专利名称：血细胞计数用试剂及血液分析方法
技术领域：
本发明涉及一种与从生物体采集的毛细血管血混合的血细胞计数用试剂，以及使用粒子分析仪对从生物体采集的毛细血管血中含有的血细胞进行计数的血液分析方法。
背景技术：
通常，作为对血液中的成分进行计数的方法，使用了被称为“流式细胞术”的分析手段的粒子分析仪。 在对血液中的红细胞进行计数时，将采集的血液在生理盐水中稀释制成血液样品，将该血液样品供给粒子分析仪，对具有特定范围的粒子体积(例如，36 360fL (飞升I(T15L)左右)的粒子逐个计数。这时，与红细胞几乎相等体积的白细胞也会同时被计数，通常血液中的白细胞浓度相对于红细胞浓度为0. ro. 2%左右，因此，可忽略由于多余计数的白细胞所产生的误差。相比之下，在对血液中的白细胞进行计数时，将采集的血液在溶血试剂中稀释制成血液样品，将该血液样品供给粒子分析仪后，对具有特定范围的粒子体积(例如，25 450fL左右)的粒子逐个计数。溶血试剂中含有破坏血细胞的细胞膜的成分，由于红细胞没有细胞核，当细胞膜被破坏则血红蛋白流出，红细胞失去了作为细胞的形状和体积而解体。另一方面，由于白细胞具有细胞核，可变成裸核状态的粒子分散于血液样品中。因此，将红细胞已解体的血液样品供给粒子分析仪，对具有特定范围的粒子体积的粒子进行计数，可对白细胞进行计数。血液分析时，作为从生物体采集血液的方法，包括以下两种方法从皮下静脉采集静脉血的方法；以及从指尖或耳垂采集毛细血管血的方法。将静脉血用溶血试剂稀释得到的血液样品在粒子分析仪中进行分析的情况下，如图11的白细胞体积直方图所示，由于血小板或红细胞的解体残渣等引起的噪音(假峰G)和白细胞引起的峰(白细胞峰W)可被清楚地分开，因此，可较高精度地对白细胞进行计数。采集静脉血是将注射针插入皮下静脉，由于是从血管内直接采集血液，因此刚采血后几乎不认为有血小板的凝集。此外，对于静脉血，采集后，通过用配合有作为抗凝剂(抗血小板凝固剂)的乙二胺四乙酸盐的溶血试剂进行稀释，可建立抑制血液样品中血小板凝集的手段(例如，参照下述专利文献I)。专利文献专利文献I特开平3-144364号公报发明内容
然而，在用溶血试剂稀释毛细血管血得到的血液样品经粒子分析仪进行分析的情况下，如图12的白细胞体积直方图所示，假峰G的拖尾部T和白细胞峰W的前伸部R有较大范围的重叠，因此不能高精度地对白细胞进行计数。其原因是，从假峰G的拖尾部T到白细胞峰W的前伸部R的范围内，血小板凝集生成的血小板凝集块被误数(miscount)。毛细血管血的采集如下进行用刺血针浅浅地刺进指尖或耳垂等位置，采集极少量血液，该方法在简单且快速采集血液方面很出色，但由于采集时易混入组织液，因此采集后血小板会迅速凝集。
乙二胺四乙酸盐虽具有抑制血小板凝集的作用，但没有使已凝集的血小板凝集块解离的作用。因此，即使用添加了乙二胺四乙酸盐的溶血试剂稀释采集后血小板快速凝集的毛细血管血，也不能使已凝集的血小板凝集块解离。本发明为解决上述技术课题而开发，其目的是提供使从生物体采集的毛细血管血中的血小板凝集块解离，可高精度地对白细胞等血细胞进行计数的新型血细胞计数用试剂以及血液分析方法。本发明的血细胞计数用试剂是在使用粒子分析仪对从生物体采集的毛细血管血中含有的血细胞进行计数时，用于稀释所采集的毛细血管血以制成血液样品的血细胞计数用试剂，其特征在于，所述血细胞计数用试剂是含有氯喹盐(chloroquine salt)的水溶液。本发明的血细胞计数用试剂是在通过“粒子分析仪”对从生物体采集的“毛细血管血”中含有的白细胞等血细胞进行计数时，将采集的毛细血管血稀释，制成血液样品的试齐U。本文中，“毛细血管血”是指用刺血针刺进指尖或耳垂等位置得到的血液(指尖血或耳垂血)。此外，“粒子分析仪”是指利用使细小的粒子在流体中分散，使该流体薄薄地流动，对各种粒子进行计数的、被称为“流式细胞术”的分析方法的粒子分析仪(流式细胞仪或库尔特计数器)。该粒子分析仪大体分为可通过检测光散射或荧光等的光学检测方法的仪器以及可利用检测粒子通过小孔时阻抗变化的电阻检测方法的仪器，而电阻检测方法具有简便的优点。本发明的血细胞计数用试剂中含有的“氯喹盐”是指可使毛细血管血中的血小板凝集块解离，具有喹啉骨架、引入氯原子基团的化合物。特别是，优选在喹啉骨架的7位引入氯原子基团，且在喹啉骨架的4位引入氨基的氯喹啉衍生物的盐。