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专利名称：一种检测植物产生免疫反应的方法
技术领域：
本发明属于植物保护和生物技术领域，尤其涉及一种检测植物产生免疫反应的方法。
背景技术：
植物自身的先天免疫机制能有效抵御致病微生物的入侵。当感病植物受到病原菌特异小种侵染时，植物自身的免疫机制不能被激活，最终导致病害发生。植物通常通过两套防御机制抵御病原微生物入侵，第一套是通用机制，第二套是抵御病原菌特异小种的机制。植物通用防御机制是病原相关分子模式激发的免疫机制，即PTI (PAMP-triggeredimmunity) 0 PTI是通过寄主胞外表面受体识别病原相关分子模式而激活，是发生在寄主与病原菌互作早期的免疫反应。植物对病原相关分子模式的识别可引发寄主一系列的生理反应，诸如①H+、K+、C1+和Ca2+离子流的产生，其中Ca2+离子流增加是植物免疫反应关键的一步；②活性氧爆发；③从丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)到防御相关基因表达，MAPKs参与了植物防御反应。在PTI过程中，MAPK联级的激活使得WRKY型的转录因子表达，而这类转录因子是植物防御反应的关键调控因子；④胼胝质产生，细胞壁与细胞膜间沉积的胼胝质是PTI响应时的一个典型标志；⑤荷尔蒙，SA、JA和ET是防御反应过程中比较典型的植物荷尔蒙。⑥气孔关闭；⑦基因沉默。因此，通过检测活性氧爆发和胼胝质沉积可以确定植物是否产生免疫反应。

发明内容
本发明提供了一种检测植物产生免疫反应的方法，旨在解决现有技术提供的检测植物产生免疫反应的方法，过程复杂、准确率低、实用性差的问题。本发明的目的在于提供一种检测植物产生免疫反应的方法，保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质和活性氧观察方法不变，包括原核表达技术、蛋白纯化技术、DAB染色方法、苯胺蓝染色方法均与常规相同，该方法还包括以下步骤采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理水稻持有不同抗性基因的24个水稻单基因系品种及根组织和叶鞘；24小时后进行DAB染色和苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧的形成情况，通过胼胝质和活性氧的形成情况判断植物是否产生免疫反应。进一步，当观察到胼胝质和活性氧形成时，则说明植物产生了免疫反应；当未观察到胼胝质和活性氧形成时，则说明植物未产生免疫反应。进一步，获得一个能够引起多个持有不同抗性基因的水稻单基因系品种和感病品种丽江新团黑谷产生免疫反应的稻瘟病菌蛋白。本发明提供的检测植物产生免疫反应的方法，保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质和活性氧观察方法不变，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理水稻持有不同抗性基因的24个水稻单基因系品种及根组织和叶鞘；24小时后进行DAB染色和苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧的形成情况，通过胼胝质和活性氧的形成情况判断植物是否产生免疫反应，该方法利用纯化的效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织，通过荧光显微镜观察根组织胼胝质和活性氧产生，能直接获得水稻产生免疫反应情况，简便、准确、快速，同时获得一个能够引起多个持有不同抗性基因的水稻单基因系品种和感病品种丽江新团黑谷产生免疫反应的稻瘟病菌蛋白，具有较强的推广与应用价值。


