专利名称：上转换发光生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种上转换发光生物传感器，该生物传感器可对基于上转换发光技术免疫层析试纸进行结果判读，从而实现对病原体、抗原、抗体、违禁药品、重大疾病(肿瘤、癌症和糖尿病等)标志物等多种目标被检物的定性定量以及多重检测。
背景技术：
上转换发光材料(Up-Converting Phosphor，下称UCP)是一种可对能量进行上转的无机合成物，即UCP可吸收低能量的(长波长)红外光，但却发射高能量的(短波长)可见光。UCP是由几种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的。在这种材料中有三种主要的成分主基质、吸收子和发射子。
上转换发光材料发出的磷光光子能量高于激发光，即发射光波长短于激发光。具有上转换发光性能的材料是由稀土金属元素搀杂于晶体的晶格中而构成的化合物，其发光机理是上转换发光材料通过吸收两个红外光子发出一个可见光子。将这种上转换发光材料制备成纳米级颗粒，标记于生物分子，在红外光激发下该颗粒将发出可见磷光。根据磷光的有无及其强弱，可判断被检生物分子的属性及其含量。与传统标记物相比，将上转换发光材料作为标记物应用于生物分析中，具有无本底干扰、无焠灭、可进行多重分析和定量分析等优点。
附图1中描述了UCP颗粒在生物检测领域中应用的原理示意图。将上转换发光颗粒与生物活性分子通过共价键相连接制备标记物，该标记物在层析的过程中通过免疫反应固定于固相载体的表面，并在红外光的激发下发射出可见光。由此实现上转换发光材料与免疫层析技术相结合对生物样品中的目标被检物进行检测。
现有技术中，判读上转换标记颗粒发光情况的方法通常是，在红外激光照射下，通过肉眼来观察其发光情况。这种方法存在如下缺点1、只能定性观察生物反应的阳性与阴性，不能判断阳性反应的程度，即无法进行定量判读。
2、判读结果受操作者主观判断能力与经验的影响很大，如果磷光强度很弱，则肉眼无法看到。所以这种判读方法结果不可靠，且灵敏度低。
3、操作者容易受到被检生物样品的污染，同时操作者又可能对生物样品造成污染，因为操作者必须很靠近被检样品才能观察到标记物的发光情况。
目前，免疫层析技术中所使用的标记物通常为酶、胶体金以及着色胶珠标记物，这几种标记物应用于免疫层析技术中有两个共同点物理吸附交联法与通过颜色判断结果。其中物理吸附法(即通过疏水性以及静电吸附制备标记物)的脆弱性使得基于该种标记物的免疫层析对于反应的条件要求极为苛刻，从而一些有效的非特异去除试剂，如吐温20(Tween 20)、吹通100(Triton 100)、十二烷基磺酸钠(SDS)等，由于对疏水性以及静电性的影响改变而只能在低浓度使用，由此便造成了基于该种标记物的免疫层析试纸假阳性率、假阴性率较高的必然结果；另外通过颜色判断结果在使用操作简便的同时必然受观察者主观影响大、灵敏度低，且只能停留在定性水平，而绝对无法实现精确定量。这些缺点大大的限制了免疫层析技术在生物检测中的应用范围。
UCP作为标记物应用于免疫层析技术，不仅提高了检测灵敏度与稳定性，并且以其发光标记物的特点可与仪器结合对目标被检物进行多重定量检测。因此，人们希望开发出一种生物传感器对基于UCP的免疫层析试纸进行结果判读，从而最终实现对多种目标被检物的快速多重定量检测。
发明内容
本发明提供的上转换发光生物传感器，其结构特征在于包含激发光路、磷光图像接收光路、图像处理系统，该传感器可对基于上转换发光技术免疫层析试纸进行结果判读，所述的激发光路由红外激发光源和一维聚焦镜组成；所述的用以判读的试纸条安装于特制的外壳中，呈细长形，在试纸条上设置了多个功能带，如一个质控带和一个或多个检测带，功能带以一定间距平行排列，其方向垂直于试纸条长边方向；所述的磷光图像接收光路包括成像物镜、滤光片和图像接收器；所述的激发光路与磷光图像接收光路分置于试纸条两侧，两者的光轴与试纸条法线之间各存在一个夹角，而且两个夹角通常是不相等的；所述的一维聚焦镜将红外激发光源发出的光束变换成一条高光强[例如强度为0.1-0.3，优选0.15瓦/平方厘米(W/cm2)]的焦线，且焦线方向与试纸条的长边一致，从而将试纸条上的各功能带全部照明。
所述的磷光图像接收光路中的成像物镜由前镜组和后镜组组成，在两个镜组中间安装了滤光片。
所述的图像处理系统主要用于分析、保存磷光图像，给出判读结果。
本发明与现有技术相比具有下列技术效果1、判读效率高。激发光路中采用高强度的红外光焦线照明试纸条，而且同时将试纸条上的各功能带照明；磷光图像接收光路将试纸条上各功能带的磷光图像成像于图像接收器上；所以各功能带发出的磷光强度可同时判读；且磷光信号强度与功能带位置一一对应，可实现多重判读。
2、操作简单。激发光路、磷光图像接收光路和试纸条三者相对位置固定，判读时只将试纸条置于激发光路焦线处，无需运动即可判读出各功能带的发光强度。
3、可以定量判读。图像处理系统将试纸条磷光图像处理后，可给出各功能带的磷光强度值。
本发明的上转换发光生物传感器中采用的试纸条为基于上转换发光技术免疫层析试纸。
附图2中显示了试纸条的一般结构包括样品垫10(Sample Pad)，结合垫11(Conjugate Pad或结合物释放垫Conjugate Release Pad)，分析膜12(AnalyticalMembrane)，吸水垫13(Wicking Pad)、塑料背板14(其中一面涂有粘胶)(LaminatingCard)。样品垫10、结合垫11、膜12、吸水垫13通过粘胶15固定于塑料背板14上。
a.样品垫10是使用过程中滴加被检样品的部位；b.结合垫11中固定有UCP-抗体、UCP-抗原等UCP-生物活性分子结合物，在加入检测样品后，其可在试纸条上发生免疫反应；c.分析膜12是层析试纸的核心部分，检测带17、质控带18均固定于分析膜12的某一具体位置；d.吸水垫13在整个检测过程中，通过虹吸作用提供液体流过整个试纸条的动力。
各个部分之间的重叠区域16保证了液体在试纸条上流动的连续性。当进行检测时，将样品滴加到样品垫10上，样品通过渗透与虹吸作用进入结合垫11，使其中的UCP结合物重新溶解游离，并在吸水垫13的虹吸作用下，离开结合垫11进入膜12，在其内部向吸水垫13的方向流动。此过程中UCP结合物、目标被检物、检测带17、质控带18之间将特异地发生一定的免疫反应，并产生具有指示性的信号。
本发明中试纸条的装配，包括以下步骤A.将塑料背板12剪切成7.4×30cm规格的条带；B.将处理过的分析膜12粘于塑料背板14上21mm-46mm的位置，质控带18向上，检测带17向下；C.将处理过的结合垫11粘于塑料背板14上12mm的位置，上端压于分析膜12的下端，重叠1mm；D.将处理过的样品垫10粘于塑料背板14上，下端与塑料背板14平齐，上端压于结合垫11的下端，重叠3mm；E.将吸水垫13粘于塑料背板14上，上端与塑料背板14平齐，下端压于分析膜12的上端，重叠2mm；F.将装配成形的条带用切条机剪切成4mm宽的试纸条；G.将试纸条装入塑料外壳，干燥器中保存备用。
附图3中为粘贴时各部分之间的重叠关系。
附图4为试纸条装配完毕后各部分的结构与尺寸，其中样品垫10重叠后的净暴露长度为15mm，结合垫11重叠后的净暴露长度为7mm，分析膜12重叠后的净暴露长度为22mm，吸水垫13重叠后的净暴露长度为30mm。装配完毕并经过剪切的试纸条便可以装入试纸条的外壳中。
试纸条的外壳参见附图5，其包括加样孔20、结果判读窗口21和终点指示窗口22。其中，结果判读窗口21中对应检测带17、质控带18。所述终点指示窗口22中对应终点指示带19。其中通过加样孔20将样品点加到试纸条上后，在吸水垫13的虹吸作用下液体样品依次经过检测带17、质控带18。当终点指示带19变为绿色后，用生物传感器对外壳上结果判读窗口21中的各条带进行判读，就可以得到结果。
试纸条外壳分为上片和下片，参见附图6。23、24为咬合齿钉，将二者压紧便可以使试纸条外壳的上下片合为一体；25为挡板，26为倒钉，六个挡板与三个倒钉可将试纸条牢固地卡在外壳内，防止移动；27为压板，将上下片盖紧后，压板的位置处于试纸条上样品垫与结合垫、结合垫与膜重叠处，以此来增加试纸条各部分的连接，保证检测中液体流动的连续性。
如图6所示，将试纸条放入外壳的下片，将上片与下片盖紧，便成为可以用于检测的成品。
依据在试纸条上所发生免疫反应方式的不同，可分为夹心模式、竞争模式与间接模式。
A.夹心模式基于夹心模式的试纸条可用于检测样品中存在的病原体、微生物以及大分子抗原、抗体等。其中，对病原体、微生物以及大分子抗原进行检测的模式为双抗体夹心，对抗体进行检测为双抗原夹心。以下主要以双抗体夹心为例进行说明。
