专利名称：一种将生物样品制备成扫描电镜样品的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备电镜样品的方法，具体地，涉及一种将生物样品制备成扫描电镜样品的方法。
背景技术：
采用合适的标记物可以实现生物样品中蛋白分子的扫描电子显微镜成像，这种纳米尺度的高分辨成像可以为更好的分析生物样品中蛋白分子的分布与相互作用提供有力的工具。选择标记物的制备扫描电镜样品，对于基于免疫反应的扫描电子显微镜成像效果
至关重要。作为扫描电子显微镜的标记物需要具有以下的特点(I)具有很好二次电子成像
(2)与样品的非特异性吸附较少(3)易于通过特异性的修饰与抗体结合(4)在生理环境中稳定。金纳米颗粒由于其形貌可控，化学稳定性好，易于修饰，生物相容性好，二次电子效率高等特点，使得金纳米颗粒成为扫描电子显微镜的合适的标记物，尤其是50-100nm的金纳米颗粒被广泛应用在免疫扫描电镜中。为了同时对两种或两种以上的蛋白分子进行扫描电镜观测，人们会选择两种不同的标记物对各自的靶标蛋白分子进行标记，以制备扫描电镜样品用于观测。已有文献(Histochemical Journal 1990, 22,18.)记载了分别用大小不同的两种金纳米颗粒作为标记物通过抗体各自对B细胞和T细胞进行了标记，实现了同时对B细胞和T细胞进行扫描电镜的观察。但是已有的方法均是采用形貌相同的金纳米颗粒进行标记以制备扫描电镜样品，这使得在扫描电镜低真空模式下观察时，不同靶标间的差异只能通过颗粒大小的差异进行判断，因此观察的精确度不高。
发明内容
为了克服现有的制备扫描电镜样品的方法中低真空模式下观察的精确度不高的不足，本发明提供了一种将生物样品制备成扫描电镜样品的方法，所述生物样品中含有第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白和第二蛋白不同；该方法包括如下步骤(I)使抗第一蛋白的抗体和抗第二蛋白的抗体分别或同时与所述生物样品进行第一接触，第一接触的条件使得抗第一蛋白的抗体与第一蛋白特异结合，抗第二蛋白的抗体与第二蛋白特异结合，得到一抗处理后的生物样品；(2)使标记有第一金纳米颗粒的第一抗体和标记有第二金纳米颗粒的第二抗体分别或同时与所述一抗处理后的生物样品进行第二接触，第二接触的条件使得标记有第一金纳米颗粒的第一抗体与和第一蛋白结合的抗第一蛋白的抗体特异结合，标记有第二金纳米颗粒的第二抗体与和第二蛋白结合的抗第二蛋白的抗体特异结合，得到二抗处理后的生物样品；(3)将该二抗处理后的生物样品依次进行固定、梯度脱水和临界点干燥；
其中，所述第一金纳米颗粒的形状与所述第二金纳米颗粒的形状不同，且所述第一金纳米颗粒与所述第二金纳米颗粒选自圆柱状金纳米棒、八面体状金纳米颗粒、球型金纳米颗粒和箭头状金纳米颗粒中的一种或多种。通过本发明提供的方法，制得的扫描电镜样品可以低真空模式下精确地区分两种不同的蛋白分子。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
图I是实施例I得到的低真空模式下扫描电镜样品的扫描电镜照片。 图2是图I的局部放大后的图像。图3是高真空模式下圆柱状金纳米棒(图3a)和八面体状金纳米颗粒(图3b)的扫描电镜照片。图4是对比例I得到的低真空模式下扫描电镜照片。
具体实施例方式本发明提供了一种将生物样品制备成扫描电镜样品的方法，所述生物样品中含有第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白和第二蛋白不同；该方法包括如下步骤(I)使抗第一蛋白的抗体和抗第二蛋白的抗体分别或同时与所述生物样品进行第一接触，第一接触的条件使得抗第一蛋白的抗体与第一蛋白特异结合，抗第二蛋白的抗体与第二蛋白特异结合，得到一抗处理后的生物样品；(2)使标记有第一金纳米颗粒的第一抗体和标记有第二金纳米颗粒的第二抗体分别或同时与所述一抗处理后的生物样品进行第二接触，第二接触的条件使得标记有第一金纳米颗粒的第一抗体与和第一蛋白结合的抗第一蛋白的抗体特异结合，标记有第二金纳米颗粒的第二抗体与和第二蛋白结合的抗第二蛋白的抗体特异结合，得到二抗处理后的生物样品；(3)将该二抗处理后的生物样品依次进行固定、梯度脱水和临界点干燥；其中，所述第一金纳米颗粒的形状与所述第二金纳米颗粒的形状不同，且所述第一金纳米颗粒与所述第二金纳米颗粒选自圆柱状金纳米棒、八面体状金纳米颗粒、球型金纳米颗�：图纷唇鹉擅卓帕Ｖ械囊恢只蚨嘀�。