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专利名称：一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法
技术领域：
本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法。
背景技术：
在药物分析检测中，常用的方法有高效液相色谱法(HPLC)、离子交换色谱一紫外检测法、质谱分析法、液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法等，其中液相色谱串联质谱法将高效液相色谱的高分离效能力与质谱的强大结构测定功能组合起来，使其成为医药、化工等领域中最重要的方法之一。氟莱哌素是一种I. I类新型抗癌药物，具有高效、广谱、低毒、低成本的特点，目前处于临床I期研究阶段，而国内外文献中对氟莱哌素检测方法的报道很少见，在液相色谱串联质谱法分析操作中将氟莱哌素稀释液直接打进质谱无响应，无法对氟莱哌素进行定量测定。大鼠体内药动学(L. Gu, L. Li, Z. Chen, H. Pan, H. Jiang, S. Zeng, X. Xu, H. An. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. , 2008 (868) :77)研究报道过一种方法， 为高效液相色谱检测方法，但是最低测定限(LOQ)为50ng/ml，灵敏度太低。

发明内容
本发明提供了一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，操作简便，准确度高，灵敏、可靠，检测限低，结果重现性好。一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，包括对氟莱哌素的全血样品依次进行预处理和液相色谱串联质谱法检测分析，所述的预处理为向氟莱哌素的全血样品中加入乙醚、内标溶液和NaF饱和水溶液(室温)，再进行冷冻离心，取冷冻离心的上清液于室温下氮气吹干，用AgNO3溶液复溶后进行离心分离，取离心分离的上清液作为液相色谱串联质谱法的样品。所述的全血样品与内标溶液的体积比为10 : I。所述的全血样品与NaF饱和水溶液的体积比为I : 1.5。在实际操作中，并不严格限定乙醚的用量，为使全血样品中待测组分得到更好的分散，所述的全血样品与乙醚的体积比优选为I : 10。所述的冷冻离心的上清液与AgNO3溶液的体积比为10 I。所述的内标溶液为浓度为8. 600ng/ml的对苯三硫醚的甲醇溶液，以提高分析结果的准确度。所述的液相色谱串联质谱法检测分析的条件为(I)液相色谱分离液相色谱的流动相由体积比为85 15的流动相A与流动相B组成，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为O. 05%的甲酸的水溶液，流速为O. 6ml/min ;色谱柱为ZORBAX SB-C18液相色谱柱；进样量为10 μ I ;
(2)质谱检测大气压电喷雾离子源，多重反应选择离子监测，阳离子电离模式碰撞气41. 38kPa，气帘气103. 45kPa，离子喷雾电压4500V ;干燥气温度 4000C ;离子源气体I :448. 28kPa，离子源气体2 :275. 86kPa ；氟莱哌素母离子[MJAg]+及子离子测定为m/z 421. I — 357. 0，离子去簇电压 72V，入口电压10V，碰撞能27V，碰撞室出口电压4V ；内标对苯三硫醚母离子[M2+Ag]+及子离子测定为m/z 384. 9 — 263. O,离子去簇电压72V，入口电压10V，碰撞能25V，碰撞室出口电压10V ；所述的色谱柱为不锈钢填充柱，内径为3. Omm,长度为150mm,粒径为3. 5 μ m。所述的AgNO3溶液是由所述的流动相配制的，浓度为O. 01mol/L,以避免在后续的液相色谱串联质谱法检测分析中基线不稳造成无法判断杂质峰。本发明对全血样品进行预处理时所采用的乙醚如无特殊说明均为零摄氏度的乙醚。本发明建立了全血中氟莱哌素的液质联用检测方法，本发明方法对氟莱哌素样品的检测的专一性强，灵敏度高，操作方便，各项方法学指标均能达到中国药典的相关技术要求；本发明方法检测结果准确可靠，检测限低，可达到O. 4ng/ml。


图I为本发明氟莱哌素标准样品的一级全扫描质谱图。图2为本发明内标对苯三硫醚的一级全扫描质谱图。图3为本发明氟莱哌素标准样品的二级全扫描质谱图。图4为本发明内标对苯三硫醚的二级全扫描质谱图。图5a为本发明实施例2测试空白全血中氟莱哌素的色谱图。图5b为本发明实施例2测试空白全血中内标的色谱图。图5c为本发明实施例2测试空白全血加氟莱哌素(40ng/ml)和内标(8. 600ng/ ml)后的样品中氟莱哌素的色谱图。图5d为本发明实施例2测试空白全血加氟莱哌素(40ng/ml)和内标后的样品中内标(8. 600ng/ml)的色谱图。图5e为本发明实施例2测试病人给药后的病人全血中氟莱哌素的色谱图。图5f为本发明实施例2测试病人给药后的病人全血中内标的色谱图。图6为本发明实施例2氟莱哌素在全血中的降解率图。图7为本发明实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8氟莱哌素在病人全血中的血药浓度曲线图。图8为本发明实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8中氟莱哌素在病人全血中的血药浓度曲线图的局部放大图。
具体实施例方式实施例I(I)标准溶液配制