在试纸条的制备过程中，首先将UCP与被检物特异性抗体A(即，可与被检物特异性结合的抗体，但其只可结合于被检物上的A位点)相结合，并固定于结合垫11内；然后，将被检物特异性抗体B(即，可与被检物特异性结合的抗体，但其只可结合于被检物上的B位点；注此处所使用的抗体也可以为被检物特异性多克隆抗体。)固定于分析膜12上作为检测带17，将二抗(即，可与被检物特异性抗体A特异性结合的抗体)固定于分析膜12上作为质控带18，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸贴于吸水垫上作为终点指示带19。
附图7是生物样品中含有待测物，亦即阳性样品检测的示意图，样品中的被检物首先和结合垫中的UCP-抗体A相结合，即UCP-抗体A结合于被检物上的A位点。然后，二者形成的免疫复合物(UCP-抗体A-被检物)以及游离的UCP-抗体A结合物，与样品中的液体基质一起在吸水垫的带动下进入分析膜。当其流过检测带时，检测带上的抗体B将与免疫复合物(UCP-抗体A-被检物)中被检物上的B位点相结合形成UCP-抗体A-被检物-抗体B复合物，并被固定于检测带上。而游离UCP-抗体A不与抗体B结合，在吸水垫的带动下继续流动。当通过质控带时，与其上的二抗(即，可与抗体A特异性结合的抗体)结合并被固定于质控带上。残余的液体基质继续向吸水垫流动，并与其上pH试纸内的指示剂发生反应，使其由黄色变为绿色。终点指示带发生颜色变化的试纸条便可以进行结果判读。使用上转换发光生物传感器(UPT生物传感器)对试纸条进行判读，阳性检测中试纸条的检测带与质控带上均有可见磷光产生，其所对应的信号强度分别为T与C。检测带上磷光光强T与质控带上磷光光强C的比值，即T/C，与样品中含有的被检物浓度成正比。
附图8是生物样品中不含有待测物，亦即阴性样品检测的示意图。由于样品中不含有被检物，因而重新溶解游离，并随样品的液体基质一起进入膜的只有UCP-抗体A。由此，只有在质控带上发生UCP-抗体A与二抗的免疫反应，并将UCP-抗体A固定其上。这样阴性检测中的试纸条在最终的UPT生物传感器判读下，只有质控带上有可见磷光产生。
将夹心模式系统中的抗体A与抗体B换为抗原A与抗原B，既可以双抗原夹心对某种病原体感染所产生的抗体进行检测。反应原理、结果指征与以上的双抗体夹心检测抗原相同。
B.竞争模式基于竞争模式的试纸条可用于检测样品中存在的小分子抗原。
在试纸条的制备过程中，首先将UCP与被检物特异性抗体A相结合，并固定于结合垫内；然后，将与被检物相同的抗原(均含有抗体A可特异性结合的A位点)固定于膜上作为检测带，将二抗(即，可与被检物特异性抗体A特异性结合的抗体)固定于膜上作为质控带，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸贴于吸水垫上作为终点指示带。
当对阳性样品进行检测时，可分为两种情况被检物浓度高、被检物浓度较低。
附图9为被检物浓度高时的竞争免疫反应的示意图。当样品中被检物浓度高时，加样后样品中的被检物和结合垫中的UCP-抗体A全部结合，即UCP-抗体A结合于被检物上的A点。因而，在吸水垫的带动下，与样品中的液体基质一起进入膜的只有UCP-抗体A-被检物免疫复合物。当其流过检测带时，由于免疫复合物中UCP标记的抗体A已与被检物结合，所以不能与检测带上含有A位点的抗原结合。UCP-抗体A-被检物免疫复合物继续流动，当流过质控带时发生免疫复合物中抗体A与二抗的免疫反应，并将UCP-抗体A-被检物免疫复合物固定其上。残余的液体基质继续向吸水垫流动，并与其上pH试纸内的指示剂发生反应，使其由黄色变为绿色。对变色后的试纸条进行传感器判读，在红外光的照射下只有质控带上有可见磷光产生。
附图10为被检物浓度低时的竞争免疫反应的示意图。当样品中被检物浓度较低时，加样后样品中的被检物首先和结合垫中的UCP-抗体A相结合。然后，二者形成的免疫复合物(UCP-抗体A-被检物)以及游离的UCP-抗体A结合物，与样品中的液体基质一起在吸水垫的带动下进入膜。当其流过检测带时，由于免疫复合物中UCP标记的抗体A已与被检物结合，因而只有游离的UCP-抗体A结合物可与检测带上含有A位点的抗原结合，并被固定。剩余的UCP-抗体A-被检物免疫复合物继续流动，当流过质控带时发生免疫复合物中抗体A与二抗的免疫反应，并将UCP-抗体A-被检物免疫复合物固定其上。这样试纸条在最终的红外光照射下，检测带与质控带上均有可见磷光产生，其所对应的信号强度分别为T与C。检测带上磷光光强T与质控带上磷光光强C的比值，即T/C，与样品中含有的被检物浓度成反比。
附图11为对阴性样品进行检测时的竞争免疫反应的示意图。由于样品中不含有被检物，因而重新溶解游离，并随样品的液体基质一起进入膜的只有UCP-抗体A。其与检测带上含有A位点的抗原，质控带上的二抗均可结合。这样试纸条在最终的红外光照射下，检测带与质控带上均有可见磷光产生。但此时的T/C值与阳性检测低浓度时相比达到最强。
C.间接模式基于间接模式的试纸条可用于检测多种动物(包括人)受某种病原体感染后血清中的相应抗体。
在试纸条的制备过程中，首先将UCP与葡萄球菌蛋白A(SPA)相结合，并固定于结合垫内；然后，将某种病原体的表面抗原固定于膜上作为检测带，将羊IgG固定于膜上作为质控带，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸贴于吸水垫上作为终点指示带。
附图12为对阳性血清样品进行检测时的间接免疫反应示意图。加样后样品中的液体基质使UCP-SPA结合物重新溶解游离并与血清样品中存在的各种IgG(免疫球蛋白G，其中包括一部分病原体特异性抗体IgG)相结合。在吸水垫的带动下，UCP-SPA-IgG结合物与游离的UCP-SPA一起流动进入膜。当流过检测带时，UCP-SPA-IgG结合物中的UCP-SPA-病原体特异性抗体IgG通过病原体特异性抗体IgG与检测带上的病原体抗原发生特异的免疫结合反应，并结合于其上。游离的UCP-SPA和其它的一些UCP-SPA-IgG结合物(其中不含有UCP-SPA-病原体特异性抗体IgG)将继续流动，并在通过质控带时UCP-SPA与其上的羊IgG相结合。残余的液体基质继续向吸水垫流动，并与其上pH试纸内的指示剂发生反应，使其由黄色变为绿色。对变色后的试纸条进行传感器判读，在红外光照射下质控带与检测带上均有可见磷光，其所对应的信号强度分别为T与C。检测带上磷光光强T与质控带上磷光光强C的比值，即T/C，与血清样品中病原体特异性抗体IgG的浓度成正比。(注葡萄球菌蛋白A，即SPA，的特性是可以与多种动物的IgG发生结合。)附图13为对阴性血清样品进行检测时的间接免疫反应示意图。由于样品中不含有病原体特异性抗体IgG，因而重新溶解游离，并随样品的液体基质一起进入膜的只有UCP-SPA与其它的一些UCP-SPA-IgG结合物(其中不含有UCP-SPA-病原体特异性抗体IgG)。其中UCP-SPA与质控带上的羊IgG结合，而检测带上的病原体抗原未参加任何反应。这样试纸条在最终的红外光照射下，只有质控带上有可见磷光产生。
该试纸条结构中包括一外壳，所述外壳上包括加样孔，结果判读窗口和终点指示窗口。通过加样孔，将生物样品添加到样品垫上；结果判读窗口对应于分析膜上的检测带和质控带；终点指示窗口对应于吸水垫上的终点指示带。
UCP所标记的生物活性分子，包括抗原、抗体、葡萄球菌蛋白A、外源凝激素、多聚核苷酸、受体配体、药物、细胞等。
UCP颗粒的直径为200-300nm。并且，可以对UCP颗粒的表面进行了修饰。
当用于双抗体夹心免疫检测方法时，其中，结合垫上固定有UCP标记的第一特异性抗体，该特异性抗体可与待测物的一个位点相结合；分析膜的检测带上固定有与待测物的另一个位点相结合的第二特异性抗体，质控带上固定有可与第一特异性抗体发生特异性结合的抗体。
当用于双抗原夹心免疫检测方法时，其中，结合垫上固定有UCP标记的抗原A；分析膜的检测带上固定有抗原B，抗原A与抗原B可以结合于目标被检抗体的不同位点；质控带上固定有可与抗原A发生特异性结合的抗体。
当用于竞争免疫检测方法时，其中，结合垫上固定有UCP标记的特异性抗体，该抗体可与待测物的一个位点相结合；分析膜的检测带上固定有与待测物具有相同的上述位点的抗原，质控带上固定有可与上述特异性抗体发生特异性结合的抗体。
当用于间接免疫检测方法时，其中，结合垫上固定有UCP标记的葡萄球菌蛋白A；分析膜的检测带上固定有某种病原体的表面抗原，质控带上固定有IgG。
本发明中提到的上述试纸条的制备方法如下，其包括以下步骤1)UCP-生物活性分子的制备对UCP颗粒进行表面修饰，与生物活性分子进行连接，在UCP保存液中进行保存；取一定量的保存于UCP保存液中的UCP-生物活性分子结合物，离心，并弃去上清液；在沉降的UCP生物活性分子结合物中加入稀释液，并充分混匀，制备成悬浊液；2)样品垫的制备选用纤维素膜作为样品垫固相材料，剪切成具有一定规格的条带；将样品垫放入样品垫封闭液中浸泡；将样品垫从封闭液中取出，烘干，使样品垫充分干燥；3)结合垫的制备选用玻璃纤维素膜作为结合垫固相材料，剪切成具有一定规格的条带；在该条带上加上UCP-生物活性分子结合物的悬浊液；烘干条带，使结合垫充分干燥；