需要说明的是，如本领域公知，本发明中的“特异结合”是指结合者在其被结合者所出现的体系中仅特异地选择结合唯一的被结合者。具体地，例如，“抗第一蛋白的抗体与第一蛋白特异结合”是指在抗第一蛋白的抗体在第一蛋白存在的生物样品中，抗第一蛋白的抗体与仅特异地选择第一蛋白作为被结合者来结合；同样地，“标记有第一金纳米颗粒的第一抗体与和第一蛋白结合的抗第一蛋白的抗体特异结合”是指在和第一蛋白结合的抗第一蛋白的抗体存在的一抗处理后的生物样品中，标记有第一金纳米颗粒的第一抗体仅特异地选择和第一蛋白结合的抗第一蛋白的抗体作为被结合者来结合。根据本发明的方法，其中，第一金纳米颗�：偷诙鹉擅卓帕５难≡衩挥刑乇鸬匾螅耸沟弥频玫纳璧缇笛房梢跃返厍至街植煌牡鞍追肿樱叛∏榭鱿拢龅谝唤鹉擅卓帕；蛩龅诙鹉擅卓帕Ｎ仓唇鹉擅装簦龅诙鹉擅卓帕；蛩龅谝唤鹉擅卓帕Ｏ嘤Φ匚嗣嫣褰鹉擅卓帕！８荼痉⒚鞯姆椒ǎ渲校谝唤鹉擅卓帕：偷诙鹉擅卓帕５拇笮∶挥刑乇鸬匾螅耸沟弥频玫纳璧缇笛房梢跃返厍至街植煌牡鞍追肿樱叛∏榭鱿拢鲈仓唇鹉擅装舻闹本段�13-20nm，进一步优选为15_18nm，长为50_80nm，进一步优选为60_70nm,所述八面体金纳米颗粒的边长为40-80nm,进一步优选为50_70nm。根据本发明的方法，其中，所述第一接触的条件没有特别地要求，可以为免疫电镜技术常规的条件，例如(细胞生物学杂志(The Journal of Cell Biology)，1984，99卷，53页)文献中所述的条件，为了使得制得的扫描电镜样品可以精确地区分两种不同的蛋白分子，优选情况下，所述第一接触的条件包括相对于每毫克的生物样品，抗第一蛋白的抗体或抗第二蛋白的抗体的用量为40-400微克，进一步优选为100-300微克；接触的温度为35-37°C，进一步优选为37°C ;接触的时间为50-120分钟，进一步优选为60分钟。根据本发明的方法的一种优选实施方式，所述第一接触在浓度为0. 5-2重量％的牛血清白蛋白存在下进行。 根据本发明的方法，其中，所述第二接触的条件没有特别地要求，可以为免疫电镜技术常规的条件，例如(细胞生物学杂志(The Journal of Cell Biology)，1984，99卷，53页)文献中所述的条件，为了使得制得的扫描电镜样品可以精确地区分两种不同的蛋白分子，优选情况下，所述第二接触的条件包括相对于每毫克的生物样品，标记有第一金纳米颗粒的第一抗体或标记有第二金纳米颗粒的第二抗体的使用量为100-800微克，进一步优选为200-600微克；接触的温度为35-37°C，进一步优选为37°C ;接触的时间为50-120分钟，进一步优选为60分钟。根据本发明的方法的一种优选实施方式，所述方法还包括在进行所述第一接触前，将所述生物样品先后进行预固定和封闭，得到封闭后的生物样品，并将得到的封闭后的生物样品代替步骤(I)中的生物样品进行步骤(I)至(3)的操作；所述预固定的方法包括将所述生物样品与预固定剂在预固定条件下接触，得到预固定后的生物样品，所述预固定剂为浓度为1-5重量％的戊二醛和/或甲醛水溶液；所述预固定条件包括温度为4-30°C，时间为20-50分钟；所述封闭的方法包括将得到的预固定后的生物样品在封闭条件下与封闭剂接触，得到封闭后的生物样品，所述封闭剂为浓度为100-200mM的甘氨酸水溶液；所述封闭的条件包括温度为35-37°C，时间为10-30分钟。其中，所述预固定剂和封闭剂的用量没有限制，只要是能浸没样品即可。根据本发明的方法，其中，所述生物样品可以为任何生物体来源的样品，优选情况下，本发明的方法特别适合用于选自病毒、细菌、真菌细胞、动物细胞和植物细胞中的一种或多种的生物样品。优选地，所述生物样品为动物细胞，并且所述第一蛋白和所述第二蛋白定位于所述动物细胞的质膜的外表面上，即在所述动物细胞的质膜的外表面上分布有所述第一蛋白和所述第二蛋白。