专利名称：用于从第一流体向第二流体移动颗粒的设备的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及用于在流体间移动颗粒的设备和方法。本发明具体涉及微生物样品的小规模清洗或例如细胞、孢子和DNA等的分离，但本发明并不仅限于此。
背景技术：
微生物样品的分离和操作通常需要一个或者多个清洗步骤，这些步骤通常包括对样品进行反复离心和再悬浮。但是，上述方法本身需要手工操作，所以采用上述方法处理这类样品的速度受到了限制。尽管可以实现自动化，但是目前还没有完善的自动化途径，而且快速细胞监测系统发展的潜力甚微。
因此需要一种改良的方法，该方法既可以清洗微生物样品，又可以在不同流体间进行小规模转移。大体而言，本发明通过修改采用超声驻波操作颗粒的已知方法来实现该目的。
这里以参考的方式引入国际专利申请WO 00/41794，其中公开了一种用于从层流液体中超声过滤酵母细胞的设备。该设备包括钢腔室，该腔室包括第一壁和与之相对的第二超声反射壁，第一壁部分地包括陶瓷超声换能器和发射层(J.J.Hawkes和W.T.Coakley，Sensors and ActuatorsB，2001，75，231～242)。第一壁和第二壁限定了分支通道或管道，用于引入和排出酵母细胞的水性样品。
发射层和反射层的厚度以及通道或管道的宽度根据施加至换能器的交变电势的频率来选择，以便在样品中产生单一的半波长超声驻波。压力波节点位于通道或管道的中心或者邻近于通道或管道的中心。
在该系统中(此后称为“半波长系统”)，发射层的厚度是其中声波的四分之一波长的奇数倍，且反射层的厚度是其中声波的四分之一波长的奇数倍(J.J.Hawkes等，J.Acoust.Soc.Am.，2002，111(3)，1259～1256)。
当样品穿过系统保持流动时，声波力向压力波节点驱动酵母，以便穿过第一出口排出浓缩的样品，并穿过第二(分支)出口排出基本澄清的样品。
超声驻波辐射力还将流体中的不同相位分离到节点或者波腹位置。具体而言，水性介质中的空气泡被驱向压力波腹，而细菌被驱动至压力波节点。而且显然，该过滤器提供了单频带(single band)颗粒，而且在与包括湍流的系统相比变量较少的系统中，层流实现了另一种流体操作的机理。
在用于在凝胶中配置颗粒的装置中也具有这些特点(L.Gherardini等，Proc.Int.Workshop on Bioencapsulation IX“Bioencapsulation inBiomedical，Biotechnological and Industrial Applications”，波兰华沙，2001年，第3页)，而且在市售的免疫凝集设备(Immunosonic，Electro MedicalSupplies，Wantage，英国)中也具有类似的特征(P.Jenkins等，J.Immuno.Methods，1997，205，191～200)。
由这些设备所提供的方法可以认为是场流动分离(FFF)技术，例如那些基于电场(J.C.Giddings，Sep.Sci，1996，1，123和N.Tri等，Anal.Chem，2000，72，1823～1829)和/或国际专利申请WO 02/29400中所述的声场的技术。
发明内容
本发明建立在这些已知设备的上述特点上，因此可以在流体之间转移颗粒。这里所使用的“颗粒”具体是指细菌、细胞和细胞碎片、孢子、质�：推渌麯NA、病毒和大的蛋白质分子。本发明对于直径至少为1微米的颗粒最为有效。
第一方面，本发明提供一种用于从第一流体向第二流体移动颗粒的设备，该设备包括管道、用于使各流体的层流在管道内接触的装置和能够产生具有位于管道内的压力波节点的超声驻波的装置。