4)分析膜的制备选用硝酸纤维素膜作为分析膜固相材料，剪切成具有一定规格的条带；在条带上的不同位置喷点生物活性分子，制成检测带和质控带；烘干该条带，使分析膜充分干燥；5)装配该试纸条将处理过的分析膜粘贴于塑料背板上，质控带向上，检测带向下；将处理过的结合垫粘贴于塑料背板上，上端压于分析膜的下端，并相互重叠；将处理过的样品垫粘贴于塑料背板上，下端与塑料背板平齐，上端压于结合垫的下端，并相互重叠；将吸水垫粘贴于塑料背板上，上端与塑料背板平齐，下端压于分析膜的上端，并与分析膜相互重叠；将装配成形的条带剪切成一定规格的试纸条。
由此制备成本发明的免疫层析用试纸条，该试纸条可以装入外壳中，在干燥条件下备用。该外壳可以是塑料的。
其中，所述UCP保存液为pH＝7.2 0.03mol/L磷酸盐缓冲液(PB)，含有0.1％BSA，0.05％Tween20，0.02％NaN3。
其中，所述UCP生物活性分子的稀释液为pH＝7.2 0.03mol/L磷酸盐缓冲液(PB)，含有1％蔗糖，1％BSA。
其中，所述样品垫封闭液为pH＝7.2 0.03mol/L磷酸盐缓冲液(PB)，含有5％BSA，0.1％Tween20。
其中，可将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸贴于吸水垫作为终点指示带。
应用UPT生物传感器对多种试纸条进行结果判读，可实现冠状病毒(SARA病毒)，鼠疫FI-抗原，鼠疫感染抗体以及违禁药品等多种目标被检物的精确定量检测。
本发明的目的在于克服上述在先技术的缺点，提供一种前所未有的上转换发光生物传感器，其可以充分利用UCP的上转换发光特性，在UCP经过表面修饰与活化、作为生物标记物与免疫层析技术相结合后，对基于UCP的各种免疫层析试纸进行快速结果判读。最终实现对病原体、病原体感染所产生的抗体、违禁药品、重大疾病(肿瘤、癌症和糖尿病等)标志物等多种目标被检物的定性、定量及多重检测，以满足生物恐怖剂检测、传染病和重大疾病的辅助诊断以及民用医疗保健的需求。其具有定量精确、快速，并可进行多重检测的优点。
图1UCP颗粒用于生物检测领域的原理示意图；
图2免疫层析试纸条的结构示意图；图3装配试纸条时，各部分的粘贴示意图；图4试纸条的结构与尺寸；图5试纸条外壳的俯视图；图6试纸条外壳的内部结构，分为上片和下片；图7夹心免疫反应为阳性的反应示意图；图8夹心免疫反应为阴性的反应示意图；图9竞争免疫反应为阳性时，待测物为高浓度的反应示意图；图10竞争免疫反应为阳性时，待测物为低浓度的反应示意图；图11竞争免疫反应为阴性的反应示意图；图12间接免疫反应为阳性的反应示意图；图13间接免疫反应为阴性的反应示意图；图14UPT生物传感器结果判读图(左为乙肝表面抗原阴性检测，右为阳性检测)；图15乙肝病毒表面抗原检测标准工作曲线；图16UPT生物传感器结果判读图(左为SARS病毒阴性检测，右为阳性检测)；图17SARS病毒检测标准工作曲线；图18UPT生物传感器结果判读图(左为鼠疫FI-抗原阴性检测，右为阳性检测)；图19鼠疫FI-Ag检测标准工作曲线；图20UPT生物传感器结果判读图(左为安非他命阴性检测，右为阳性检测)；图21安非他命检测标准工作曲线图；图22UPT生物传感器结果判读图(左为鼠疫感染抗体阴性检测，右为阳性检测)；图23鼠疫抗体检测标准工作曲线；图24UPT生物传感器结果判读图(左为SARS病毒感染抗体阴性检测，右为阳性检测)；图25SARS病毒抗体检测标准工作曲线；图26上转换发光生物传感器的立体结构示意图；图27上转换发光生物传感器中激发光路光轴、试纸条法线和磷光图像接收光路光轴的平面结构示意图；图28上转换发光材料的发射光谱曲线；
图29滤光片的透过率曲线。
实验例1双抗体夹心模式检测乙肝表面抗原HBs-Ag一、UPT生物传感器结果判读图14UPT生物传感器结果判读图(左为乙肝表面抗原阴性检测，右为阳性检测)二、标准工作曲线的绘制1、将提纯的乙肝表面抗原HBs-Ag标准品用1∶10稀释的正常人血清(以pH＝7.20.03mol/LPB缓冲液稀释)作为稀释液配置系列浓度标准品，浓度为0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、150pg/ml、200pg/ml、250pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700pg/ml、800pg/ml、900pg/ml、1000pg/ml、1100pg/ml、1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、1600pg/ml的20份样品；2、每个样品分别用10个UPT试纸条检测10次，10次检测中传感器判读得到的T值与C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出与每个浓度对应的T/C结果，列于下表1表1乙肝病毒表面抗原检测标准工作曲线
3、以T/C值作为X，以乙肝表面抗原HBs-Ag浓度作为Y绘制标准工作曲线，经统计拟和标准工作曲线的表达式为Y＝268.73X+103.06，拟和系数的平方为R2＝0.975；结果见图15乙肝病毒表面抗原检测标准工作曲线。
4、乙肝表面抗原浓度的计算公式为
血清样品中含有的乙肝表面抗原HBs-Ag浓度(pg/ml)＝10Y＝10×(268.73X+103.06)＝2687.3X+1030.6三、实际检测结果1、检测准确性将50份购自生物制品鉴定所的乙肝病人血清盘(其中含13份阳性，37份阴性)同时用胶体金免疫层析试纸与本系统(UPT试纸条与传感器)进行双盲检测胶体金免疫层析试纸法——11份阳性，39份阴性(即，两份阳性漏检)；UPT试纸条与传感器法——13份阳性，37份阴性，与实际结果完全吻合；同时与胶体金免疫层析试纸的定性检测相对，UPT试纸条与传感器法给出了每份样品的最终准确浓度。
2、检测稳定性将一份乙肝病人血清用pH＝7.20.03mol/L PB缓冲液10倍稀释，用UPT试纸条与传感器重复检测10次，结果列于下表2表2乙肝病毒表面抗原检测重复性
同一份血清重复测量的变异系数(CV)＝2.621％结论在乙肝表面抗原HBs-Ag检测中，UPT试纸条与传感器法与胶体金免疫层析试纸法相比具有更高的灵敏度，且在实现精确定量检测的同时具有很好的稳定性。
实验例2双抗体夹心模式检测冠状病毒(SARS病毒)一、PT生物传感器结果判读图16UPT生物传感器结果判读图(左为SARS病毒阴性检测，右为阳性检测)。
二、标准工作曲线的绘制1、将经过培养、记数并灭活的SARS病毒用pH＝7.20.03mol/L PB缓冲液作为稀释液配置系列浓度标准品，浓度为0org/ml、100org/ml、200org/ml、300org/ml、400org/ml、500org/ml、600org/ml、700org/ml、800org/ml、900org/ml、1000org/ml、1100org/ml、1200org/ml、1300org/ml、1400org/ml、1500org/ml、1600org/ml、1700org/ml、1800org/ml、1900org/ml、2000org/ml的21份样品；2、每个样品分别用10个UPT试纸条检测10次，10次检测中传感器判读得到的T值与C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出与每个浓度对应的T/C结果，列于下表3表3SARS病毒检测标准工作曲线
3、以T/C值作为X，以SARS病毒浓度作为Y绘制标准工作曲线，经统计拟和标准工作曲线的表达式为Y＝337.2X+216.12，拟和系数的平方为R2＝0.9631；结果见图17SARS病毒检测标准工作曲线。
4、SARS病毒浓度的计算公式为样品中含有的SARS病毒浓度(org/ml)＝10Y＝10×(337.2X+216.12)＝3372X+2161.2三、实际检测结果1、检测准确性将30份待检样品(其中含6份阳性，24份阴性)用本系统(UPT试纸条与传感器)进行双盲检测UPT试纸条与传感器法——6份阳性，24份阴性，与实际结果完全吻合；同时UPT试纸条与传感器法给出了每份样品的最终精确浓度。
2、检测稳定性将一份待检样品用pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液10倍稀释，用UPT试纸条与传感器检测10次，结果列于下表4
表4SARS病毒检测重复性
同一份待检样品重复测量的变异系数(CV)＝1.03％结论在SARS病毒检测中，UPT试纸条与传感器法具有很好的灵敏度与稳定性，且实现了精确定量。
实验例3竞争模式检测鼠疫FI-抗原(鼠疫FI-Ag)一、PT生物传感器结果判读见图18UPT生物传感器结果判读图(左为鼠疫FI-抗原阴性检测，右为阳性检测)。
