶血剂III在PocH-100i型血液分析仪分别测定同一份健康人全20次。统计两种溶血剂的HGB、WBC及分类记数结果。
1.3.4用溶血剂II和溶血剂III在Sysmex KX-21型血液分析仪分别测定同一份健康人全血20次。统计两种溶血剂的HGB、WBC及分类记数结果。
1.3.5用溶血剂II和溶血剂III在Sysmex SE-9000型血液分析仪分别测定同一份健康人全血20次。统计两种溶血剂的HGB、WBC及分类记数结果。
1.3.6取病理性WBC高值、低值标本(白血病患者)各1份；病理性血红蛋白高值、低值标本(血液病患者)各1份。分别用上述两两溶血剂组合、在7种机型上重复测定20次。统计3种溶血剂的HGB、WBC结果。
1.3.7用1.3.2～6的溶血剂组合分别在BC-2000、ABX micro-60、MEK-6318型三分群血液分析仪进行测定。统计3种溶血剂的HGB、WBC及分类记数结果。
2.结果2.1同一份健康人全血用溶血剂I、II、III在7种机型三分群血液分析仪上所测定HGB(血红蛋白)、WBC(白血球)、LYM(淋巴细胞)％、MID(单核细胞)％、GRAN(粒细胞)％结果的变异系数见表1。
表1 三种溶血剂测定5项血细胞参数的变异系数(CV％)
从表1可见，三种溶血剂在7种机型同一份正常人标本重复测定20次，血红蛋白的变异系数＜3％；白细胞计数的变异系数＜5.3％。溶血剂III的多项指标优于前两者。
2.2病理性高、低值白细胞和血红蛋白在7种机型测定结果的变异系数见表2。
三种溶血剂测定病理性高、低值血红蛋白表2 及白细胞结果的变异系数(CV％)
从表2可见，病理性高、低值白细胞和血红蛋白测定结果的变异系数大于正常人测定结果的变异系数，血红蛋白＜6％；白细胞计数的变异系数＜24％。这与白细胞和血红蛋白的异质性有关。
2.3溶血剂III测定血红蛋白和白细胞计数的线性范围HGB11.2～282.2g/L(CA-800型；Sysmex KX-21型血液分析仪)。
WBC0.61～78.82×109/L(CA-800型；Sysmex KX-21型血液分析仪)。
3.讨论 溶血剂的主要成分是第四级季氨盐类化合物，就针对血液红细胞和白细胞而言，要求该类化合物溶血完全、迅速释放出血红蛋白，并能迅速与之结合，形成稳定化合物。对白细胞能迅速脱去细胞质，而保持白细胞形态的完整性，并按细胞核的异质性进行分类。要求溶血剂能在最适pH值、离子强度、渗透压等环境下，仪器产生最佳脉冲信号。由于阻抗法三分群血液分析仪各生产厂家给定参数不尽相同，有的甚至为达到知识产权的保护作用，严格设定自己参数以达到保护目的。因此，研究一类首先无毒、环保无氰型的溶血剂；又能同时适用于多种常用三分群血液分析仪的溶血剂非常必要。本发明溶血剂经5年多临床探索，各项指标均达上述要求，且多数指标优于有氰溶血剂和个别原厂生产溶血剂。
本发明在原有滴加型无氰溶血素(CN1116606C)的基础上，广泛比较分析了不同种类分析仪的特点，筛选出众多试剂，进行多种配伍，研究出了一类适合多种三分群血液分析仪的环保型溶血剂；并可做为五分群血液分析仪基础试剂。其性能等同和优于氰化高铁血红蛋白法溶血剂，其性能也优于其它无氰溶血剂。本发明的溶血剂对仪器无损伤，对人体、环境无任何毒害，排出废液不需无害化处理，适于临床广泛应用，且其制备方法简单、易行。再者，上述十二烷基三甲基氯化铵是抑菌或杀菌能力很强的阳离子表面活性剂，故其贮存液或应用液放置时间越长使用效果越好(一般可放置三年到五年)。
具体实施例方式
实施例1本发明的溶血剂是由缓冲液和贮存液混合制成溶血剂的应用液。其中，缓冲液组分为磷酸氢二钠、柠檬酸、水(去离子水或蒸馏水)，各组分的配比为磷酸氢二钠156.30g(或者130.00g或者170.00g)，柠檬酸37.80g(或者20.00g或者50.00g)，水为11～15L(准备量)。在一量筒中，将磷酸氢二钠、柠檬酸按上述配比混合于一起，加水至10L制成缓冲液，备用。再用该缓冲液间接制成贮存液，方法是在另一量筒中加入500.00g(或者450.00g或者550.00g)十二烷基三甲基氯化铵，加5L上述缓冲液即制得贮存液，备用。