根据本发明的方法，其中，所述固定、梯度脱水和临界点干燥的方法均没有特别的要求，可以为免疫电镜技术常规的方法，例如文献(细胞生物学杂志(The Journal of CellBiology)，1984,99卷，53页)中所述的方法，为了使得制得的扫描电镜样品可以精确地区分两种不同的蛋白分子，优选情况下，所述固定的方法包括将所述二抗处理后的生物样品在固定条件下与固定剂接触，得到固定后的生物样品；所述固定剂为浓度为1-5重量％的戊二醛和/或甲醛水溶液；所述固定条件包括固定温度为4-30°C，固定时间为10-20小时；所述梯度脱水的方法包括将所述固定后的生物样品在脱水条件下依次与脱水能力依次升高的脱水剂进行一至多次接触，得到脱水后的生物样品；所述脱水能力依次升高的脱水剂为浓度依次升高的乙醇水溶液和无水乙醇；所述脱水条件包括脱水温度为20-30°C，每次脱水的时间为10-20分钟；所述临界点干燥的方法包括将脱水后的生物样品与干燥介质接触，然后在所述干燥介质的临界态条件下去除干燥介质；所述干燥介质为液态二氧化碳；液态二氧化碳的临界态条件包括温度为30-40°C，压力为7-10MPa。临界点干燥后，得到的干燥后的生物样品即可作为低真空模式下观察的扫描电镜样品。需要说明的是，本发明中的生物样品可以根据电子显微镜观察的需要自行确定， 同样的，所述生物样品中的第一蛋白和第二蛋白也可以根据电子显微镜观察的需要自行确定。根据本发明的方法，其中，如免疫电镜领域所公知，所述的抗体可以是单抗和/或多抗，其物种来源可以为小鼠、大鼠、兔、牛、马、羊和鸡等常规物种，其获得途径可以为商购获得或自行免疫获得，本发明在此不再赘述。根据本发明的方法，其中，如免疫电镜领域所公知，所述标记有第一金纳米颗粒的第一抗体和所述标记有第二金纳米颗粒的第二抗体中，所述的第一抗体和第二抗体能够分别与抗第一蛋白的抗体和抗第二蛋白的抗体特异结合，优选地分别与抗第一蛋白的抗体的Fe段和抗第二蛋白的抗体的Fe段特异结合。如免疫电镜领域所公知，满足上述要求的一种优选方式为所述抗第一蛋白的抗体和所述抗第二蛋白的抗体分别为来自不同物种的抗体，所述的第一抗体为能与抗第一蛋白的抗体所来源的物种产生的抗体的Fe段特异结合，所述的第二抗体为能与抗第二蛋白的抗体所来源的物种产生的抗体的Fe段特异结合，所述第一抗体所来源的物种和所述第二抗体所来源的物种可以相同或不同，并且与所述抗第一蛋白的抗体所来源的物种和所述抗第二蛋白的抗体所来源的物种各不相同。根据本发明的方法，如本领域所公知，所述标记有第一金纳米颗粒的第一抗体和所述标记有第二金纳米颗粒的第二抗体的获得方式没有特别的要求，可以通过商购获得(例如可以从北京中杉金桥生物技术有限公司定制购买)，也可以根据文献中的方法自行制备，优选地，可以按照如下步骤进行制备(I)制备金晶种溶液向浓度为0. 05-0. 2M的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入浓度为15-30mM的四氯金酸水溶液；然后在搅拌条件下再加入浓度为0. 005-0. 02mM的硼氢化钠水溶液，制得第一混合溶液，使得所述第一混合溶液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸和硼氢化钠的物质的量配比为0. 5-1 0. 001-0. 004 0.004-0. 008 ;继续搅拌第一混合溶液2-10分钟，然后静置2-5小时，得到含有金晶种的金晶种溶液；所述金晶种溶液中金浓度为0. 1-0. 5mM ；(2)制备圆柱状金纳米棒溶液向浓度为0. 05-0. 2M的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中依次加入浓度为15_30mM的四氯金酸水溶液、浓度为5-15mM的硝酸银水溶液和浓度为0. I-IM的硫酸水溶液,混合均匀后再加入浓度为0.05-0. 15M的抗坏血酸水溶液，然后再向其中加入步骤(I)制备的金晶种溶液，制得第二混合溶液；使得所述第二混合溶液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸、硝酸银、硫酸、抗坏血酸与金晶种的物质的量配比为3-7 0.01-0.05 0.005-0.01 0.25-0.75 0.02-0.06 0. 00001-0. 00002 ;再将所述第二混合溶液置入20_40°C下 12-16 小时，得到含圆柱状金纳米棒的圆柱状金纳米棒溶液；(3)纯化圆柱状金纳米棒溶液将步骤(2)制备的圆柱状金纳米棒溶液经离心分离，得到纯化的圆柱状金纳米棒溶液，并在离心后弃去上清液，之后向其内加入去离子水超声分散制得纯化的圆柱状金纳米棒溶液，并通过控制加入的去离子水的量调整使圆柱状金纳米棒溶液中的金浓度为0. 25-0. 75mM ；(4)将纯化后的圆柱状金纳米棒包覆聚苯乙烯磺酸钠(PSS)
