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专利名称：紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法
技术领域：
本发明属于植物生化检测技术领域，具体地，涉及一种紫花苜蓿(Medicagosat iva L.)叶黄素循环组分的快速检测方法。
背景技术：
紫花苜猜(Medicago sativa L.)是我国栽培历史最久、分布最广、种植最多的优良豆科牧草。紫花苜蓿具有产量高、品质好、蛋白质含量高、适口性好等特点，被誉为“牧草之王”。同时，它能保持水土、培肥地力、增加饲料，对改善农牧业生态环境、促进畜牧业发展有重要作用。由于种植条件粗放，紫花苜蓿经常受到强光、干旱和土壤贫瘠等逆境的胁迫而发生光抑制甚至光破坏，使其光合效率降低、品质下降。环境胁迫如高温、干旱、强光和贫瘠等条件下，植物的光合能力下降，积累的过剩光能易导致光破坏，依赖于植物体内的叶黄素循环耗散过剩激发能，是光合器官在自然条件下免遭光破坏的重要途径之一。叶黄素循环组分由玉米黄质(Z)、环氧玉米黄质(A)和紫黄质(V)构成。当光合器官吸收的光能不能全部被光合作用利用时，V在紫黄素脱环氧化酶催化下。经中间体A脱环氧生成Z，在没有过剩光能条件下，Z在环氧化酶催化下经中间体A加环氧生成V。且Z随着过剩光能的增加而增加，并直接参与热耗散而将多余的激发能猝灭，起到光保护作用。因此，建立紫花苜蓿叶黄素循环组分的测定方法是十分必要的。目前对植物叶黄素循环组分的测定大多数采用的是Spherisorb C18色谱柱柱，使用的流动相是Tris-HCL缓冲液、甲醇和乙酸乙酯。该流动相要么形成不溶于水的晶体沉淀而堵塞管路系统，导致柱压急剧升高，大大缩短了柱的有效使用寿命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要经常洗脱，不仅费时费力，且经常使得被测组分的峰形被破坏。所以建立对色谱柱无伤害、灵敏准确的紫花苜蓿叶黄素组分循环测定方法具有十分重要的作用。发明目的针对现有技术存在的上述不足，本发明旨在提供一种紫花苜蓿叶黄素循环组分的快速检测技术，采用价格较Spherisorb C18相对便宜的Hypersil ODS色谱柱,采用对色谱柱无伤害的常用试剂乙腈作为流动相，为紫花苜蓿叶黄素循环组分的快速、准确检测提供了节约人力、物力和财力的方法。从色素的提取到检测全过程只需I小时即可完成，该方法快速、灵敏、准确。本发明的上述目的是通过下述的技术方案加以实现的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，取紫花苜蓿鲜叶O.1g,倒入液氮研磨至粉末状，加入85%丙酮，匀浆2-3 min,再加入100%丙酮，匀浆I min之后置于冰上15 min,1200g离心10 min，取上清液用0.45 Mm微孔滤膜过滤后进样到高效液相色谱仪采用浓度线性梯度洗脱，从而检测紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质(Z)、环氧玉米黄质(A)和紫黄质(V)的含量。所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述高效液相色谱仪使用美国Agilent 1100高效液相色谱仪,色谱柱使用美国Agilent Hypersil ODS的4. O X 250 mm, 5Mm色谱柱。所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述浓度线性梯度洗脱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，浓度线性梯度洗脱程序为90% A液+ 10% B液洗脱15min，接着在5min内，90% A液浓度线性递增至100%的A液,之后再洗脱20 min,流速I ml/min,检测波长445 nm，柱子温度30°C，进样体积10 μ 。所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，所述紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质0119、环氧玉米黄质0231和紫黄质0259标样购自瑞士 carotenature原装,纯度分别为 99. 6%, 95. 7% 和 98. 6%。所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述紫花苜蓿叶黄素提取过程在无光条件下进行。所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法中所述试剂丙酮为分析纯，水为超纯水，乙腈为色谱纯。更具体地，本发明 的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法是准确称量玉米黄质
O.96 mg,环氧玉米黄质1. 128 mg,紫黄质1. 536 mg,用甲醇定容100 ml容量瓶中，取上述储备液I ml，分别稀释10倍、50倍、100倍和200倍，分别取10 μ 稀释后的标样进样到美国 Agilent 1100 高效液相色谱仪中，用美国 Agilent Hypersil ODS (4.0X250 mm, 5Mm)色谱柱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min，接着在5 min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min，流速Iml/min，检测波长445 nm，柱子温度30°C，以它们的峰面积和浓度进行线性回归，建立标准曲线，玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别为15. 38 min、10.20 min和6. 90min ;在暗室中，取紫花苜蓿鲜叶放入研钵中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末状，加入85%丙酮，匀浆2-3 min，再加入100%丙酮，匀浆I min，之后将研钵置于冰上15 min, 1200 g离心10 11^11，取上清液用0.45 μ m微孔滤膜过滤后，取10 μ 体积进样到美国Agilent 1100高效液相色谱仪中，用美国Agilent Hypersil ODS的4. 0X250 mm, 5 Mm色谱柱,流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min,接着在5 min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min,流速I ml/min，检测波长445nm，柱子温度30°C，紫花苜蓿玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别与标样的保留时间一致，测出玉米黄质、环氧玉米黄质、紫黄质的含量。