作为该氯喹盐的具体例子，可列举氯喹二磷酸盐(7-氯-4-[4-( 二乙氨基)-1-甲基丁基氨基]喹啉二磷酸盐)或羟氯喹硫酸盐(7-氯-4-[4-N-乙基-N-(2-羟乙基)氨基]-I-甲基丁基氨基喹啉硫酸盐)等。本发明的血细胞计数用试剂中，氯喹盐为10g/L以上的方式成为优选的方式。通常的白细胞计数中，实施对从生物体采集的血液用试剂稀释10(T500倍左右的稀释步骤，发现当试剂中含有极少量的氯喹盐时，可以通过实施稀释步骤而使血小板凝集块获得解离。从血小板凝集块解离的观点出发，对氯喹盐配合比例的上限没有特别的限制。但是，氯喹盐的配合比例增高会使试剂的原料价格升高，因此，作为氯喹盐的配合比例，优选100g/L作为上限。本发明的血细胞计数用试剂进一步含有具有溶血作用的“表面活性剂”的方式成为优选的方式。作为表面活性剂，在与血液混合时，只要具有在破坏血细胞的细胞膜而使血液中的红细胞解体的同时，使白细胞成为裸核状态的作用，就没有特别的限制。此外，作为表面活性剂，离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可以。作为离子表面活性剂，优选为阴离子表面活性剂；更进一步，作为阴离子表面活性剂，优选季铵盐。作为该季铵盐的具体例子，可列举十六烷基三甲基铵或十二烷基三甲基铵等的氯化物或溴化物。另一方面，作为非离子表面活性剂的具体例子，可列举皂苷。此外，本发明的血细胞计数用试剂不仅优选单纯地通过配合氯喹盐使血小板凝集块解离，还通过将表面活性剂的浓度限定在特定范围内，使在白细胞体积直方图上的白细胞峰明显。从上述观点出发，本发明的血细胞计数用试剂中，前述表面活性剂的含量为l(T50g/L的方式成为优选的方式。如果血细胞计数用试剂中表面活性剂的含量为10g/L以上，在实施所述的用该血细胞计数用试剂稀释步骤时，发现血细胞的细胞膜被破坏而使血液中的红细胞解体的同时，可使白细胞成为裸核状态。另一方面，如果血细胞计数用试剂中表面活性剂的含量超过 50g/L,会使血液样品中的白细胞体积变小。因此，本发明的血细胞计数用试剂中,表面活性剂的配合比例优选在l(T50g/L (进一步优选2(T40g/L)的范围内。此外，从同样的观点出发，本发明的血细胞计数用试剂中，通过进一步含有“电解质”而将渗透压调节为20(T6000Sm/kg的方式成为优选的方式。作为前述“电解质”，在水中溶解时，只要是具有可电离成阳离子(钠离子、钾离子、钙离子、镁离子等)和阴离子(氯化物离子、溴化物离子、磷酸离子等)的性质的物质，就没有特别的限制。作为电解质的具体例子，可列举氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁、磷酸钠、磷酸钾等。本文中，如果血细胞计数用试剂中含有的电解质过少，血细胞计数用试剂的渗透压不到2000sm/kg，会引起白细胞的膨胀、解体。另一方面，如果血细胞计数用试剂中含有的电解质过多，血细胞计数用试剂的渗透压超过6000sm/kg，会引起白细胞的体积减�。紫赴逑虻吞寤嗥贫爰俜褰咏�。因此，本发明中，通过前述电解质，将血细胞计数用试剂的渗透压调节为20(T6000sm/kg (进一步优选为30(T4000sm/kg)的范围的方式成为优选的方式。由此，可防止白细胞峰与假峰过于接近。本发明的血细胞计数用试剂中，将血液样品供给粒子分析仪时得到的白细胞体积直方图中，假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部重叠分布的波谷的相对频率的最小值位于粒子体积35 50fL范围内的方式成为优选的方式。通过粒子分析仪计数得到的白细胞体积直方图中，如果假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部重叠分布的波谷的相对频率的最小值位于粒子体积35飞OfL的范围内，可使白细胞峰变得明显；此外，可防止白细胞峰与假峰过于接近，由此可减少因血小板凝集块引起的误数。由此，可高精度地对白细胞进行计数。在本发明的血细胞计数用试剂中进一步含有“抗凝剂”的方式成为优选的方式。作为“抗凝剂”，是指具有抑制血小板凝固性质的物质。本发明的血细胞计数用试剂中，通过进一步含有抗凝剂,可抑制血液样品中的血小板(包含由氯喹盐解离的血小板)的凝集。作为抗凝剂的具体例子，可列举EDTA (乙二胺四乙酸)的盐(例如EDTA-2Na (二钠盐)、EDTA-2K (二钾盐)、EDTA-3Na (三钠盐)、EDTA-3K (三钾盐)等)，或肝素、乙酰水杨酸、硫酸镁等。作为抗凝剂的配合比例，没有特别的限制，优选0. oro. 2g/L。