将步骤(3)制备得到的圆柱状金纳米棒溶液在8000_12000g的转速下离心分离5-15分钟，弃去离心分离后的上清液，向沉淀中加入与上清液等体积的聚苯乙烯磺酸钠溶液；所选聚苯乙烯磺酸钠溶液的浓度为l_4mg/mL(溶液中含有4-8mMNaCl);将该溶液在超声清洗器中超声10-20分钟，然后静置1-5小时即得到聚苯乙烯磺酸钠包覆的圆柱状金纳米棒的溶液；其中聚苯乙烯磺酸钠的厚度为0. 5-7nm。(5)将聚苯乙烯磺酸钠包覆的圆柱状金纳米棒标记第一抗体或第二抗体将步骤⑷制备得到的聚苯乙烯磺酸钠包覆的圆柱状金纳米棒溶液在8000-12000g的转速下离心分离5-15分钟，弃去离心分离后的上清液，向沉淀中加入原来上清液体积一半的5-15mM的pH值为7. 0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液；将该溶液在超声清洗器中超声5-15分钟。将第一抗体或第二抗体用4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液(5-15mM)进行稀释，制得浓度为2-20 u g/ml的第一抗体稀释液或第二抗体稀释液。将等体积的上述溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的圆柱状金纳米棒溶液与第一抗体稀释液或第二抗体稀释液进行充分混合，在4°C下维持10-20小时，制得标记有圆柱状金纳米棒的第一抗体或标记有圆柱状金纳米棒的第二抗体。(6)制备八面体状金纳米颗粒将步骤(3)经纯化的圆柱状金纳米棒溶液与浓度为0. 05-0. 2mM的十六烷基三甲基溴化铵水溶液、浓度为15-30mM的四氯金酸水溶液和浓度为5-15mM的硝酸银水溶液混合均匀，再加入浓度为0. 05-0. 15mM的抗坏血酸水溶液得到第三混合溶液，使得所述第三混合溶液中的十六烷基三甲基溴化铵、抗坏血酸、四氯金酸溶液中的金离子、硝酸银水溶液中的银离子的质量与圆柱状金纳米棒物质的量的配比为300-500 25-32 2. 5-3. 2 2.5-3.2 0. 8-1. 2 ；将上述混合均匀的第三混合溶液置于20_40°C下8-15小时后，得到含八面体状金纳米颗粒的溶液；(7)纯化八面体状金纳米颗粒溶液将步骤(6)制备的八面体状金纳米颗粒溶液经离心分离，得到纯化的八面体状金纳米颗粒溶液，之后向其内加入去离子水超声分散制得纯化的八面体状金纳米颗粒溶液，并通过控制加入的去离子水的量调整使八面体状金纳米颗粒溶液中的金浓度为0. 25-0. 75mM ；(8)将纯化后的八面体状金纳米颗粒包覆聚苯乙烯磺酸钠(PSS)进行包覆将步骤(7)中制备的八面体状金纳米颗粒溶液进行步骤(4)的操作，制备得到聚苯乙烯磺酸钠包覆的八面体状金纳米颗粒溶液。(9)将聚苯乙烯磺酸钠包覆的八面体状金纳米颗粒标记第一抗体或第二抗体使用与步骤(5)相同的过程，不同的是将聚苯乙烯磺酸钠包覆的圆柱状金纳米棒溶液换成步骤(8)中的聚苯乙烯磺酸钠包覆的八面体状金纳米颗粒溶液；得到标记有八面体状金纳米颗粒的第一抗体或标记八面体状金纳米颗粒的第二抗体。根据本发明的方法，优选情况下，按投料比计算，标记有第一金纳米颗粒的第一抗体或标记有第二金纳米颗粒的第二抗体中，第一金纳米颗粒或第二金纳米颗粒与第一抗体或第二抗体的摩尔比为50-150 1，进一步优选为80-120 I。 需要说明的是，本发明中的术语“溶液”指被分散物质的粒径为IOOnm以下的分散体系。以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明的范围不限于以下实施例中制备例I本制备例用于说明制备标记有第一金纳米颗粒的第一抗体和标记有第二金纳米颗粒的第二抗体的方法。I、配制如下溶液(I) 0. IM十六烷基三甲基溴化铵(C19H42N+Br_，以下简称CTAB)水溶液；称取3. 