用于使各流体的层流在管道内接触的装置优选应当使流体之间的混合最小化。尽管通过设备的刻度(mm)在一定程度上指示了层流，但该装置还是分别包括用于各个流体的入口装置和出口装置，其中入口和出口与管道的一侧或另一侧连通。在一个优选实施方式中，各个入口装置和出口装置彼此垂直。各个入口装置和出口装置优选与管路和泵装置相连，从而控制管道中各个流体的流速。在一个实施方式中，在第一入口以及第一出口和第二出口处设置泵装置，使第二入口能够释放任何背压。
此外，不需要流体间不溶或甚至不需要流体间彼此不同。在一个优选实施方式中，各流体均包含水。
从上述讨论可以理解，驻波不必具有位于管道内部中心处的压力波节点。本发明也不必要求单个压力波节点(1/2波长系统)。但是，压力波节点应该位于颗粒将要向其转移的流体中，而不是位于颗粒从其中转移出来的流体中。此外，不需要在沿该轴线的整个长度上存在驻波和压力波节点。层流使得可以在该区域的下游处理经定位的颗粒。
但是，半波长系统是优选的。更优选的是，压力波节点位于管道中心的纵向轴线上或者邻近于管道中心的纵向轴线。
因此，用于产生驻波的装置可以包括适合于产生和发射声波的管道的第一壁，以及适合于反射声波的与第一壁相对的第二壁。当然，可以产生驻波的装置还包括交变电势源。该电势源可以例如包括交变信号发生器(2.91MHz，Hewett Packard 3326A)和放大器(240L型，ENI，Rochester，美国)。
在本发明的第一优选实施方式中，第一壁包括以其厚度可以在3MHz产生共振的压电陶瓷(Ferroperm，Krisgard，丹麦)和厚度为2.5mm(5/4波长)的钢发射层，第二壁包括厚度为1.5mm(3/4波长)的钢反射器，且管道或通道的宽度是0.25mm(1/2波长)。
第二优选实施方式的不同之处在于，第一壁包括厚度为3.1mm(3/2波长)的钢发射层，和第二壁包括厚度为1.5mm(3/4波长)的石英反射器。
本发明还提供一种从第一流体向第二流体移动颗粒的方法，该方法包括以下步骤i)在与能够在管道中产生超声驻波的装置相连的管道内，使各个流体的层流相互接触，和ii)在管道内产生具有压力波节点的驻波。
可以理解，该方法是以连续的模式实施。尽管要根据超声波的效果来确定最佳流速，但各个流体的流速优选为，能够使流体的湍流混合最小化，并使通过分子扩散的转移最大化。
本发明的方法采用上述设备实施。优选该方法使用半波系统，在该系统中，在颗粒转移的目标流体中存在单个节点。
因此，在一个实施方式中，流体分别包含含有荧光素钠或染料和水的酵母细胞的水性悬浮液，在第一入口/出口处的相对流速大约为第二入口/出口处的流速的90％。但是，所相对流速的确定将根据流体和颗粒的特性而改变。
在一个采用优选设备的实施方式中，总流速在从大约4.0ml/min(毫升/分钟)～11ml/min的范围内变化(如上所述的大约90％的相对流速)。例如已经发现，使用第一优选设备分离含有红色染料(1％体积/体积)的水中的酵母细胞(1×108ml-1)的最佳总流速是4.65ml/min。经计算，第一流体和第二流体(都是水)之间的界面距入口区内的第一壁约为53μm。经计算的雷诺数是大约8.6。
已经发现，使用第二优选设备分离含有荧光素钠(1％重量/体积)的水中的酵母细胞(1×108ml-1)的最佳流速是10.2ml/min。经计算，第一流体和第二流体(都是水)之间的界面在入口区约为64μm，在出口区约为81μm。经计算的雷诺数是大约37。
施加至换能器的电势的大小对于将水中的颗粒与分子物种分离开来具有决定作用。因此，在第一优选实施方式(洗涤)中，对电压的大小进行选择，以便仅促进颗粒的转移。
对于第二优选设备，已经发现，从荧光素钠中清洗酵母细胞的最佳电压在恰好低于17Vp-p的区域内。当电压在该数值以上时，会发现酵母成团和粘结，并且增大了荧光素钠的转移。
在第二优选实施方式(混和)中，对电压的大小进行选择，以便同时促进颗�：头肿游镏值淖啤Ｒ虼耍绷魈逑嗤保擅扛龀隹谂懦龅难坊鞠嗤�。当希望将样品分开或者在溶剂间转移时，该实施方式尤其有用。