为了稳定其pH (氢离子浓度指数)，优选用缓冲溶液稀释本发明的血细胞计数用试齐U。此外，也可进一步配合用于调节表面张力的非离子表面活性剂、为调节PH的pH调节剂、使裸核状态的白细胞稳定的I吴保护剂、提闻保存稳定性的防腐剂等其他各种添加剂。作为“缓冲溶液”的具体例子，可列举醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、硼酸缓冲溶液、酒石酸缓冲溶液及Tris缓冲溶液等。作为“pH调节剂”的具体例子，可列举氢氧化钠和盐酸。作为用于调节表面张力的非离子表面活性剂，只要分子内具有亲水基团和疏水基团，具有能降低血细胞计数用试剂的表面张力的性质，就没有特别的限制。作为非离子表面活性剂的具体例子，可列举聚氧乙烯癸基醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等的“醚型非离子表面活性剂”;聚氧乙烯月桂酸酯、聚氧乙烯油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇油酸酯、失水山梨醇单(或二)油酸酯、失水山梨醇单(或二)月桂酸酯、失水山梨醇单(或二)异硬脂酸酯等的“酯型 非离子表面活性剂(包含醚酯型非离子表面活性剂)”。作为“防腐剂”的具体例子，可列举叠氮化钠、吡硫钠、凯松CG、R0CIMA (商标)553、
硫柳汞等。作为“膜保护剂”的具体例子，可列举异丙醇等低级醇、或戊二醛、二甲基脲、葡萄糖等。本发明的血液分析方法是使用粒子分析仪对从生物体采集的毛细血管血中含有的白细胞等血细胞进行计数的血液分析方法，其特征在于，所述血液分析方法实施以下步骤从生物体采集毛细血管血的采血步骤；将采集的毛细血管血用前述本发明的血细胞计数用试剂稀释制成血液样品的稀释步骤；以及将所述血液样品供给粒子分析仪，对所述血液样品中的白细胞进行计数的测量步骤。本发明的血液分析方法中，在所述测量步骤中，在粒子体积35飞OfL的范围内，确定计数初始体积，将具有所确定的计数初始体积以上体积的粒子作为白细胞进行计数的方式成为优选的方式。通过粒子分析仪对白细胞进行计数是将血液样品中具有的特定范围的粒子体积的粒子视为白细胞，对该范围内的粒子逐一计数。即，前述“计数初始体积”是指该特定范围的下限值。此外，通过粒子分析仪对白细胞进行计数中，前述所确定范围的上限值只是单纯的计数终点，不作为特别重要的因素。通常以30(T500fL左右作为上限完成计数。根据本发明，可使从生物体采集的毛细血管血中的血小板凝集块解离，使用粒子分析仪对白细胞等血细胞进行计数，可高精度地对血细胞进行计数。
图I表示微型血细胞计数器中测量单元的顶视图。图2表示微型血细胞计数器中测量单元的侧视图。图3 (a)表示微型血细胞计数器中稀释液瓶的截面图；图3 (b)表示其底视图；图3 (C)表示其他实施方式中所述的稀释液瓶被设置在血细胞计数器的瓶导引装置上的状态的截面图；图3 (d)表不图3 (c)中所不的稀释液瓶的其他实施方式的部分截面图；图3(e)表示图3 (c)中所示的稀释液瓶的另一其他实施方式的部分截面图。图4是表示微型血细胞计数器中主体的顶视图。
图5表示微型血细胞计数器中主体的侧视图。图6表示将测量单元(附有稀释液瓶)插入血细胞计数器中主体的状态的透视图。图7 (a)、(b)分别表示对用实施例I、实施例2中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图；图7 (c)为对用比较例I中所述的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。图8 (a)、(b)、(c)、(d)分别表示对用实施例3、实施例I、实施例4、实施例5中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。图9 (a)、( b )、( c )分别表示对用实施例6、实施例I、实施例7中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图；图9 (d)、(e)表示对用比较例2、比较例3中所述的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。