二、标准工作曲线的绘制1、将提纯的鼠疫FI-Ag标准品用pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液作为稀释液配置系列浓度标准品，浓度为0pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700ng/ml、800pg/ml、900pg/ml、1000pg/ml、1100pg/ml、1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、1600pg/ml、1700pg/ml、1800pg/ml、1900pg/ml、2000pg/ml的21份样品；2、每个样品分别用10个UPT试纸条检测10次，10次检测中传感器判读得到的T值与C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出与每个浓度对应的T/C结果，列于下表5表5鼠疫FI-Ag检测标准工作曲线
3、以T/C值作为X，以鼠疫FI-Ag浓度作为Y绘制标准工作曲线，经统计拟和标准工作曲线的表达式为Y＝-324.63X+2058.5，拟和系数的平方为R2＝0.9993；结果见图19鼠疫FI-Ag检测标准工作曲线。
4、鼠疫FI-Ag浓度的计算公式为样品中含有的鼠疫FI-Ag浓度(pg/ml)＝10Y＝10×(-324.63X+2058.5)＝-3246.3X+20585三、实际检测结果1、检测准确性将32份待检样品(其中含19份阳性，13份阴性)用本系统(UPT试纸条与传感器)进行双盲检测UPT试纸条与传感器法——19份阳性，13份阴性，与实际结果完全吻合；同时UPT试纸条与传感器法给出了每份样品的最终精确浓度。
2、检测稳定性将一份待检样品用pH＝7.20.03mol/L PB缓冲液10倍稀释，用UPT试纸条与传感器检测10次，结果列于下表6表6鼠疫FI-Ag检测重复性
同一份待检样品重复测量的变异系数(CV)＝1.034％结论在鼠疫FI-Ag检测中，UPT试纸条与传感器法具有很好的灵敏度与稳定性，且实现了精确定量检测。
实验例4竞争模式检测违禁药品(以检测安非他命为例进行说明)一、UPT生物传感器结果判读图20UPT生物传感器结果判读图(左为安非他命阴性检测，右为阳性检测)二、标准工作曲线的绘制1、将纯品安非他命用pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液作为稀释液配置系列浓度标准品，浓度为0pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、70pg/ml、90ng/ml、110pg/ml、130pg/ml、150pg/ml、170pg/ml、190pg/ml、210pg/ml、230pg/ml、250pg/ml、270pg/ml、290pg/ml、310pg/ml、330pg/ml的20份样品；2、每个样品分别用10个UPT试纸条检测10次，10次检测中传感器判读得到的T值与C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出与每个浓度对应的T/C结果，列于下表7表7安非他命检测标准工作曲线
3、以T/C值作为X，以安非他命浓度作为Y绘制标准工作曲线，经统计拟和标准工作曲线的表达式为Y＝-51.985X+296.45，拟和系数的平方为R2＝0.9529；结果见图21安非他命检测标准工作曲线。
4、安非他命的浓度计算公式为样品中含有的安非他命浓度(pg/ml)＝10Y＝10×(-51.985X+296.45)＝-519.85X+2964.5三、实际检测结果1、检测准确性将44份待检样品(其中含23份阳性，21份阴性)用本系统(UPT试纸条与传感器)进行双盲检测UPT试纸条与传感器法——23份阳性，21份阴性，与实际结果完全吻合；同时UPT试纸条与传感器法给出了每份样品的最终精确浓度。
2、检测稳定性将一份待检样品用pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液10倍稀释，用UPT试纸条与传感器检测10次，结果列于下表8
表8安非他命检测重复性
同一份待检样品重复测量的变异系数(CV)＝0.423％结论在安非他命检测中，UPT试纸条与传感器法具有很好的灵敏度与稳定性，且实现了精确定量检测。
实验例5间接模式检测鼠疫感染抗体(以检测兔感染鼠疫产生抗体为例进行说明)一、UPT生物传感器结果判读图22UPT生物传感器结果判读图(左为鼠疫感染抗体阴性检测，右为阳性检测)二、标准工作曲线的绘制1、将提纯的兔抗鼠疫IgG标准品用1∶10稀释的正常兔血清(以pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液稀释)作为稀释液配置系列浓度标准品，浓度为0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml的20份样品；2、每个样品分别用10个UPT试纸条检测10次，10次检测中传感器判读得到的T值与C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出与每个浓度对应的T/C结果，列于下表9表9鼠疫抗体检测标准工作曲线
3、以T/C值作为X，以鼠疫抗体浓度作为Y绘制标准工作曲线，经统计拟和标准工作曲线的表达式为Y＝14.129X-0.3076，拟和系数的平方为R2＝0.9749；结果见图23鼠疫抗体检测标准工作曲线。
4、鼠疫抗体浓度的计算公式为兔血清中含有的鼠疫抗体浓度(ng/ml)＝10Y＝10×(14.129X-0.3076)＝141.29X-3.076三、实际检测结果1、检测准确性将100份兔血清(其中含31份阳性，69份阴性)同时用酶联免疫吸附法(ELISA)与本系统(UPT试纸条与传感器)进行双盲检测ELISA法——23份阳性，77份阴性；UPT试纸条与传感器法——31份阳性(包括ELISA中的23份阴性，并从ELISA确定的77份阴性样品中又检出8份阳性)，69份阴性，与实际结果完全吻合；同时与ELISA的定性检测相对，UPT试纸条与传感器法给出了每份样品的最终精确浓度。
2、检测稳定性将一份感染鼠疫家兔的血清用pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液10倍稀释，用UPT试纸条与传感器检测10次，结果列于下表10表10鼠疫抗体检测标准工作曲线
同一份血清重复测量的变异系数(CV)＝1.408％结论在鼠疫感染抗体检测中，UPT试纸条与传感器法与ELISA法相比具有更高的灵敏度，且在实现精确定量的同时具有很好的稳定性。
实验例6间接模式检测SARS病毒感染抗体一、UPT生物传感器结果判读图24UPT生物传感器结果判读图(左为SARS病毒感染抗体阴性检测，右为阳性检测)二、标准工作曲线的绘制1、将从SARS病人血清中提纯的人抗SARS病毒IgG标准品用1∶10稀释的正常人血清(以pH＝7.20.03mol/L PB缓冲液稀释)作为稀释液配置系列浓度标准品，浓度为0ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/ml、22ng/ml、24ng/ml、26ng/ml、28ng/ml、30ng/ml、32ng/ml、34ng/ml的21份样品；2、每个样品分别用10个UPT试纸条检测10次，10次检测中传感器判读得到的T值与C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出与每个浓度对应的T/C结果，列于下表11表11SARS病毒抗体检测标准工作曲线
3、以T/C值作为X，以SARS病毒抗体浓度作为Y绘制标准工作曲线，经统计拟和标准工作曲线的表达式为Y＝5.7365X+0.8012，拟和系数的平方为R2＝0.9841；结果见图25SARS病毒抗体检测标准工作曲线。
4、SARS病毒抗体浓度的计算公式为人血清中含有的SARS病毒抗体浓度(ng/ml)＝10Y＝10×(5.7365X+0.8012)＝57.365X+8.012三、实际检测结果1、检测准确性
将45份可能感染SARS病毒的病人血清(最终确诊其中含17份阳性，28份阴性)同时用酶联免疫吸附法(ELISA)与本系统(UP试纸条与传感器)进行双盲检测ELISA法——17份阳性，28份阴性，与实际结果完全吻合，检测历时2小时左右；UPT试纸条与传感器法——17份阳性，28份阴性，与实际结果完全吻合，检测历时半个小时左右；与ELISA法相比，UPT试纸条与传感器法检测更为快速，且在ELISA法定性检测的基础上定量地给出了每份样品的最终精确浓度。
2、检测稳定性将一份SARS病人血清用pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液10倍稀释，用UPT试纸条与传感器检测10次，结果列于下表12表12SARS病毒抗体检测重复性
同一份血清重复测量的变异系数(CV)＝0.819％结论在SARS病毒感染抗体检测中，UPT试纸条与传感器法与ELISA法相比更为快速、可实现精确定量检测，且稳定性很好。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例对本发明进行详细解释。