对于第二优选设备，为了使水与水之间的酵母细胞和荧光素钠的混合最优化，所提供的电压最好在20Vp-p～40Vp-p的范围内。
本发明提供一种没有移动机械部件或者消耗品的设备。该设备适用于复杂自动化作业以及难于接近的场所中使用。该设备可以避免形成背压，而且不会阻塞。与离心力相比，作用在颗粒上的力比较温和，而且曝露时间可小于一秒。因此，该设备和方法提供了对离心分离的替代方法，其中可以使操作损失最小化。该设备特别适用于在小规模时的复杂操作。
现在将通过举例的方式，参考下列附图和实施例对本发明进行说明。
图1是本发明的设备和方法的一个实施方式的示意图；图2是显示根据本发明从染料水溶液中分离酵母颗粒的示意图；图3是本发明设备的优选实施方式的透视图；和图4(a)～图4(c)是图解根据本发明在水与水之间转移酵母细胞和荧光素钠的曲线图。
具体实施例方式
现在参考图1，根据本发明的设备包括总体上用11表示的钢腔室，该钢腔室11具有第一壁12和与之相对的第二壁13，该第一壁12和第二壁13限定了用于使流体通过的管道或通道14。通道14与第一入口15和第一出口16直接连通。由第一壁限定的狭缝或者孔17和18为通道提供第二入口和第二出口。第二入口17和第二出口18垂直于第一入口15和第一出口16及纵向的通道14。
腔室的第一壁12还在外表面中限定出凹槽，在其中设置有与之接触的压电陶瓷换能器19。因此，该换能器仅仅沿着第一壁的部分纵向长度与其接触。用包括信号发生器和放大器的交变电势源(未示出)来运行该换能器19。
尽管该腔室在垂直方向上(已示出)使用，但是将一个或多个入口和出口与用于引入和控制流体至通道14的管道系统和泵装置(未示出)连通。对整体流速和相对流速进行调整，从而使层流和流体与流体的边界靠近第一壁(例如)。
在使用时，将水提供给第一入口15，并且水与第二壁接触，经过通道14，到达第一出口16。同时，(例如)将包含染料(-)的颗粒(o)的水性悬浮液提供给第二入口17。该悬浮液从第二入口开始，与第一壁12接触，经过通道14，到达第二出口18。
电势源的启动可以产生超声驻波辐射(未示出)，该超声波辐射沿着中心纵轴穿过通道14。该驻波在通道中的纵向延伸大概限制在通道14与换能器19相邻的区域。
在所选择的电势频率和振幅，作用在颗粒(o)上的声波力大于作用在染料(-)上的声波力。因此，在通道14中心优先朝向压力波节点驱动颗粒(o)穿过水与水的边界，并经过第一出口16离开驻波的下游。但是，染料(-)没有离开悬浮液的边界，并经过第二出口18离开驻波的下游。
图2中示意性地比较了暴露在超声驻波之前(左手侧，关闭模式)和之后(右手侧，开启模式)第一出口16和第二出口18的输出。正如预想的那样，在关闭模式下，第一出口16的输出清澈，第二出口18的输出带色/混浊(-/o)。但是，随着暴露在驻波下(开启模式)，第一出口16的输出清澈/混浊(o)，第二出口18的输出带色(-)。
现在参考图3，根据本发明优选实施方式的设备包括基本类似于图1所示腔室的腔室11。该腔室的第一壁12包括多个翼部20，各个翼部20均垂直于壁。翼部20各自限定狭缝(未示出)，该狭缝横跨第一壁的宽度延伸，并朝着提供流体传输的孔或收集管21向外逐渐变细。因此，上翼为腔室提供第一和第二出口装置，而下翼提供第一和第二入口装置。
在第一优选设备中，除了在翼部之外，第一壁包括宽度是10mm、厚度是2.5mm(5/4波长)的不锈钢。第二壁包括宽度是10mm、厚度是1.5mm(3/4波长)的不锈钢(Stavax)超声波反射器。将内部翼部上的狭缝(0.25×10mm)设置成相隔60mm。将第一壁和第二壁夹在一起，从而限定出通道14，通过设置在壁周边的硅橡胶垫圈和黄铜垫片的排列使通道14保持在0.25mm(1/2波长-水)。
PZ26压电陶瓷换能器(3MHz，Ferroperm，Krisgard，丹麦)通过环氧树脂附着在第一壁的外表面的内部翼部之间，在该压电陶瓷换能器中，对银电极(30×30×0.67mm)进行蚀刻，从而将其表面积减小到10×20mm。