进行血细胞分析时，取一定量(一定体积)的贮存液，在其内加入一定量(一定体积)的缓冲液，混合均匀，用直径为0.45μm的微孔滤膜(醋酸纤维膜)过滤，可过滤2～3次，制成溶血剂的应用液，溶血剂的应用液中贮存液的体积占18～60％。溶血剂的应用液可按500～1000ml/瓶作为应用溶血剂。对于不同的血液分析仪，缓冲液和贮存液混合时的配比不同，如取150ml贮存液加缓冲液至500ml所制成的溶血剂的应用液，为CA-800型血液分析仪用的溶血剂，使用时，将该溶血剂放入CA-800型血液分析仪的溶血剂盛装位置，连接管路即可应用。再如，取90ml贮存液加缓冲液至500ml所制成的溶血剂的应用液，为PocH-100i型血液分析仪用的溶血剂。
实施例2本发明的溶血剂是由缓冲液和贮存液混合制成溶血剂的应用液。其中，缓冲液组分为磷酸氢二钠、柠檬酸、水(去离子水或蒸馏水)，各组分的配比为磷酸氢二钠156.30g(或者130.00g或者170.00g)，柠檬酸37.80g(或者20.00g或者50.00g)，水为11～15L(准备量)。在一量筒中，将磷酸氢二钠、柠檬酸按上述配比混合于一起，加水至10L制成缓冲液，备用。可以直接制得贮存液，例如制得10L贮存液，方法是在另一量筒中，将磷酸氢二钠156.30g(或者130.00g或者170.00g)、柠檬酸37.80g(或者20.00g或者50.00g)、十二烷基三甲基氯化铵1000.00g(或者900.00g或者1100.00g)混合于一起，加水(去离子水或蒸馏水)至10L制成贮存液，备用。进行血细胞分析时，取一定量(一定体积)的贮存液，在其内加入一定量(一定体积)的缓冲液，混合均匀，用直径为0.45μm的微孔滤膜(醋酸纤维膜)过滤，可过滤2～3次，制成溶血剂的应用液，溶血剂的应用液中贮存液的体积占18～60％。溶血剂的应用液可按500ml/瓶作为应用溶血剂。对于不同的血液分析仪，缓冲液和贮存液混合时的配比不同，如取300ml贮存液加缓冲液至500ml制成溶血剂的应用液。再如，取250ml贮存液加缓冲液至500ml制成溶血剂的应用液。
权利要求
1.一种环保无氰型溶血剂，其特征在于所述的溶血剂是由缓冲液和贮存液混合制成溶血剂的应用液，其中，缓冲液组分为磷酸氢二钠、柠檬酸、水，各组分的配比为磷酸氢二钠13.00～17.00g/L，柠檬酸2.00～5.00g/L，水为余量；贮存液组分为十二烷基三甲基氯化铵、磷酸氢二钠、柠檬酸、水，各组分的配比为十二烷基三甲基氯化铵90.00～110.00g/L，磷酸氢二钠13.00～17.00g/L，柠檬酸2.00～5.00g/L，水为余量；溶血剂的应用液中贮存液的体积占18～60％。
2.根据权利要求1所述的溶血剂，其特征在于上述缓冲液各组分的配比为磷酸氢二钠15.63g/L，柠檬酸3.78g/L，水为余量；贮存液各组分的配比为十二烷基三甲基氯化铵100.00g/L，磷酸氢二钠15.63g/L，柠檬酸3.78g/L，水为余量。
3.根据权利要求1或2所述的溶血剂，其特征在于溶血剂的应用液中贮存液的体积占18％。
4.根据权利要求1或2所述的溶血剂，其特征在于溶血剂的应用液中贮存液的体积占30％。
5.根据权利要求1或2所述的溶血剂，其特征在于溶血剂的应用液中贮存液的体积占60％。
全文摘要
一种环保无氰型溶血剂，是由缓冲液和贮存液混合制成溶血剂的应用液。其中，缓冲液各组分的配比为磷酸氢二钠13.00～17.00g/L，柠檬酸2.00～5.00g/L，水为余量；贮存液各组分的配比为十二烷基三甲基氯化铵90.00～110.00g/L，磷酸氢二钠13.00～17.00g/L，柠檬酸2.00～5.00g/L，水为余量；溶血剂的应用液中贮存液的体积占18～60％。本发明适合多种三分群血液分析仪使用，并可做为五分群血液分析仪基础试剂，其性能等同和优于氰化高铁血红蛋白法溶血剂，相对于无氰溶血剂其性能得以改善，而且对仪器无损伤，对人体、环境无任何毒害，排出废液不需无害化处理，能在临床广泛应用。
文档编号G01N33/52GK1866011SQ20061001272
公开日2006年11月22日 申请日期2006年5月18日 优先权日2006年5月18日
发明者刘爱兵, 张继深 申请人:刘爱兵, 张继深
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