实施例1上转换发光生物传感器的结构参阅图26和图27。由图可知，本发明上转换发光生物传感器包括激发光路、磷光图像接收光路、图像处理系统，分别用于照明试纸条3、接收试纸条3发出的磷光图像、对试纸条3发出的磷光图像进行分析与处理，上转换发光生物传感器中试纸条结构示意图参阅图5。
在激发光路上，沿光轴依次设置红外激发光源1、一维聚焦镜2，其光轴为010。在磷光图像接收光路上，沿光轴依次设置前镜组5、滤光片6、后镜组7和图像接收器8，其光轴为002。磷光图像接收光路的物面与试纸条3的上表面重合，磷光图像接收光路的像面与图像接收器8的敏感面重合。试纸条3安装于特制的外壳4中，其法线为003。激发光路形成的焦线AA照明试纸条3，焦线AA与试纸条3的长边平行，且与试纸条3的对称线重合。激发光路的光轴010、试纸条3的法线003和磷光图像接收光路的光轴002位于同一个平面内，激发光路的光轴010与试纸条3的法线003的夹角为B1，磷光图像接收光路的光轴002与试纸条3的法线003的夹角为B2。
所说的激发光路由红外激发光源1、一维聚焦镜2组成，其作用是产生一条强度为0.1-0.3瓦/平方厘米(W/cm2)的细长红外光焦线AA，照明试纸条3的所有功能带。红外激发光源1通常是经过准直的半导体激光器，发出平行光束，其波长一般为980nm附近。一维聚焦镜2可以是柱面透镜、棱镜或其他可以产生焦线的光学元件。
所说的试纸条3上含有两个功能带，即检测带、质控带。其中检测带将根据不同的检测模式与待检测样品中目标被检物以及UCP标记物发生特异性的免疫反应，其上结合UCP所产生的信号为T；质控带通过免疫反应结合UCP所产生的信号为C，T与C的比值，即T/C便是与不同浓度目标被检物对应的检测结果，其将与待检测样品中目标被检物的浓度呈一定的线形关系，同时C对于试纸条的生物学反应性能具有监控作用；所说的磷光图像接收光路由前镜组5、滤光片6、后镜组7和图像接收器8组成；磷光图像接收光路的物方孔径半角为U2。前镜组5将试纸条3上各功能带发出的磷光准直成平行光。滤光片6滤除磷光信号中包含的杂光，以提高信噪比；它对磷光信号具有尽可能高的透过率(大于90％)，而对激发光具有尽可能低的透过率(小于10-5)。后镜组7将滤除杂光后的磷光信号聚焦成像于图像接收器8的敏感面上。图像接收器8可以是一个线阵CCD摄像机，也可以是一个一维光电二极管阵列，其敏感元件的排列方向与试纸条3的细长方向一致。所以图像接收器8可以对应地测量试纸条3上各功能带发出的磷光强度。
所说的激发光路光轴010与试纸条3法线003的夹角为B1、以及磷光图像接收光路光轴002与试纸条3法线003的夹角为B2，且B1≠B2，通常B1＞B2-U2，或B1＜B2-U2，U2为磷光图像接收光路的物方孔径半角。这种设计的目的是阻止照明光线的反射光进入磷光图像接收光路，以减小杂光。
与在先技术相比，本发明的特点在于激发光路产生高强度红外激光焦线AA，同时将试纸条3上的各功能带照明；磷光图像接收光路对试纸条3上的各功能带同时成像；夹角B1与夹角B2不等，且满足B1＞B2-U2，或B1＜B2-U2。
上述特点使本发明具有判读效率高、判读灵敏度高、可进行多重定量检测等优点。
本发明上转换发光生物传感器的工作过程是首先将安装于外壳4中的试纸条3放到判读位置。由红外激发光源1发出的平行光束经一维聚焦镜2形成焦线AA，焦线AA位于试纸条3的上表面，且与试纸条3的细长方向平行，这样将试纸条3上的各功能带全部照明。由试纸条3上各功能带发出的磷光信号经前镜组5准直后变成平行光，经滤光片6滤除杂光后被后镜组7聚焦成像于图像接收器8的敏感面上。图像处理系统9对图像接收器8输出的试纸条磷光图像进行分析与处理，给出试纸条3上各功能带磷光信号的幅度，进而给出被检生物分子的属性和含量。
图26和图27是本发明的最佳实施例，其具体结构和参数叙述如下激发光路中的红外激发光源1发出的平行光束的截面尺寸为4mm×1mm，中心波长为980nm，功率为30mW；一维聚焦镜2为平凸柱面透镜，其焦距为20mm。焦线AA的尺寸为20mm×1mm，略小于试纸条3的结果判读窗口尺寸。结果判读窗口中试纸条上的两条带分别为距终点指示窗一侧结果判读窗口内沿12.2mm处为检测带、7.2mm处为质控带。研究中采用的上转换磷光材料是(YYbEr)F3(氟化钇镱铒)，在红外光激发下发出的磷光光谱如图28所示，其主峰值波长为541.5nm。磷光图像接收光路中的前镜组5的焦距为40mm，物方孔径半角U2＝20°；滤光片6的光谱透过率曲线如图29所示，在541.5nm波长处的透过率大于90％，而在980nm波长处的透过率小于10-5。后镜组7的焦距为40mm，所以磷光图像接收光路的放大倍率为-1倍。图像接收器8是一个线阵CCD摄像机，其敏感面长度为22mm，共含有2200个像素，像素尺寸为10μm×10μm。所以图像接收器8对试纸条3的空间判读分辨率为10μm。
最佳实施例对纯上转换磷光材料的判读灵敏度优于1μg/L，可同时检测4种以上的生物物质。
实施例2双抗体夹心检测乙肝表面抗原HBs-Ag(1)免疫层析液相材料准备A.UCP-抗体结合物a.利用已建立的表面修饰与活化方法对直径200-300nm的UCP颗粒进行表面修饰，并与抗乙肝表面抗原HBs-Ag单克隆抗体进行连接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以浓度1mg/mL，4℃保存备用；b.将保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗体结合物6mL，12000r/min，4℃，离心30min，尽量弃尽上清；c.向离心管中的UCP-抗体结合物沉降，加入3mL结合物稀释液(pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液中，含1％蔗糖、1％BSA)涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL UCP-抗体结合物)d.将悬浊液倒入试剂瓶中，4℃保存备用；B.样品垫封闭液a.用天平精确称量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小烧杯中；b.烧杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液20mL，玻璃棒搅拌充分混匀；c.BAS溶液中加入Tween20(吐温20)20μL，玻璃棒搅拌充分混匀(终浓度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存备用；C.检测带蛋白a.用天平精确称量纯化的兔抗HBs-Ag多克隆抗体2mg，置于1.5mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；D.质控带蛋白；a.用天平精确称量纯化的羊抗鼠IgG抗体2mg，置于1.5mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；(2)免疫层析固相载体材料准备A.样品垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为样品垫固相材料，将其剪切成1.5×30.0cm规格的条带；b.将样品垫放入长形平皿中，样品垫封闭液加于其上，常温浸泡30min；c.将样品垫由封闭液中取出，放于干净的平皿中；d.37℃烘干3小时，使样品垫充分干燥；e.封闭后的样品垫在干燥的环境中保存备用；B.结合垫
a.选用玻璃纤维素膜(Glass Fiber)作为结合垫固相材料，将其剪切成1.0×30.0cm规格的条带；b.将4℃保存备用的2mg/mL UCP-抗体结合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，含1％蔗糖、1％BSA)超声10s；c.将结合垫放入长形平皿中，UCP-抗体结合物悬浊液加于其上；d.将结合垫取出放于干净的平皿中；e.37℃烘干2.5小时，使结合垫充分干燥；f.处理后的结合垫在干燥的环境中保存备用；C.分析膜a.以孔径为12μm的硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane)作为固相材料，将其剪切成2.5×30cm规格的条带；；b.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1cm处喷点2mg/mL兔抗HBs-Ag多克隆抗体，2μL/cm，作为检测带；c.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1.5cm处喷点2mg/mL羊抗鼠IgG抗体，2μL/cm，作为质控带；d.37℃烘干2小时，使膜充分干燥；e.点样后的膜在干燥的环境中保存备用；D.吸水垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为吸水垫固相材料，将其剪切成3.0×30cm规格的条带；b.将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸固定于吸水垫从下向上2.0cm处，作为终点指示带；c.吸水垫在干燥的环境中保存备用；(3)免疫层析试纸条检测A.将待检测血清样品用pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液10倍稀释；B.100μL稀释后的样品加于试纸条外壳上的加样孔中；C.待终点指示窗中的终点指示带变为绿色后，便可以用传感器判读外壳上结果判读窗口中的检测带与质控带，以得出结果。