第二优选设备与上述优选装置的不同之处在于，第二壁包括厚度是1.5mm(3/4波长)的石英(Spectrocil B，Chandos Intercontinental，Chapelen le Frith，英国)和厚度是3.1mm(3/2波长)的第一壁(不锈钢，Stavax)。设置在内部翼部内的狭缝之间的距离是51mm。设置在外部翼部上的狭缝的尺寸是2×10mm。该垫圈包含聚二甲基硅氧烷(PDMS，SylgardTM184，Dow Corning，英国)。
实施例1第一优选设备第一流体/第一入口脱气水第二流体/第二入口在包含1％(体积/体积)红色食品色素(Carmoisine，晚霞黄，Supercook，利兹，英国)的脱气水中的酵母细胞悬浮液(复水干燥，Boots，诺丁汉，英国，1×108ml-1)。
通过三个泵(Gilson Mini-puls 3)和先前由J.J.Hawkes和W.T.Coakley在Sensors and Actuators B，2001，75，231～242中所介绍的管道设置，将总体积流速控制在4.65ml/min。将第一泵设置在第一出口16(3.66ml/min)，将第二泵设置在第二出口18(0.99ml/min)，将第三泵设置在第二入口17(0.56ml/min)。水从储水池(未示出)到第一入口15(4.09ml/min)的流动不用泵控制。
经计算该系统中通道14中的雷诺数是8.6，并且假定为抛物线流动路径，经计算，将输入第二入口17的12％的总流量与输入第一入口的88％的总流量之间的界面距第一壁为53μm。经计算流体在通道中的停留时间是1.9秒。
声波关闭模式通过将第一出口16处的流速减小到第一入口处的流速的10.5％，由第一出口16得到视觉上清澈的输出。该结果表明分子物种显著扩散。
声波开启模式向换能器19施加2.5V的频率为2.91MHz的交变电势。在该系统中，相位而不是电压的最小值最精确地反映声学共振(J.J.Hawkes等，AppliedMicrobiology，1997，82，39～47)。电流/电压相位最小值是通过包括锁相环路IC的相位比较�？�(Philips PC74HC4046AP)进行监测的。
酵母细胞在第一出口16的输出中清晰可见，没有携带可见的染料。第二出口18的输出中没有酵母细胞。
因此，在该电压下，显然该设备可以用于从染料连续地清洗酵母细胞。但是，更高的电压将导致携带一些染料。这种携带可能是由于其它流动力，例如瑞利(Rayleigh)流动而产生，由于超声波和温度效应和/或随着酵母细胞的移动而夹带染料，可以引起瑞利流动。
实施例2第二优选设备第一流体/第一入口脱气水第二流体/第二入口在包含荧光素钠(1mM，Sigma，英国)的脱气水中的酵母细胞悬浮液(1×106～2×108ml min-1)。
所有出口样品中的酵母浓度由血细胞计数器(heamocytometer counts)来计算。通过样品的离心和上层清液分析可以通过在485nm的吸光度来测定荧光素钠(岛津UV-2401PC分光光度计)。
通过三个泵(Gilson Mini-puls 3)和上述的管道设置将总体积流速控制在10.2ml/min。将第一泵设置在第一出口16(2.6ml/min)，将第二泵设置在第二出口18(7.6ml/min)，将第三泵设置在第二入口17(1.7ml/min)。水从储水池到第一入口15的流动(8.5ml/min)不用泵控制。
经计算该系统中通道14中的雷诺数是37，并且假定为抛物线流动路径，经计算，将输入第二入口17的17％的总流量与输入第一入口的83％的总流量之间的界面距第一壁为64μm。经计算，出口区域中的相应数字为81μm。经计算，流体在通道中的停留时间是0.3秒～0.45秒。