图1是本发明实施例提供的检测植物产生免疫反应的方法的实现流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。图1示出了本发明实施例提供的检测植物产生免疫反应的方法的实现流程。本发明的目的在于提供一种检测植物产生免疫反应的方法，保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质和活性氧观察方法不变，包括原核表达技术、蛋白纯化技术、DAB染色方法、苯胺蓝染色方法均与常规相同，该方法还包括以下步骤在步骤SlOl中，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理水稻持有不同抗性基因的24个水稻单基因系品种及根组织和叶鞘；在步骤S102中，24小时后进行DAB染色和苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧的形成情况，通过胼胝质和活性氧的形成情况判断植物是否产生免疫反应。在本发明实施例中，当观察到胼胝质和活性氧形成时，则说明植物产生了免疫反应；当未观察到胼胝质和活性氧形成时，则说明植物未产生免疫反应。在本发明实施例中，获得一个能够引起多个持有不同抗性基因的水稻单基因系品种和感病品种丽江新团黑谷产生免疫反应的稻瘟病菌蛋白。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。实施例一5. Omg/ml的融合蛋白处理水稻根组织和叶鞘24h，苯胺蓝染色后直接观察胼胝质以及DAB染色观察活性氧产生。将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4 ；200mM NaCl ；ImM EDTA ；10mM β-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照5. Omg/ml的浓度处理24个持有不同抗性基因的水稻单基因系的根组织和叶鞘24h，苯胺蓝直接染色和DAB染色后观察胼胝质和活性氧产生。结果见表发现，24个水稻品种均有不同程度的胼胝质沉积和活性氧产生。实施例二 5. Omg/ml的融合蛋白处理水稻根组织和叶鞘24h，苯胺蓝染色后直接观察胼胝质以及DAB染色观察活性氧产生。
将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ；10mM β-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照5. Omg/ml的浓度处理感病水稻品种的根组织和叶鞘24h，苯胺蓝直接染色和DAB染色后观察胼胝质和活性氧产生。结果见表发现，感病水稻品种丽江新团黑谷均有不同程度的胼胝质沉积和活性氧产生。本发明的目的是克服现有技术之不足，而提供一种快速、简便、准确的用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物处理水稻叶片和根组织观察胼胝质和活性氧产生以确定植物产生免疫反应，继而进一步确定能够广泛引起水稻免疫反应产生的稻瘟病菌蛋白。本发明的技术方案是保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质和活性氧观察方法不变，包括原核表达技术、蛋白纯化技术、DAB染色方法、苯胺蓝染色方法均与常规相同，其特征是用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理水稻持有不同抗性基因的24个水稻单基因系品种及丽江新团黑谷根组织和叶鞘24h后进行DAB染色和苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧形成。本发明的有益效果在于1、方法简便、准确、快速。2、利用纯化的效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织，通过荧光显微镜观察根组织胼胝质和活性氧产生，能直接获得水稻产生免疫反应情况。

3、获得一个能够引起多个持有不同抗性基因的水稻单基因系品种和感病品种丽江新团黑谷产生免疫反应的稻瘟病菌蛋白。本发明实施例提供的检测植物产生免疫反应的方法，保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质和活性氧观察方法不变，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理水稻持有不同抗性基因的24个水稻单基因系品种及根组织和叶鞘；24小时后进行DAB染色和苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧的形成情况，通过胼胝质和活性氧的形成情况判断植物是否产生免疫反应，该方法利用纯化的效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织，通过荧光显微镜观察根组织胼胝质和活性氧产生，能直接获得水稻产生免疫反应情况，简便、准确、快速，同时获得一个能够引起多个持有不同抗性基因的水稻单基因系品种和感病品种丽江新团黑谷产生免疫反应的稻瘟病菌蛋白，具有较强的推广与应用价值。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种检测植物产生免疫反应的方法，保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质和活性氧观察方法不变，包括原核表达技术、蛋白纯化技术、DAB染色方法、苯胺蓝染色方法均与常规相同，其特征在于，该方法还包括以下步骤 采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理水稻持有不同抗性基因的24个水稻单基因系品种及根组织和叶鞘； 24小时后进行DAB染色和苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧的形成情况，通过胼胝质和活性氧的形成情况判断植物是否产生免疫反应。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当观察到胼胝质和活性氧形成时，则说明植物产生了免疫反应；当未观察到胼胝质和活性氧形成时，则说明植物未产生免疫反应。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，获得一个能够引起多个持有不同抗性基因的水稻单基因系品种和感病品种I 江新团黑谷广生免疫反应的稻痕病囷蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种检测植物产生免疫反应的方法，保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质和活性氧观察方法不变，采用稻瘟病菌蛋白基因的原核表达产物，按照5.0mg/ml浓度处理水稻持有不同抗性基因的24个水稻单基因系品种及根组织和叶鞘；24小时后进行DAB染色和苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧的形成情况，通过胼胝质和活性氧的形成情况判断植物是否产生免疫反应，该方法利用纯化的效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织，通过荧光显微镜观察根组织胼胝质和活性氧产生，能直接获得水稻产生免疫反应情况，同时获得能引起多个持有不同抗性基因的水稻单基因系品种和感病品种产生免疫反应的稻瘟病菌蛋白。
文档编号G01N21/64GK103048302SQ20121055469
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者杨静, 李成云, 刘林, 朱有勇, 徐畅, 施竹凤 申请人:云南农业大学