实施例3双抗体夹心检测冠状病毒(SARS病毒)
(1)免疫层析液相材料准备A.UCP-抗体结合物a.利用已建立的表面修饰与活化方法对直径200-300nm的UCP颗粒进行表面修饰，并与纯化的兔抗SARS病毒抗体进行连接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以浓度1mg/mL，4℃保存备用；b.将保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗体结合物6mL，12000r/min，4℃，离心30min，尽量弃尽上清；c.向离心管中的UCP-抗体结合物沉降，加入3mL结合物稀释液(pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液中，含1％蔗糖、1％BSA)涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL UCP-抗体结合物)d.将悬浊液倒入试剂瓶中，4℃保存备用；B.样品垫封闭液a.用天平精确称量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小烧杯中；b.烧杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液20mL，玻璃棒搅拌充分混匀；c.BAS溶液中加入Tween 20(吐温20)20μL，玻璃棒搅拌充分混匀(终浓度5％BAS，0.1％Tween 20)；d.4℃保存备用；C.检测带蛋白a.用天平精确称量纯化的羊抗SARS病毒抗体2mg，置于1.5mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；D.质控带蛋白；a.用天平精确称量纯化的羊抗兔IgG抗体2mg，置于1.5mL微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；(2)免疫层析固相载体材料准备A.样品垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为样品垫固相材料，将其剪切成1.5×30.0cm规格的条带；b.将样品垫放入长形平皿中，样品垫封闭液加于其上，常温浸泡30min；c.将样品垫由封闭液中取出，放于干净的平皿中；d.37℃烘干3小时，使样品垫充分干燥；e.封闭后的样品垫在干燥的环境中保存备用；B.结合垫a.选用玻璃纤维素膜(Glass Fiber)作为结合垫固相材料，将其剪切成1.0×30.0cm规格的条带；b.将4℃保存备用的2mg/mL UCP-抗体结合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，含1％蔗糖、1％BSA)超声10s；c.将结合垫放入长形平皿中，UCP-抗体结合物悬浊液加于其上；d.将结合垫取出放于干净的平皿中；e.37℃烘干2.5小时，使结合垫充分干燥；f.处理后的结合垫在干燥的环境中保存备用；C.分析膜a.以孔径为12μm的硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane)作为固相材料，将其剪切成2.5×30cm规格的条带；；b.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1cm处喷点2mg/mL羊抗SARS病毒抗体，2μL/cm，作为检测带；c.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1.5cm处喷点2mg/mL羊抗兔IgG抗体，2μL/cm，作为质控带；d.37℃烘干2小时，使膜充分干燥；e.点样后的膜在干燥的环境中保存备用；D.吸水垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为吸水垫固相材料，将其剪切成3.0×30cm规格的条带；b.将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸固定于吸水垫从下向上2.0cm处，作为终点指示带；c.吸水垫在干燥的环境中保存备用；
(3)免疫层析试纸条检测A.将待检测血清样品用pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液10倍稀释；B.100μL稀释后的样品加于试纸条外壳上的加样孔中；C.待终点指示窗中的终点指示带变为绿色后，便可以用传感器判读外壳上结果判读窗口中的检测带与质控带，以得出结果。
实施例4鼠疫FI-Ag(鼠疫FI-抗原)检测(1)免疫层析液相材料准备A.UCP-抗体结合物a.利用已建立的表面修饰与活化方法对直径200-300nm的UCP颗粒进行表面修饰，并与纯化的兔抗鼠疫抗体进行连接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以浓度1mg/mL，4℃保存备用；b.将保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗体结合物6mL，12000r/min，4℃，离心30min，尽量弃尽上清；c.向离心管中的UCP-抗体结合物沉降，加入3mL结合物稀释液(pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液中，含1％蔗糖、1％BSA)涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL UCP-抗体结合物)d.将悬浊液倒入试剂瓶中，4℃保存备用；B.样品垫封闭液a.用天平精确称量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小烧杯中；b.烧杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液20mL，玻璃棒搅拌充分混匀；c.BAS溶液中加入Tween20(吐温20)20μL，玻璃棒搅拌充分混匀(终浓度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存备用；C.检测带蛋白a.用天平精确称量鼠疫FI-抗原2mg，置于1.5mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；D.质控带蛋白a.用天平精确称量纯化的羊抗兔IgG抗体2mg，置于1.5mL的微离心管中；
b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；(2)免疫层析固相载体材料准备A.样品垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为样品垫固相材料，将其剪切成1.5×30.0cm规格的条带；b.将样品垫放入长形平皿中，样品垫封闭液加于其上，常温浸泡30min；c.将样品垫由封闭液中取出，放于干净的平皿中；d.37℃烘干3小时，使样品垫充分干燥；e.封闭后的样品垫在干燥的环境中保存备用；B.结合垫a.选用玻璃纤维素膜(Glass Fiber)作为结合垫固相材料，将其剪切成1.0×30.0cm规格的条带；b.将4℃保存备用的2mg/mL UCP-抗体结合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，含1％蔗糖、1％BSA)超声10s；c.将结合垫放入长形平皿中，UCP-抗体结合物悬浊液加于其上；d.将结合垫取出放于干净的平皿中；f.37℃烘干2.5小时，使结合垫充分干燥；g.处理后的结合垫在干燥的环境中保存备用；C.分析膜a.以孔径为12μm的硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane)作为固相材料，将其剪切成2.5×30cm规格的条带；；b.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1cm处喷点2mg/mL鼠疫FI-抗原，2μL/cm，作为检测带；c.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1.5cm处喷点2mg/mL羊抗兔IgG抗体，2μL/cm，作为质控带；d.37℃烘干2小时，使膜充分干燥；e.点样后的膜在干燥的环境中保存备用；