图10 (a)、(b)、(c)分别表示对用实施例8、实施例I、实施例9中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图；图10 (d)、(e)表示对用比较例4、比较例5中所述的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。图11表示对用现有的血细胞计数用试剂稀释静脉血制成的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。图12表示对用现有的血细胞计数用试剂稀释毛细血管血制成的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。附图标记说明I测量单元2树脂基板3外部连接用流路7储液用池9吸光度测量池11检测流路13毛细管16传感器安装部17 泵接口18毛细管收纳流路19瓶导引装置14 电极145传感器芯片15 电极20传感器基板23稀释液瓶24 容器27空气孔25 膜
26密封条51 壳体53三通电磁阀54三通电磁阀55隔膜泵61液晶显示屏62电路板63盒体安装部 100 主体S血细胞计数用试剂G 假峰W白细胞峰R前伸部T拖尾部
具体实施例方式以下对本发明的一个实施方式进行说明，但本发明不仅限于该实施方式。粒子分析仪本实施方式中，使用的粒子分析仪为株式会社堀場製作所社制造的微型血细胞计数器(商品名(临时名称)Palm-LC)0测量单元I图I和图2表示微型血细胞计数器中的测量单元I。该测量单元I为以PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)等树脂制成的盒体。该测量单元I的树脂基板2含有外部连接用流路3，所述外部连接用流路3的一端连接至泵接口 17 ;储液用池7，所述储液用池7被连接至所述外部连接用流路3的另一端，具有通过壁4、5、6部分分隔形成的流路；吸光度测量池9，所述吸光度测量池9通过流路8连接至所述储液用池7 ;检测流路11，所述检测流路11通过流路10连接至所述吸光度测量池9 ;毛细管13，所述毛细管13通过大致S形的流路12连接至所述检测流路11 ;传感器安装部16，所述传感器安装部16设置在流路10和流路12之间。前述树脂基板2上的各个构成部件分别以预定的深度和宽度形成。如图2所示，树脂基板2包括树脂基板2a和树脂基板2b，树脂基板2a上，例如以深度为4mm形成储液用池7，此外，以预定深度形成吸光度测量池9。另一方面，在树脂基板2b上，例如以深度1mm、宽Imm形成外部连接用流路3、流路8、流路10、流路12、检测流路11、毛细管收纳流路18。此外，树脂基板2b上形成传感器安装部16。此外，树脂基板2a、2b上分别形成的流路或其他的构成部件的布局不限于上述记载，构成部件的深度、宽度、长度根据可使树脂基板2a、2b得以有效利用的方式进行布局。在如上所述的树脂基板2a和树脂基板2b上形成各个预定的构成部件之后，例如用粘合剂或双面胶将树脂基板2a和树脂基板2b贴合以不漏液后，接着，在毛细管收纳流路18内，埋入例如玻璃制的毛细管13，通过粘合剂等将毛细管13固定于毛细管收纳流路18，同时，将毛细管13的外圆周表面和毛细管收纳流路18的内圆周表面之间的缝隙填塞。接下来，在使瓶导引装置19的中心与毛细管13的中心重合的状态下，使该瓶导引装置19与树脂基板2a、2b的端面贴合。另外，在泵接口 17与外部连接用流路3连接的状态下，使泵接口 17与树脂基板2a、2b的端面贴合。在传感器芯片145上，设置有用于检测血液样品阻抗变化的电极14、15。将其上装配有该传感器芯片145的传感器基板20贴附到传感器安装部16上，形成传感器单元，从而完成本微型血细胞计数器的测量单元I。通过将传感器芯片145装配到传感器基板20上，电极14、15分别与引线21、22连接，可将来自传感器单元的信号由引线21、22导出。上述说明中，将传感器芯片145在之后的步骤中贴附到传感器安装部16，但也可将传感器芯片145成型于树脂基板2a或树脂基板2b上，然后通过溅射等将电极14、15安装到传感器芯片145上。稀释液瓶23图3 Ca)和图3 (b)所示为稀释液瓶23。该稀释液瓶23包括盛装血细胞计数用试剂S的容器24、该容器24顶部设置的空气孔27、密封空气孔27的密封条26、以及容器24底部开口处贴附的膜25。