声波关闭模式通过将第一出口16处的流速减小至第一入口处的流速的90％，由第一出口16可以得到视觉上清澈的输出，但分光光度计的测量显示仍然有大约9.1％转移。现在参考图4(a)，所测量到的荧光素钠的转移(·)与CFD计算结果非常吻合，并且证实转移的主要机理是由扩散控制的。
现在参考图4(b)，随着整体流速的上升，荧光素钠的转移(·)减少(在16.3ml/min大约为6％)。在所使用的所有流速下，酵母的转移(□)均比荧光素的转移低得多。
声波模式开启用信号发生器(Hewitt Packard 3325A)和放大器(240L型，Rochester，美国)给换能器19施加频率为2.96MHz的17Vp-p的交变电势。通过用示波器(Agilent，5462A)监测电流和电压之间的相角的最小值来确定共振频率。
现在参考图4(c)，可以观察到酵母细胞在第一出口16的输出中的数量急剧上升(根据流速为5倍～40倍)。同样可以观察到荧光素钠的转移增加，但是在该电压下小于1％。对于初始酵母浓度为1.53×107ml-1的情况，在17Vp-p下以10ml/min的流速可以使酵母从荧光素钠中的分离最优化(x-x线，右手坐标)。
尽管在直至约30Vp-p的更高电压荧光素钠的转移同样增加，但仍可以获得增加的酵母转移。在这种大小的电压下，第一出口16的输出与第二出口18的输出非常相似。
在没有酵母细胞的情况下研究荧光素钠转移的类似实验显示，在高压下发生最高40％的转移。但是，温度效应的影响甚微。在17Vp-p下，据认为荧光素钠随酵母传送的夹带只占传送量的大约10％(CFD计算)。
综合这些结果表明，声波流动是使荧光素钠转移的主要原因。入口样品的最优混合需要较高的酵母浓度，该酵母浓度通过粘着或者凝集以及高电压来影响荧光素钠转移。
当分子物种具有比荧光素钠更低的扩散系数时，根据本发明的方法可以预期获得改善的分离效率。
权利要求
1.一种用于将夹带在第一流体中的颗粒移动到第二流体的设备，该设备包括管道、用于使各流体的层流在管道内接触的装置和能够产生具有位于管道内的压力波节点的超声驻波的装置。
2.如权利要求1所述的设备，其中用于使层流接触的装置使两种流体之间的混合最小化。
3.如权利要求1或2所述的设备，其中用于使层流接触的装置分别包括与管道连通的用于各个流体的入口装置和出口装置。
4.如权利要求3所述的设备，其中所述各入口装置和出口装置彼此垂直。
5.如前述任一项权利要求所述的设备，其中所述压力波节点沿着管道的纵向长度设置在中心。
6.如前述任一项权利要求所述的设备，其中可以产生驻声波的装置包括适用于产生和发射声波的管道的第一壁和用于反射所产生的声波的相对于第一壁的第二壁。
7.如权利要求6所述的设备，其中所述管道的第一壁包括压电陶瓷材料。
8.如权利要求7所述的设备，其中所述压电陶瓷材料与交变电势源相连。
9.一种从第一流体向第二流体移动颗粒的方法，该方法包括以下步骤i)在与能够在管道中产生超声驻波的装置相连的管道内，使各个流体的层流相互接触，和ii)在管道内产生具有压力波节点的驻波。
10.清洗颗粒的方法，所述方法如权利要求9所述。
11.混合样品的方法，所述方法如权利要求9所述。
12.一种设备，该设备基本上为以上参考附图所描述的设备，以及基本上为如附图所示的设备。
13.一种清洗颗粒的方法，该方法基本上为以上参考附图所描述的方法，以及基本上为如附图所示的方法。
全文摘要
本发明披露了一种用于将夹带在第一流体中的颗粒移动到第二流体的设备，该设备包括管道、用于使各流体的层流在管道内接触的装置和能够产生具有位于管道内的压力波节点的超声驻波的装置。
文档编号G01N1/28GK1703271SQ200380101256
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月10日 优先权日2002年10月10日
发明者杰里米·约翰·霍克斯, 威廉·特伦斯·科克利 申请人:英国国防部
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