图1叶黄素循环组分玉米黄质(Z)、环氧玉米黄质(A)和紫黄质(V)的标准曲线图2徳钦野生紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质(Z)、环氧玉米黄质(A)和紫黄质(V)的峰值图。图3阿尔R金紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质(Z)、环氧玉米黄质(A)和紫黄质(V)的峰值图。与现有技术相比，本发明的组培方法的优点在于本发明方法选取了价格较为便宜的液相色谱柱美国Agilent Hypersil ODS(4.0X250 mm, 5 Mm)色谱柱。选取了对色谱柱无伤害的常规液相色谱流动相乙腈，同时筛选出了灵敏、准确、快速的液相色谱检测条件。从色素的提取到检测全过程只需I小时即可完成。
具体实施例方式以下实施例用来进一步说明本发明的实质性内容。根据本发明技术方案和实施例的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本发明主要技术方案基础上所做的修改和改进，均应属于本发明所要求保护的范围。实施例1 :将购自瑞士 carotenature原装玉米黄质(0119)准确称量O. 96 mg、环氧玉米黄质(0231)1. 128 mg和紫黄质(0259)1. 536 mg，用甲醇定容100 ml容量瓶中。取上述储备液Iml，分别稀释10倍、50倍、100倍和200倍。分别取10 PL稀释后的标样进样到美国Agilent1100高效液相色谱仪中，用美国Agi lent Hypersil ODS (4. 0X250 mm, 5 Mm)色谱柱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min,接着在5min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min,流速I ml/min，检测波长445 nm，柱子温度30°C。以它们的峰面积和浓度进行线性回归，建立标准曲线。玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别为15.38 min、10. 20 min和6. 90 min。(见附图1)在暗室中，取德钦野生紫花苜蓿鲜叶片O.1g放入研钵中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末状，加入4 ml 85%丙酮，匀浆2-3 min，再加入Iml 100%丙酮，匀浆I min，之后将研钵置于冰上15 min, 1200 g离心10 min，取上清液用O. 45 μ m微孔滤膜过滤后，取10 μ 体积进样到美国Agilent 1100高效液相色谱仪中，用美国Agilent Hypersil 0DSC4. 0X250mm, 5 Mm)的色谱柱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min,接着在5 min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min。流速I ml/min,检测波长445 nm,柱子温度30°C,玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别为15. 308min、10. 217 min和6. 845min分别与标样的保留时间一致，测得的玉米黄质的含量为1. 11112X10_3%，环氧玉米黄质的含量9. 87748X 10_4 %和紫黄质的含量为
6.87689XlCT3 % (见附图 2)。实施例2 将购自瑞士 carotenature原装玉米黄质(0119)准确称量O. 96 mg、环氧玉米黄质(0231)1. 128 mg和紫黄质(0259)1. 536 mg，用甲醇定容100 ml容量瓶中。取上述储备液Iml，分别稀释10倍、50倍、100倍和200倍。分别取10 PL稀释后的标样进样到美国Agilent1100高效液相色谱仪中，用美国Agilent Hypersil ODS (4. 0X250 mm, 5 Mm)色谱柱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min,接着在5min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min,流速I ml/min，检测波长445 nm，柱子温度30°C。以它们的峰面积和浓度进行线性回归，建立标准曲线。玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别为15.38 min、10. 20 min和6. 90 min。(见附图1)在暗室中，取阿尔冈金紫花苜蓿鲜叶片O.1g放入研钵中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末状，加入4 ml 85%丙酮，匀浆2-3 min，再加入I ml 100%丙酮，匀浆I min，之后将研钵置于冰上15 min, 1200 g离心10 min，取上清液用O. 45 μ m微孔滤膜过滤后，取体积10 μ 进样到美国Agilent 1100高效液相色谱仪中，使用美国Agilent Hypersil ODS(4. O X 250 mm, 5 Mm)色谱柱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min,接着在5 min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min。流速I ml/min,检测波长445 nm,柱子温度30°C。玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别为15. 735 minUO. 402 min和6. 920 min分别与标样的保留时间一致，测得的玉米黄质的含量为1. 16060X 10_3 %，环氧玉米黄质的含量7. 34. 48X 10_4 %和紫黄质的含量为1. 80011 X 10_3 %。(见附图3)本发明的技术方案通过将玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的标样连续进样5次，每次 ο μ ，测定其峰面积，其相对标准偏差RSD分别为O. 87%，O. 32%和O. 96%的精密度实验；将玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的标样分别于制备后0、3、6、9、14、19、25、48 h,测定其峰面积，其相对标准偏差RSD分别为2. 15%，1. 29%和3. 57%的稳定性试验；精密称取同一样品5份，测定其含量，计算得到玉米黄质相对标准偏差RSD为1. 88%、环氧玉米黄质相对标准偏差RSD为2. 63%和紫黄质RSD为O. 42%的重现性实验，相对标准偏差都小于5%，表明该方法可较好的区分出叶黄素循环组分玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质，能反映样品的真实含量，稳定性和重现性均较好，简便准确。本发明的技术方案由于流动相使用乙腈，相比现有技术使用流动相Tris-HCL缓冲液、甲醇和乙酸乙酯的方法，对色谱柱无伤害，且较为灵敏准确。现有技术使用的流动相要么形成不溶于水的晶体沉淀而堵塞管路系统，导致柱压急剧升高，大大缩短了柱的有效使用寿命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要经常洗脱，不仅费时费力，且经常使得被测组分的峰形被破坏。而本发明克服了这些问题，具备对色谱柱无伤害、灵敏准确，提高效率，延长仪器使用寿命等优点。`