该稀释液瓶23在容器24内盛装有血细胞计数用试剂S，由密封条26和膜25进行密封。作为该稀释液瓶23，不仅限于如图3 (a)及图3 (b)所示的情况，例如，图3 (c)所示的稀释液瓶23如此形成容器24的下部直径缩�。谀�25的下侧，设置有引管部28，容器24、膜25和引管部28 —体成形。该稀释液瓶23如此设置使得当使容器24沿着瓶导引装置19滑动，引管部28与毛细管13的外圆周表面大体接触，能使该毛细管13导入到膜25中。此外，该稀释液瓶23在密封条26的中央设置例如由树脂止回阀构成的大气连通部261，在膜25上插通毛细管13的同时或之前，用没有图示出的通气针插通以连通大气。此外，图3 (c)中，容器24、膜25和引管部28虽为一体成形，但如图3 (d)所示，稀释液瓶23也可以如下构成在容器24底部开口处贴附有膜25，此处装配另一部件引管部281。此外，如图3 (e)所示，稀释液瓶23也可以是代替膜25，在该膜25的位置上，将球体29压装进容器24内，使其盛装血细胞计数用试剂S，测量时，通过毛细管13将球体29塞入容器24内，由此使稀释液瓶23启封。作为该容器24的容积并没有特别的限制，使用那些与所用的微型血细胞计数器或血细胞计数用试剂S的稀释倍数等相适应的容积，例如，容器24的容积可使用0. r2毫升，进一步优选为0. 3^1. 0毫升，更优选为0. 5毫升。主体100图4、图5表示微型血细胞计数器的主体100。微型血细胞计数器的主体100被壳体51覆盖，该壳体51内配备有三通电磁阀53、54 ;隔膜泵55 ;电池56、57、58、59 ;IXD (液晶显示屏)61 ;电路板62 ;以及盒体安装部63。此外，以能从外部看到IXD 61显示的方式，在壳体51顶面的窗框上贴有透明板60。在从壳体51的侧面到底面区域，设置有电池盖65，所述电池盖被打开或闭合以便能在内部放置或者更换电池56、57、58、59。隔膜泵55的加压侧连接有三通电磁阀53的通用端口，同样，隔膜泵55的减压侧连接有三通电磁阀54的通用端口。此外，三通电磁阀53的NO端口(通常开的端口)连接三通电磁阀54的NC端口(通常关的端口)，三通电磁阀53的NC端口连接三通电磁阀54的NO端口。此外，三通电磁阀53的NO端口与三通电磁阀54的NC端口的连接线为将盒状的前述测量单元I装配到盒体安装部63时，与测量单元I的泵接口 17连接。三通电磁阀53、54，隔膜泵55以及IXD 61等均由电池56、57、58、59供给电源；三通电磁阀53、54，隔膜泵55以及LCD61等均由电路板62上的控制电路控制。此外，检测出的显示阻抗变化的信号供给电路板62上的运算电路，由此测量血液样品中的血细胞，该测量结果显示于LCD 61。本发明的血液分析方法接下来，就使用具有前述构成的微型血细胞计数器的本发明的血液分析方法进行说明。本发明的血液分析方法中，首先实施从生物体采集毛细血管血的采血步骤。本实施方式中，用毛细管13的尖端刺进受试者(生物体)的例如指尖，利用毛细现象进行采血步骤，采集毛细管13内的毛细血管血(I ii L)。本发明的血液分析方法中，然后实施稀释步骤，将采集的毛细血管血用本发明的 血细胞计数用试剂S稀释制成血液样品。本实施方式的稀释步骤为首先，使装有本发明的血细胞计数用试剂S的稀释液瓶23沿着瓶导引装置19滑动，用毛细管13的尖端破坏稀释液瓶23的膜25，由此，使毛细管13的尖端插入稀释液瓶23内。之后，剥去稀释液瓶23的密封条26。由此，使稀释液瓶23顶部的孔打开而与大气连通。当将该测量单元I插装在微型血细胞计数器的主体100内时，泵接口 17与内置在微型血细胞计数器的主体100内的隔膜泵55连接。此外，传感器基板20与主体100的阻抗测量电路电连接。此外，将前述隔膜泵55加压驱动，自泵接口 17经由外部连接用流路