64g十六烷基三甲基溴化铵(分析纯)溶于IOOmL去离子水中；在使用前应置于30°C恒温水浴使其完全溶解，制得0. IM十六烷基三甲基溴化铵(C19H42N+Bf，以下简称CTAB)水溶液；(2) 0. IM抗坏血酸水溶液(AA)水溶液称取0. 176g抗坏血酸(分析纯)溶于IOmL去离子水中，制得0. IM抗坏血酸(AA)水溶液(该溶液可在使用前临时配制)；(3) 24. 7mM 四氯金酸(HAuCl4 3H20)水溶液称取0. 973g四氯金酸(分析纯)溶于IOOmL去离子水中，制得24. 7mM四氯金酸(HAuCl4 3H20)水溶液；(4) IOmM 硝酸银(AgNO3)水溶液称取0. 425g硝酸银(分析纯)溶于250mL去离子水中，制得IOmM硝酸银(AgNO3)水溶液(该溶液须避光保存)；(5) 2mg/mL聚苯乙烯磺酸钠(PSS)水溶液；称取0. Ig聚苯乙烯磺酸钠溶于IOOmL的浓度为6mM的NaCl溶液中；(6) IOmM的4_羟乙基哌嗪乙磺酸溶液(HEPES)称取HEPES 2. 383g，加入三蒸水定容至1L。过滤除菌，4°C保存；(7)甘氨酸水溶液浓度为150mM 称取0. 1125g甘氨酸，溶于IOmL磷酸盐缓冲液中；(8)0. 01g/mL牛血清白蛋白(BSA)水溶液称取0. Ig牛血清白蛋白，溶于IOmL磷酸盐缓冲液中。
2、然后使用上述配制好的各种溶液按如下步骤制备圆柱状金纳米棒溶液、八面体状金纳米颗粒溶液，及抗体修饰的金纳米颗粒溶液其制备步骤如下(I)制备金晶种溶液取7. 5mL浓度为0. IM的CTAB水溶液，向其中加入100. 4 y L浓度为24. 7mM的HAuCl4水溶液，混合均匀后将体积稀释到9. 4mL,在搅拌的条件下加入0. 6mL浓度为0. OlM的硼氢化钠(NaBH4)水溶液(使用前临时配制并置于冰水中)，制得第一混合溶液，所述第一混合溶液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸和硼氢化钠的物质的量比为0.75 0. 0025 0.006 ;室温下搅拌3分钟后静置2-5小时，得到含有金晶种的金晶种溶液，所述金晶种溶液中金的浓度为0. 25mM ；(2)制备圆柱状金纳米棒溶液取IOOmL浓度为0. IM的CTAB水溶液，向其中加入2. 05mL浓度为24. 7mM的HAuCl4水溶液，ImL浓度为IOmM的AgNO3水溶液和2mL的浓度为0. 5M的硫酸水溶液，混合均匀 后，再加入800 u L浓度为0. IM的AA水溶液，得到的混合溶液由桔红色变为无色，然后加入240UL步骤(I)制备的金晶种溶液；使得所述第二混合液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸、硝酸银、硫酸、抗坏血酸与金晶种的物质的量比为5 0.025 0.0075 0. 5 0. 040. 000015 ;将第二混合溶液在30°C下维持12-16小时，得到圆柱状金纳米棒溶液；(3)圆柱状金纳米棒的纯化先将步骤(3)得到的圆柱状金纳米棒溶液在12000g的速度下离心10分钟，并在离心后弃去上清液，以去除未反应的离子及多余的CTAB，然后加入去离子水将离心后的圆柱状金纳米棒溶液稀释到浓度为0. 5mM纯化的圆柱状金纳米棒溶液；(4)制备八面体状金纳米颗粒溶液取一份(ImL)步骤(3)纯化的圆柱状金纳米棒溶液放入试管中，并先后向该溶液中加入60 ii L的浓度为24mM的HAuCl4水溶液、72 u L的浓度为20mM的AgNO3水溶液和2mL的浓度为0. IM的CTAB水溶液，混合均匀后加入144 u L的浓度为0. IM的AA水溶液，并加去离子水定容至3mL后混合均匀，得到第三混合溶液；该第三混合溶液中的CTAB、AA、HAuCl4水溶液中的金离子、AgNO3水溶液中的银离子的物质的量与圆柱状金纳米棒物质的量的配比为400 28. 8 2.88 2. 88 I ;再将第三混合溶液在30°C下维持12小时，制得含八面体状金纳米颗粒的溶液；按照与步骤(3)相同的操作对八面体状金纳米颗粒的进行纯化，得到纯化后的八面体状金纳米棒。用扫描电镜(购自FEI公司)高真空模式下测得圆柱状金纳米棒的平均直径为17. 2nm、平均长度为65. 4nm ;八面体状金纳米颗粒的边长为57. 