D.吸水垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为吸水垫固相材料，将其剪切成3.0×30cm规格的条带；b.将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸固定于吸水垫从下向上2.0cm处，作为终点指示带；c.吸水垫在干燥的环境中保存备用；(3)免疫层析试纸条检测A.将待检测样品用pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液10倍稀释；B.100μL稀释后的样品加于试纸条外壳上的加样孔中；C.待终点指示窗中的终点指示带变为绿色后，便可以用传感器判读外壳上结果判读窗口中的检测带与质控带，以得出结果。
实施例5违禁药品检测(1)免疫层析液相材料准备A.UCP-抗体结合物a.利用已建立的表面修饰与活化方法对直径200-300nm的UCP颗粒进行表面修饰，并与纯化的兔抗违禁药品抗体或结合配基(违禁药品包括安非他命、甲基安非他命、苯环己哌啶和鸦片酊等药物分子)进行连接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以浓度1mg/mL，4℃保存备用；b.将保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗体结合物6mL，12000r/min，4℃，离心30min，尽量弃尽上清；c.向离心管中的UCP-抗体结合物沉降，加入3mL结合物稀释液(pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液中，含1％蔗糖、1％BSA)涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL UCP-抗体结合物)d.将悬浊液倒入试剂瓶中，4℃保存备用；B.样品垫封闭液a.用天平精确称量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小烧杯中；b.烧杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液20mL，玻璃棒搅拌充分混匀；c.BAS溶液中加入Tween 20(吐温20)20μL，玻璃棒搅拌充分混匀(终浓度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存备用；
C.检测带蛋白a.用天平精确称量BSA-违禁药品分子复合物2mg，置于1.5mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；D.质控带蛋白a.用天平精确称量纯化的羊抗兔IgG抗体2mg，置于1.5mL微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；(2)免疫层析固相载体材料准备A.样品垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为样品垫固相材料，将其剪切成1.5×30.0cm规格的条带；b.将样品垫放入长形平皿中，样品垫封闭液加于其上，常温浸泡30min；c.将样品垫由封闭液中取出，放于干净的平皿中；d.37℃烘干3小时，使样品垫充分干燥；e.封闭后的样品垫在干燥的环境中保存备用；B.结合垫a.选用玻璃纤维素膜(Glass Fiber)作为结合垫固相材料，将其剪切成1.0×30.0cm规格的条带；b.将4℃保存备用的2mg/mL UCP-抗体结合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，含1％蔗糖、1％BSA)超声10s；c.将结合垫放入长形平皿中，UCP-抗体结合物悬浊液加于其上；d.将结合垫取出放于干净的平皿中；e.37℃烘干2.5小时，使结合垫充分干燥；f.处理后的结合垫在干燥的环境中保存备用；C.分析膜a.以孔径为12μm的硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane)作为固相材料，将其剪切成2.5×30cm规格的条带；；b.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1cm处喷点2mg/mL BSA-违禁药品分子复合物，2μL/cm，作为检测带；c.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1.5cm处喷点2mg/mL羊抗兔IgG抗体，2μL/cm，作为质控带；d.37℃烘干2小时，使膜充分干燥；e.点样后的膜在干燥的环境中保存备用；D.吸水垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为吸水垫固相材料，将其剪切成3.0×30cm规格的条带；b.将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸固定于吸水垫从下向上2.0cm处，作为终点指示带；c.吸水垫在干燥的环境中保存备用；(3)免疫层析试纸条检测A.将待检测样品用pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液10倍稀释；B.100μL稀释后的样品加于试纸条外壳上的加样孔中；C.待终点指示窗中的终点指示带变为绿色后，便可以用传感器判读外壳上结果判读窗口中的检测带与质控带，以得出结果。
实施例6鼠疫感染抗体检测(1)免疫层析液相材料准备A.UCP-SPA结合物a.利用已建立的表面修饰与活化方法对直径200-300nm的UCP颗粒进行表面修饰，并与SPA(葡萄球菌蛋白A)进行连接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以浓度1mg/mL，4℃保存备用；b.将保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-SPA结合物6mL，12000r/min，4℃，离心30min，尽量弃尽上清；c.向离心管中的UCP-SPA结合物沉降，加入3mL结合物稀释液(pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液中，含1％蔗糖、1％BSA)涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL UCP-SPA结合物)d.将悬浊液倒入试剂瓶中，4℃保存备用；
B.样品垫封闭液a.用天平精确称量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小烧杯中；b.烧杯中加入pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液20mL，玻璃棒搅拌充分混匀；c.BAS溶液中加入Tween20(吐温20)20μL，玻璃棒搅拌充分混匀(终浓度5％BAS，0.1％Tween 20)；d.4℃保存备用；C.检测带蛋白a.用天平精确称量鼠疫FI-Ag(鼠疫FI-Ag)2mg，置于1.5mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL鼠疫FI-Ag)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；D.质控带蛋白a.用天平精确称量羊IgG 2mg，置于1mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL羊IgG)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；(2)免疫层析固相载体材料准备A.样品垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为样品垫固相材料，将其剪切成1.5×30.0cm规格的条带；b.将样品垫放入长形平皿中，样品垫封闭液加于其上，常温浸泡30min；c.将样品垫由封闭液中取出，放于干净的平皿中；d.37℃烘干3小时，使样品垫充分干燥；e.封闭后的样品垫在干燥的环境中保存备用；B.结合垫a.选用玻璃纤维素膜(Glass Fiber)作为结合垫固相材料，将其剪切成1.0×30.0cm规格的条带；b.将4℃保存备用的2mg/mL UCP-SPA(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，含1％蔗糖、1％BSA)超声10s；