3、储液用池7、流路8、吸光度测量池9、流路10、检测流路11以及流路12向毛细管13内施压，将毛细管13内的毛细血管血压入稀释液瓶23中。这时，稀释液瓶23内通过鼓泡使毛细血管血与血细胞计数用试剂S混合，制成由血细胞计数用试剂S稀释的血液样品(稀释倍数251倍)。本发明的血液分析方法中，在前述稀释步骤之后，实施对血液样品中的白细胞进行计数的测量步骤。本实施方式中，该测量步骤为首先，将前述的隔膜泵55减压驱动，自泵接口 17经由外部连接用流路3、储液用池7、流路8、吸光度测量池9、流路10、检测流路11以及流路12使毛细管13内减压。由此，通过毛细管13以及流路12，将稀释液瓶23中的血液样品导入检测流路11。此处，该检测流路11中设置的电极14、15间的阻抗发生变化，根据该阻抗变化，使用微型血细胞计数器测量血液样品中的粒子。通过检测流路11的稀释血液经由流路10流至吸光度测量池9。此外，除白细胞的计数外、还测量血红蛋白量的情况下，通过光学传感器(图上未示出)检测吸光度测量池9的吸光度，可测量血液样品中的血红蛋白。进一步，通过吸光度测量池9的血液样品经由流路8流至储液用池7，作为废液储存。测量步骤结束后，从微型血细胞计数器的主体取出测量单元1，同时废弃储液用池7储存的血液样品。实施例实施例I将作为氯喹盐的氯喹二磷酸盐20g/L和作为季铵盐的十六烷基三甲基溴化铵36. 6g/L溶解于0. 5M磷酸缓冲溶液，加入作为电解质的氯化钠，由此制成本发明所述的血细胞计数用试剂，其渗透压已被调节至3900sm/kg。此外，渗透压为通过京都第一科学社制造的渗透压测量装置(商品名才文' * 7夕卜(Osmostat) 0M-6020)测量的值(下同)。实施例2
除使用十二烷基三甲基氯化铵(36. 6g/L)作为季铵盐以外，其他与实施例I相同，制成本发明所述的血细胞计数用试剂，其渗透压已被调节为3900sm/kg。比较例I除不配合氯喹盐以外，其他与前述实施例I相同，制成血细胞计数用试剂，其渗透压已被调节为3900sm/kg。
将实施例I和实施例2中所述的本发明的血细胞计数用试剂和比较例I中所述的血细胞计数用试剂分别封装入不同的稀释液瓶23。然后，通过用前述测量单元I中的毛细管13的尖端刺进受试者的手指尖，由此在毛细管13内采集毛细血管血，将毛细管13的尖端插入稀释液瓶23后，将前述测量单元I插入微型血细胞计数器的主体100的盒体安装部63，由此实施本发明的血液分析方法。通过该分析方法得到的白细胞体积直方图如图7Ca)-图7 (C)所示。图I (a)和图I (b)所示的白细胞体积直方图是分别对用实施例I和实施例2中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量的结果。图7 (a)和图7 (b)所示的白细胞体积直方图中，每种情况下，假噪音G与白细胞峰W能清楚地分离，可发现几乎没有血小板凝集块引起的误数的影响。此外，在每种情况下，假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部重叠分布的波谷的相对频率的最小值为粒子体积均位于35飞OfL的范围内。因此，在粒子体积35 50fL的范围内，确定计数初始体积，将具有所确定的计数初始体积以上体积的粒子作为白细胞进行合计，可高精度地对白细胞进行计数。另一方面，图7 (C)所示的白细胞体积直方图是对用比较例I中所述的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量的结果。该白细胞体积直方图中，假峰明显更大，该拖尾部向闻体积方向延伸，与白细胞峰的如伸部有大范围的重置。因此，发现即使从粒子体积35^50fL的范围内确定计数初始体积，也会产生血小板凝集块引起的误数，不能高精度地对白细胞进行计数。实施例T5除改变氯喹盐的配合量为10g/L (实施例3)、40g/L (实施例4)、80g/L (实施例5)以外，其他与实施例I相同，制成血细胞计数用试剂。除前述实施例I中的血细胞计数用试剂外，分别使用实施例3飞中的本发明的血细胞计数用试剂，实施本发明的血液分析方法进行毛细血管血的测量。得到的白细胞体积直方图如图8 (a)-图8 (d)所示。图8 (a)、(b)、(c)、(d)分别表示对用实施例3、实施例I、实施例4、实施例5中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。从图8 Ca)-图8 (d)所示的结果发现，如果血细胞计数用试剂中氯喹盐的配合量为10g/L以上，可使血小板凝集块解离，假峰G的拖尾部T与白细胞峰W的前伸部R重叠范围变窄，几乎没有误数的影响。实施例6、实施例7除改变季铵盐的配合量为10g/L (实施例6)、50g/L (实施例7)以外，其他与实施例I相同，制成本发明所述的血细胞计数用试剂。比较例2、比较例3除改变季铵盐的配合量为5g/L (比较例2)、100g/L (比较例3)以外，其他与实施例I相同，制成血细胞计数用试剂。