59nm，具体结果见图3。(5)将纯化后的圆柱状金纳米棒包覆聚苯乙烯磺酸钠(PSS)取一份(ImL)步骤(3)制得的纯化后的圆柱状金纳米棒溶液放入离心管中，在12000g的转速下离心分离10分钟，弃去离心分离后的上清液，向沉淀中加入ImL浓度为2mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液(溶液中含有6mMNaCl);将该溶液在超声清洗器中超声15分钟，然后静置3小时即得到聚苯乙烯磺酸钠包覆的圆柱状金纳米棒的溶液；其中聚苯乙烯磺酸钠的厚度为l_4nm。(6)将聚苯乙烯磺酸钠包覆的圆柱状金纳米棒标记抗体
取一份(ImL)上述聚苯乙烯磺酸钠包覆的圆柱状金纳米棒的溶液在12000g的速度下离心分离10分钟，弃去离心分离后的上清液，向沉淀中加入0. 5mL的浓度为IOmM且PH值为7. 0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液；将该溶液在超声清洗器中超声15分钟。取IOyL羊抗小鼠二抗(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，浓度为1.5mg/mL)稀释于0. 5mL的IOmM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中，制得抗体稀释液。将上述0. 5mL的溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的圆柱状金纳米棒溶液与0. 5mL的抗体稀释液溶液进行充分混合，在4°C下维持15小时，制得标记有圆柱状金纳米棒的羊抗小鼠二抗的溶液。(7)按照步骤(5)相同的方法将八面体状金纳米颗粒包覆聚苯乙烯磺酸钠，所不同的是将步骤(3)得到的圆柱状金纳米棒溶液替换为步骤(4)得到的八面体状金纳米棒溶液；并且按照步骤(6)相同的方法标记抗体，所不同的是将羊抗小鼠二抗替换为羊抗兔二抗，得到标记有八面体状金纳米颗粒的羊抗兔二抗的溶液。将标记有圆柱状金纳米棒的羊抗小鼠二抗作为标记有第一金纳米颗粒的第一抗 体；将标记有八面体状金纳米颗粒的羊抗兔二抗作为标记有第二金纳米颗粒的第二抗体。制备例2本制备例用于说明本发明所提及的生物材料的制备方法。本制备例的制备目的是制备烧伤血清刺激的大鼠脑微血管内皮细胞，其步骤如下(I)原代培养大鼠脑微血管内皮细胞将成年Wi star雄性大鼠用3. 5重量％浓度的水合氯醛麻醉后断头取出脑组织，置于培养皿中；剔去软脑膜、大血管和脑白质后获得大脑皮层，将获得的大脑皮层剪碎后用杜恩斯(Dounce)匀浆器匀浆，得到匀浆液，用180目的过滤网过滤匀浆液得到滤物；将滤物用浓度为0. I重量％胶原酶溶液(购自Hyclone公司)在37°C下消化15分钟，得到消化液；将消化液在800g的速度下离心5分钟后弃上清，得到细胞沉淀；向细胞沉淀中加入DMEM培养基(购自Hyclone公司)(每IO5个细胞(用血球计数板计数后得到的数值)用Iml培养基)；种入培养瓶中，在5体积％浓度的二氧化碳和37°C的温度下培养3天，得到原代培养大鼠脑微血管内皮细胞。(2)制备烧伤血清将成年SD大鼠经腹腔注射用戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，背部去毛，用恒温水烫仪在100°c条件下处理背部10s，得到20%体表面积三度烧伤的大鼠，取伤后6h外周血，凝固后800g离心10分钟，吸取上清液并将上清液在56°C下维持30分钟，得到烧伤血清。(3)烧伤血清刺激的大鼠脑微血管内皮细胞将步骤(I)得到的原代培养大鼠脑微血管内皮细胞接种在Icm见方的盖玻片上，并在含有2体积％的烧伤血清的培养基中，在5体积％浓度的二氧化碳和37°C的温度下培养I天，得到烧伤血清刺激后的大鼠脑微血管内皮细胞。实施例I本实施例用于说明本发明的将生物样品制备成扫描电镜样品的方法。根据文献(第四军医大学报，1999，20卷，442页)公开的内容可知，烧伤血清刺激后的大鼠脑微血管内皮细胞表面分布有大量的细胞间粘附分子-I (ICAM-I)和整合素3 I(Integrin 3 I)。