权利要求
1.紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，取紫花苜蓿鲜叶0.lg，倒入液氮研磨至粉末状，加入85%丙酮，匀浆2-3 min，再加入100%丙酮，匀浆.1 min之后置于冰上15 min, 1200g离心10 min，取上清液用0. 45 Mm微孔滤膜过滤后，取.10μ1进样到高效液相色谱仪采用浓度线性梯度洗脱，最后检测出紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质(Ζ)、环氧玉米黄质(A)和紫黄质(V)的含量。
2.根据权利要求1所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，其特征在于所述高效液相色谱仪使用美国Agilent 1100高效液相色谱仪,色谱柱使用美国Agilent HypersilODS 的 4. 0 X 250 mm, 5 Mm 色谱柱。
3.根据权利要求1所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，其特征在于所述浓度线性梯度洗脱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，浓度线性梯度洗脱程序为90% A液+ 10% B液洗脱15min，接着在5min内，90% A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱.20 min,流速1ml/min,检测波长445 nm,柱子温度30°C,进样体积10 μl。
4.根据权利要求1所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，其特征在于所述紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质0119、环氧玉米黄质0231和紫黄质0259标样购自瑞士carotenature 原装，纯度分别为 99. 6%,95. 7% 和 .98. 6%。
5.根据权利要求1所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，其特征在于所述紫花苜蓿叶黄素提取过程在无光条件下进行。
6.根据权利要求1所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，其特征在于所述试剂丙酮为分析纯，水为超纯水，乙腈为色谱纯。
7.如权利要求1所述的紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，其特征在于准确称量玉米黄质0. 96 mg,环氧玉米黄质1. 128 mg,紫黄质1. 536 mg,用甲醇定容100 ml容量瓶中，取上述储备液1 ml，分别稀释10倍、50倍、100倍和200倍，分别取10 μl稀释后的标样进样到美国Agilent 1100高效液相色谱仪中，用美国Agilent Hypersil 0DSC4. OX250 mm,.5 Mm)色谱柱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min,接着在5 min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min,流速.1ml/min，检测波长445 nm，柱子温度30°C，以它们的峰面积和浓度进行线性回归，建立标准曲线，玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别为15. 38 min、10. 20 min和6. 90min ;在暗室中，取紫花苜蓿鲜叶0.1g放入研钵中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末状，加入.85%丙酮，匀浆2-3 min，再加入100%丙酮，匀浆I min，之后将研钵置于冰上15 min, 1200g离心10 min,取上清液用0. 45 μ m微孔滤膜过滤后,取.10 μl体积进样到美国Agilent.1100高效液相色谱仪中,用美国Agilent Hypersil ODS的.4. 0X250 mm, 5 Mm色谱柱,流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，梯度洗脱程序90%A液+10%B液洗脱15 min,接着在.5min内，90%A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min,流速I ml/min，检测波长445 nm，柱子温度30°C，紫花苜蓿玉米黄质、环氧玉米黄质和紫黄质的保留时间分别与标样的保留时间一致，最后测出玉米黄质、环氧玉米黄质、紫黄质的含量。
全文摘要
紫花苜蓿叶黄素循环组分的检测方法，取紫花苜蓿鲜叶0.1g,倒入液氮研磨至粉末状，加入85%丙酮，匀浆2-3 min，再加入100%丙酮，匀浆1 min之后置于冰上15 min，1200g离心10 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后，取10 μl进样到美国Agilent 1100高效液相色谱仪中采用浓度线性梯度洗脱，用美国Agilent Hypersil ODS(4.0×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相A液为100%乙腈，B液为100%水，浓度线性梯度洗脱程序为90% A液 + 10% B液洗脱15 min，接着在5min内，90% A液浓度线性递增至100%的A液，之后再洗脱20 min，流速1 ml/min，检测波长445 nm，柱子温度30℃。最后检测出紫花苜蓿叶黄素循环组分玉米黄质(Z)、环氧玉米黄质(A)和紫黄质(V)的含量。
文档编号G01N30/02GK103063758SQ201210513000
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者姜华, 何承刚, 毕玉芬, 单贵莲, 马向丽, 辛培尧 申请人:云南农业大学