除前述实施例I中所述的血细胞计数用试剂外，分别使用实施例6、实施例7和比较例2、比较例3中所述的血细胞计数用试剂，实施本发明的血液分析方法进行毛细血管血的测量。得到的白细胞体积直方图如图9 (a)-图9 (e)所示。图9 (a)、图9 (b)、图9 (C)分别表示对用实施例6、实施例I、实施例7中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。图9(d)、实施例(e)分别表示对用比较例2、比较例3中所述的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。从图9 Ca)-图9 (e)所示的结果发现，如果血细胞计数用试剂中季铵盐的配合量不到10g/L，不能得到明显的白细胞峰。另一方面，发现如果血细胞计数用试剂中季铵盐的配合量超过50g/L，会使白细胞峰向低体积方向移动，假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部有 大的重叠。因此，发现如果血细胞计数用试剂中季铵盐的配合量为l(T50g/L，假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部重叠分布的波谷的相对频率的最小值可位于粒子体积35飞OfL的范围内。实施例8、实施例9通过改变作为电解质而配合的NaCl的量，除将渗透压调节为2000sm/kg (实施例8)、6000sm/kg (实施例9)以外，其他与实施例I相同，制成本发明所述的血细胞计数用试剂。比较例4、比较例5通过改变作为电解质而配合的NaCl的量，将渗透压调节为1000sm/kg(比较例4)、10000sm/kg (比较例5)以外，其他与实施例I相同，制成血细胞计数用试剂。除前述实施例I中的血细胞计数用试剂外，分别使用实施例8、实施例9及比较例
4、比较例5中所述的血细胞计数用试剂，实施本发明的血液分析方法，进行毛细血管血的测量。得到的白细胞体积直方图如图10 (a)-图10 (e)所示。图10 (a)、图10 (b)、图10 (C)分别表示对用实施例8、实施例I、实施例9中所述的本发明的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。此外，图10 (d)、图10 Ce)分别表示对用比较例4、比较例5中所述的血细胞计数用试剂稀释的血液样品进行测量得到的白细胞体积直方图。从图10 (a)_图10 (e)所示的结果发现，如果血细胞计数用试剂的渗透压不足2000sm/kg，不能得到明显的白细胞峰。另一方面，发现如果血细胞计数用试剂的渗透压超过6000sm/kg，会使白细胞峰向低体积方向移动，假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部有大的重叠。因此，发现如果血细胞计数用试剂的渗透压为20(T6000Sm/kg，假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部重叠分布的波谷的相对频率的最小值可位于粒子体积35飞OfL的范围内。只要不脱离其精神或主要特征，本发明可以其他各种形式实施。因此，上述实施例并非所有点的简单举例，不能限制性地进行解释。本发明的范围如权利要求书的范围所示，而不受说明书中内容的限制。进一步地，属于权利要求书范围内的同等范围内的变形或变更，也全部属于本发明的范围。
工业实用性
本发明可高精度地对毛细血管血中的白细胞进行计数，在分析血小板或红细胞以外的血液成分时也可使用。
权利要求
1.一种血细胞计数用试剂，所述血细胞计数用试剂在使用粒子分析仪对从生物体采集的毛细血管血中含有的血细胞进行计数时，用于稀释所采集的毛细血管血以制成血液样品，其特征在于，所述血细胞计数用试剂是含有氯喹盐的水溶液。
2.如权利要求I所述的血细胞计数用试剂，其中，所述氯喹盐的含量为10g/L以上。
3.如权利要求I所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂进一步含有具有溶血作用的表面活性剂。
4.如权利要求2所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂进一步含有具有溶血作用的表面活性剂。