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精密称取氟莱哌素标准样品8. 350mg，置5ml容量瓶中，加甲醇溶解、定容，得标准样品储备液，置_20°C冰箱中备用。精密称取对苯三硫醚对照品8. 600mg,置5ml的容量瓶中，加甲醇溶解、定容，得浓度为1.720mg/ml的母液，即内标储备液，置_20°C冰箱中备用；使用前加甲醇稀释，配成浓度为8. 600ng/ml的对苯三硫醚溶液。(2)样品的预处理从超低温(_80°C左右)冰箱中取出氟莱哌素的全血样品I. 7ml，直接加入乙醚 (0°C )，震荡融化，转移至50ml离心管中，再次加入乙醚((TC )，乙醚总量为17ml，再依次加入170 μ I对苯三硫醚溶液、2550 μ I NaF饱和溶液(室温状态的饱和溶液)，涡旋震荡 2min,4°C下4000rpm冷冻离心5min,取上清液5ml室温下氮气吹干,用O. 01mol/L流动相 (具体组成可参见步骤⑷)配制的AgNO3溶液500 μ I复融，震荡I. 5min,转移到I. 5ml微量离心管中10900rpm离心lOmin，取上清液200 μ I置进样瓶中进样分析；(3)液相色谱分离仪器:Agilent RRLC1200安捷伦超高速高分离液相色谱仪。流动相由体积比为85 15的流动相A与流动相B组成，流动相A为甲醇，流动相B为甲酸的水溶液(甲酸的体积分数为O. 05% )，流速为O. 6ml/min ;色谱柱为ZORBAX SB-C18液相色谱柱，内径为3. Omm,长度为150mm，粒径为3. 5 μ m ;进样量为10 μ I ;(4)质谱检测仪器API 4000三重四极杆质谱仪(美国应用生物系统(AB)公司，美国)； Analyst software 工作站 VL 4. 2 ;离子源大气压电喷雾离子源(ESI)；扫描方式阳离子MRM扫描；离子源参数离子源气体I :65psi (448. 28kPa);离子源气体2 : 40psi(275. 86kPa);碰撞气6psi (41. 38kPa);气帘气15psi (103. 45kPa);离子喷雾电压: 4500V ;干燥气温度400°C ；定性离子对、定量离子对和相关参数
权利要求
1.一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，包括对氟莱哌素的全血样品依次进行预处理和液相色谱串联质谱法检测分析，其特征在于，所述的预处理为向氟莱哌素的全血样品中加入乙醚、内标溶液和NaF饱和水溶液，再进行冷冻离心，取冷冻离心的上清液于室温下氮气吹干，用AgNO3溶液复溶后进行离心分离，取离心分离的上清液作为液相色谱串联质谱法的样品。
2.如权利要求I所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的全血样品与内标溶液的体积比为10 I。
3.如权利要求I所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的全血样品与NaF饱和水溶液的体积比为I : 1.5。
4.如权利要求I所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的全血样品与乙醚的体积比为I : 10。
5.如权利要求I所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的冷冻离心的上清液与AgNO3溶液的体积比为10 I。
6.如权利要求I或2所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的内标溶液为浓度为8. 600ng/ml的对苯三硫醚的甲醇溶液。
7.如权利要求I所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的液相色谱串联质谱法检测分析的条件为(1)液相色谱分离液相色谱的流动相由体积比为85 15的流动相A与流动相B组成，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为O. 05%的甲酸的水溶液，流速为O. 6ml/min ;色谱柱为ZORBAX SB-C18液相色谱柱；进样量10为μ I ;(2)质谱检测大气压电喷雾离子源，多重反应选择离子监测，阳离子电离模式碰撞气41. 38kPa，气帘气:103. 45kPa，离子喷雾电压4500V ;干燥气温度400°C ’离子源气体I :448. 28kPa，离子源气体2 :275. 86kPa ；氟莱哌素母离子[MfAg] +及子离子测定为m/z 421. I — 357. 0，离子去簇电压72V，入口电压10V，碰撞能27V，碰撞室出口电压4V ；内标对苯三硫醚母离子[M2+Ag] +及子离子测定为m/z 384. 9 — 263. O,离子去簇电压 72V，入口电压:10V，碰撞能:25V，碰撞室出口电压10V。
8.如权利要求7所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的色谱柱为不锈钢填充柱，内径为3. Omm,长度为150mm,粒径为3. 5 μ m。
9.如权利要求7所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的AgNO3 溶液是由流动相配制的，浓度为O. 01mol/Lo
全文摘要
本发明公开了一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，包括对氟莱哌素的全血样品依次进行预处理和液相色谱串联质谱法检测分析，其特征在于，所述的预处理为向氟莱哌素的全血样品中加入乙醚、内标溶液和NaF饱和水溶液，再进行冷冻离心，取冷冻离心的上清液于室温下氮气吹干，用AgNO3溶液复溶后进行离心分离，取离心分离的上清液作为液相色谱串联质谱法的样品。本发明方法检测结果准确可靠，检测限低，氟莱哌素的最低测定限为0.4ng/ml，本发明方法对氟莱哌素样品的检测的专一性强，灵敏度高，操作方便，各项方法学指标均能达到中国药典的相关技术要求。
文档编号G01N30/02GK102590390SQ201210049748
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者付立智, 朱梅湘, 王 华, 申屠建中, 胡兴江 申请人:浙江大学