c.将结合垫放入长形平皿中，UCP-SPA结合物悬浊液加于其上；d.将结合垫取出放于干净的平皿中；e.37℃烘干2.5小时，使结合垫充分干燥；f.处理后的结合垫在干燥的环境中保存备用；C.分析膜a.以孔径为12μm的硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane)作为固相材料，将其剪切成2.5×30cm规格的条带；；b.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1cm处喷点2mg/mL鼠疫F1-Ag，2μL/cm，作为检测带；c.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1.5cm处喷点2mg/mL羊IgG，2μL/cm，作为质控带；d.37℃烘干2小时，使膜充分干燥；e.点样后的膜在干燥的环境中保存备用；D.吸水垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为吸水垫固相材料，将其剪切成3.0×30cm规格的条带；b.将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸固定于吸水垫从下向上2.0cm处，作为终点指示带；c.吸水垫在干燥的环境中保存备用；(3)免疫层析试纸条检测A.待检测血清样品用pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液10倍稀释；B.100μL稀释后的样品加于试纸条外壳上的加样孔中；C.待终点指示窗中的终点指示带变为绿色后，便可以用传感器判读外壳上结果判读窗口中的检测带与质控带，以得出结果。
实施例7SARS病毒感染抗体检测(1)免疫层析液相材料准备A.UCP-SPA结合物a.利用已建立的表面修饰与活化方法对直径200-300nm的UCP颗粒进行表面修饰，并与SPA(葡萄球菌蛋白A)进行连接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以浓度1mg/mL，4℃保存备用；b.将保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-SPA结合物6mL，12000r/min，4℃，离心30min，尽量弃尽上清；c.向离心管中的UCP-SPA结合物沉降，加入3mL结合物稀释液(pH＝7.2 0.03mol/LPB缓冲液中，含1％蔗糖、1％BSA)涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL UCP-SPA结合物)d.将悬浊液倒入试剂瓶中，4℃保存备用；B.样品垫封闭液a.用天平精确称量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小烧杯中；b.烧杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液20mL，玻璃棒搅拌充分混匀；c.BAS溶液中加入Tween 20(吐温20)20μL，玻璃棒搅拌充分混匀(终浓度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存备用；C.检测带蛋白a.用天平精确称量纯化的SARS病毒表面N蛋白2mg，置于1.5mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL SARS病毒表面N抗原)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；D.质控带蛋白a.用天平精确称量纯化的羊IgG 2mg，置于1mL的微离心管中；b.微离心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，涡旋充分混匀(终浓度2mg/mL羊IgG)；c.分装为50μL每管，-20℃冻存备用；(2)免疫层析固相载体材料准备A.样品垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为样品垫固相材料，将其剪切成1.5×30.0cm规格的条带；b.将样品垫放入长形平皿中，样品垫封闭液加于其上，常温浸泡30min；c.将样品垫由封闭液中取出，放于干净的平皿中；d.37℃烘干3小时，使样品垫充分干燥；
e.封闭后的样品垫在干燥的环境中保存备用；B.结合垫a.选用玻璃纤维素膜(Glass Fiber)作为结合垫固相材料，将其剪切成1.0×30.0cm规格的条带；b.将4℃保存备用的2mg/mL UCP-SPA结合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液，含1％蔗糖、1％BSA)超声10s；c.将结合垫放入长形平皿中，UCP-SPA结合物悬浊液加于其上；d.将结合垫取出放于干净的平皿中；e.37℃烘干2.5小时，使结合垫充分干燥；f.处理后的结合垫在干燥的环境中保存备用；C.分析膜a.以孔径为12μm的硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane)作为固相材料，将其剪切成2.5×30cm规格的条带；b.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1cm处喷点2mg/mL SARS病毒表面N蛋白，2μL/cm，作为检测带；c.用点样仪在2.5cm宽的膜上，从下向上1.5cm处喷点2mg/mL羊IgG，2μL/cm，作为质控带；d.37℃烘干2小时，使膜充分干燥；e.点样后的膜在干燥的环境中保存备用；D.吸水垫a.选用纤维素膜(Cellulose Membrane)作为吸水垫固相材料，将其剪切成3.0×30cm规格的条带；b.将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸固定于吸水垫从下向上2.0cm处，作为终点指示带；c.吸水垫在干燥的环境中保存备用；(3)免疫层析试纸条检测A.将待检测血清样品用pH＝7.2 0.03mol/L PB缓冲液10倍稀释；B.100μL稀释后的样品加于试纸条外壳上的加样孔中；C.待终点指示窗中的终点指示带变为绿色后，便可以用传感器判读外壳上结果判读窗口中的检测带与质控带，以得出结果。
上述实施例有助于理解本发明，但是并不是对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以根据上述实施例对本发明作出适当的修改和变动，均属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种可以对基于上转换发光技术免疫层析试纸进行结果判读的上转换发光生物传感器，包含激发光路、磷光图像接收光路和图像处理系统，其特征在于所述的激发光路由红外激发光源和一维聚焦镜组成；所述的磷光图像接收光路包括成像物镜、滤光片和图像接收器。
2.如权利要求1所述的上转换发光生物传感器，其中所述的激发光路与磷光图像接收光路分置于试纸条两侧，两者的光轴与试纸条法线之间各存在一个夹角，而且两个夹角是不相等的。
3.如权利要求1所述的上转换发光生物传感器，其中所述的一维聚焦镜将红外激发光源发出的光束变换成一条高强度的焦线，且焦线方向与试纸条的长边一致，从而将试纸条上的各功能带全部照明。
4.如权利要求1所述的上转换发光生物传感器，其中所述的磷光图像接收光路中的成像物镜由前镜组和后镜组组成，在两个镜组中间安装了滤光片。
5.如权利要求1所述的上转换发光生物传感器，其中所述的图像处理系统可以分析、保存磷光图像，给出判读结果。
6.如权利要求1所述的上转换发光生物传感器在对病原体、抗原、抗体、违禁药品、重大疾病标志物的定性定量检测方面的用途。
7.如权利要求1所述的上转换发光生物传感器在对基于上转换发光技术免疫层析试纸进行定量结果判读方面的用途。
全文摘要
本发明公开了一种上转换发光生物传感器，其包含激发光路、磷光图像接收光路、图像处理系统，该生物传感器可对基于上转换发光技术免疫层析试纸进行结果判读，从而实现对病原体、抗原、抗体、违禁药品、重大疾病(肿瘤、癌症和糖尿病等)标志物等多种目标被检物的定性定量以及多重检测。
文档编号G01N21/64GK1690693SQ20041003410
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月23日 优先权日2004年4月23日
发明者黄惠杰, 周蕾, 赵永凯, 杨瑞馥, 黄立华, 王津, 卢健, 郭兆彪, 郑岩, 侯秀杰 申请人:中国科学院上海光学精密机械研究所
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