5.如权利要求3所述的血细胞计数用试剂，其中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
6.如权利要求4所述的血细胞计数用试剂，其中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
7.如权利要求3所述的血细胞计数用试剂，其中，所述表面活性剂的含量为l(T50g/L。
8.如权利要求6所述的血细胞计数用试剂，其中，所述表面活性剂的含量为l(T50g/L。
9.如权利要求I所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂通过进一步含有电解质将渗透压调节为20(T6000sm/kg。
10.如权利要求8所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂通过进一步含有电解质将渗透压调节为20(T6000sm/kg。
11.如权利要求I所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂是这样的试剂在将所述血液样品供给所述粒子分析仪时得到的白细胞体积直方图中，使假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部重叠分布的波谷的相对频率的最小值位于粒子体积35飞OfL的范围内。
12.如权利要求10所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂是这样的试剂在将所述血液样品供给所述粒子分析仪时得到的白细胞体积直方图中，使假峰的拖尾部与白细胞峰的前伸部重叠分布的波谷的相对频率最小值位于粒子体积35飞OfL的范围内。
13.如权利要求I所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂进一步含有抗凝剂。
14.如权利要求12所述的血细胞计数用试剂，其中，所述血细胞计数用试剂进一步含有抗凝剂。
15.一种使用粒子分析仪对从生物体采集的毛细血管血中含有的血细胞进行计数的血液分析方法，其特征在于，所述血液分析方法实施以下步骤 从所述生物体采集所述毛细血管血的采血步骤； 将上述采集的毛细血管血用血细胞计数用试剂稀释制成血液样品的稀释步骤，所述血细胞计数用试剂是含有氯喹盐的水溶液；以及 将所述血液样品供给粒子分析仪，对所述血液样品中的白细胞进行计数的测量步骤。
16.如权利要求15所述的血液分析方法，其中，在所述测量步骤中，在粒子体积35~50fL的范围内，确定计数初始体积，将具有所确定的计数初始体积以上体积的粒子作为白细胞进行计数。
17.一种密闭盛装血细胞计数用试剂的稀释液瓶，所述血细胞计数用试剂是含有氯喹盐的水溶液。
18.如权利要求17所述的密闭盛装血细胞计数用试剂的稀释液瓶，其中，以使用所述稀释液瓶的粒子分析仪采集的血液样品体积的100飞00倍的量盛装所述血细胞计数用试剂。
19.如权利要求18所述的密闭盛装血细胞计数用试剂的稀释液瓶，其中，所述稀释液瓶是如下的稀释液瓶在所述稀释液瓶的容器底部开口处设置有膜，所述膜被设置于粒子分析仪的毛细管的尖端所破坏；在所述容器顶部的空气孔上，贴附有密封条，将所述容器内的所述血细胞计数用试剂进行密封。
20.一种具有如下设置的粒子分析仪使用血细胞计数用试剂，所述血细胞计数用试剂是含有氯喹盐的水溶液，在测量步骤中，在粒子体积35 50fL的范围内，确定计数初始体积，将具有所确定的计数初始体积以上体积的粒子作为从生物体采集的毛细血管血中含有的白细胞进行计数。
全文摘要
本发明的目的是提供一种可使从生物体采集的毛细血管血中的血小板凝集块解离，从而能高精度地对白细胞等血细胞进行计数的新型血细胞计数用试剂以及血液分析方法。所述血细胞计数用试剂在使用粒子分析仪对从生物体采集的毛细血管血中含有的血细胞进行计数时，用于稀释所采集的毛细血管血以制成血液样品，其特征在于，所述血细胞计数用试剂是含有氯喹盐的水溶液。
文档编号G01N1/38GK102778425SQ201210144209
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者宫村和宏 申请人:株式会社堀场制作所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