本实施例的目标是将烧伤血清刺激后的大鼠脑微血管内皮细胞制备为能够用低压扫描电镜同时观察烧伤血清刺激后的大鼠脑微血管内皮细胞表面上的ICAM-1和Integrin ^ I的扫描电镜样品。本实施例将ICAM-I作为第一蛋白，将Integrin P I作为第二蛋白。本实施例按如下步骤进行(I)将生长在Icm见方的盖玻片上的制备例2得到的烧伤血清刺激后的大鼠脑微血管内皮细胞(细胞数为IO5个,细胞总质量为0. I ii g)用IOml的0. I重量％的戊二醒水溶液在室温下浸泡30分钟,再用IOml的150mM的甘氨酸水溶液在室温下浸泡30分钟,得到封闭后的生物样品。(2)将2 ii g的鼠抗ICAM-I抗体(购自Santa Cruz公司)和2 ii g的兔抗Integrin3 I抗体(购自密理博(Millipore)公司)溶于IOOy I的I重量％的牛血清白蛋白溶液中，得到一抗液，然后将一抗液涂覆在步骤(I)得到的封闭后的生物样品上，然后在37°C下 维持I小时，洗去一抗液，得到一抗处理后的生物样品。(3)将制备例I得到的标记有圆柱状金纳米棒的羊抗小鼠二抗标记的溶液和标记有八面体状金纳米颗粒的羊抗兔二抗的溶液各20 Ul混合后涂覆在步骤(2)得到的一抗处理后的生物样品上，然后在在37°C下维持I小时，洗去多余的液体，得到二抗处理后的生物样品。(4)将步骤(3)得到的二抗处理后的生物样品用2. 5重量％的戊二醛溶液浸没，在室温下放置15小时，去除液体，得到固定后的生物样品。然后在室温下，将固定后的生物样品依次在能够浸没样品的20体积％、30体积％、50体积％、70体积％、80体积％和90体积％的乙醇水溶液中各放置15分钟，然后在无水乙醇中放置15分钟，更换新的无水乙醇并重复2次在无水乙醇中的操作，得到脱水后的生物样本。然后，将脱水后的生物样本在临界点干燥仪(购自Bal-Tec公司)中，用温度8_10°C的液态二氧化碳浸泡40-120分钟，并在温度为30-40°C和压力为7-10MPa的条件下，使液态二氧化碳完全挥发，得到干燥后的生物样品。得到的干燥后的生物样品即可作为扫描电镜样品。在扫描电镜(购自FEI公司)低真空模式下对上述扫描电镜样品进行观察，得到如图I和图2所示结果。在图I和图2中，可见经过烧伤血清刺激后的大鼠脑微血管内皮细胞的表面呈现出数个金纳米棒的团簇状区域，与文献(细胞生物学杂志(The Journal of CellBiology)，2008年，183卷，527页.)报道的ICAM-I分子出现团簇的结果相符，同时可见大量圆柱状金纳米棒，与文献(第四军医大学报，1999，20卷，442页)报道的整合素^KIntegrin ^ I)大量表达的结果相符。而且可以很容易的辨别出两种不同形貌的金纳米颗粒。对比例I本对比例用于说明13nm金纳米颗�：�40nm金纳米颗粒在扫描电镜低真空模式下的分辨效果。(I)将114毫克柠檬酸钠溶解于10毫升蒸馏水中，加热至100°C ;向200毫升的两口圆底烧瓶中加入100毫升蒸馏水，将41毫克氯金酸加入其中，加热至120°C使之回流。将柠檬酸钠热水溶液迅速加入到该回流条件下的氯金酸溶液中，1200转/分钟剧烈搅拌15分钟后，撤去加热装置，缓慢搅拌直至自然冷却到室温。用孔径为22微米PES滤膜(购自密理博公司)过滤所得金纳米颗粒水溶液，得到滤液，经高真空模式扫描电镜观察，该滤液即为13nm金纳米颗粒溶液。(2)将IOOmL的浓度为0. IM的CTAB水溶液，2mL的浓度为0. 024M的HAuCl4水溶液，2ml的浓度为0. 5M的H2SO4水溶液，ImL的浓度为IOmM的AgNO3水溶液和0. 55mL的浓度为0. IM的抗坏血酸水溶液(AA)水溶液均匀混合，得到金纳米颗粒的生长溶液。将生长溶液置于30°C恒温水浴中，加入然后加入240 ii L制备例I中的金晶种溶液维持12个小时，再加入0. 25mL的浓度为0. IM的AA，维持2小时，得到产物溶液，经高真空模式扫描电镜观察，该产物溶液即为40nm金纳米颗粒溶液。将上述13nm金纳米颗粒溶液和40nm的金纳米颗粒溶液各0. 2mL混勻后滴在Icm见方的盖玻片上，65°C下烘干后，在扫描电镜下利用与实施例I同样低真空模式扫描电镜 的条件进行观察，得到如图4所示结果。从图4中可以看出，尺寸不同但形貌相同的的金纳米颗粒在低真空模式扫描电镜的观察条件下分辨率较低。
权利要求
1.ー种将生物样品制备成扫描电镜样品的方法，所述生物样品中含有第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白和第二蛋白不同；该方法包括如下步骤 (1)使抗第一蛋白的抗体和抗第二蛋白的抗体分别或同时与所述生物样品进行第一接触，第一接触的条件使得抗第一蛋白的抗体与第一蛋白特异结合，抗第二蛋白的抗体与第ニ蛋白特异结合，得到一抗处理后的生物样品； (2)使标记有第一金纳米颗粒的第一抗体和标记有第二金纳米颗粒的第二抗体分别或同时与所述ー抗处理后的生物样品进行第二接触，第二接触的条件使得标记有第一金納米颗粒的第一抗体与和第一蛋白结合的抗第一蛋白的抗体特异结合，标记有第二金纳米颗粒的第二抗体与和第二蛋白结合的抗第二蛋白的抗体特异结合，得到ニ抗处理后的生物样品; (3)将该ニ抗处理后的生物样品依次进行固定、梯度脱水和临界点干燥； 其中，所述第一金纳米颗粒的形状与所述第二金纳米颗粒的形状不同，且所述第一金纳米颗粒与所述第二金纳米颗粒选自圆柱状金纳米棒、八面体状金纳米颗粒、球型金纳米颗粒和箭头状金纳米颗粒中的ー种或多种。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述第一金纳米颗粒或所述第二金納米颗粒为圆柱状金納米棒，所述第二金纳米颗粒或所述第一金纳米颗粒相应地为八面体金纳米颗粒。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中，所述圆柱状金納米棒的直径为13-20nm，长为50-80nm,所述八面体金纳米颗粒的边长为40_80nm。
4.根据权利要求I所述的方法，其中，所述第一接触的条件包括相对于每毫克的生物样品，抗第一蛋白的抗体或抗第二蛋白的抗体的用量为40-400微克；接触的温度为35-370C ;接触的时间为30-120分钟。
5.根据权利要求I或4所述的方法，其中，所述第二接触的条件包括相对于每毫克的生物样品，标记有第一金纳米颗粒的第一抗体或标记有第二金纳米颗粒的第二抗体的使用量为100-800微克；接触的温度为35-37°C ;接触的时间为30-120分钟。
6.根据权利要求I所述的方法，其中，所述方法还包括在进行所述第一接触前，将所述生物样品先后进行预固定和封闭； 所述预固定的方法包括将所述生物样品与预固定剂在预固定条件下接触，得到预固定后的生物样品，所述预固定剂为浓度为1-5重量％的戊ニ醛和/或甲醛水溶液；所述预固定条件包括 .温度为4-30°C，时间为20-50分钟； 所述封闭的方法包括将得到的预固定后的生物样品在封闭条件下与封闭剂接触，得到封闭后的生物样品，所述封闭剂为浓度为100-200mM的甘氨酸水溶液；所述封闭的条件包括 .温度为35-37°C，时间为10-30分钟。
7.根据权利要求I或6所述的方法，其中，所述生物样品为病毒、细菌、真菌细胞、动物细胞和植物细胞中的ー种或多种。
8.根据权利要求I或6所述的方法，其中，所述生物样品为动物细胞，并且所述第一蛋白和所述第二蛋白定位于所述动物细胞的质膜的外表面上。
9.根据权利要求I所述的方法，其中，按投料比计算，标记有第一金纳米颗粒的第一抗体或标记有第二金纳米颗粒的第二抗体中，第一金纳米颗粒或第二金纳米颗粒与第一抗体或第二抗体的摩尔比为50-15 0 I。
全文摘要
本发明提供了一种将生物样品制备成扫描电镜样品的方法；该方法包括使标记有第一金纳米颗粒的第一抗体和标记有第二金纳米颗粒的第二抗体与一抗处理后的生物样品进行接触，然后依次进行固定、梯度脱水和临界点干燥。其中，所述第一金纳米颗粒的形状与所述第二金纳米颗粒的形状不同，且所述第一金纳米颗粒与所述第二金纳米颗粒选自圆柱状金纳米棒、八面体状金纳米颗粒、球型金纳米颗�：图纷唇鹉擅卓帕Ｖ械囊恢只蚨嘀�。通过本发明提供的方法，制得的扫描电镜样品可以在低真空模式下精确地区分两种不同的蛋白分子。
文档编号G01N33/532GK102680289SQ20111005592
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者吴晓春, 张珂, 韩东 申请人:国家纳米科学中心
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