专利名称：用于kl-6测定的免疫测定试剂的制作方法
技术领域：
本发明技术领域涉及用于样品中KL-6测量的测定试剂和测定法。而且，本发明技术领域涉及免疫凝集技术、试剂和抑制该技术中非特异性反应的方法。
背景技术：
KL-6是参与肺纤维化(非专利文献(NPL) 1、专利文献(PTL) 1)的唾液酸化 (sialylated)糖类抗原。因为间质性肺炎中升高的KL_6水平和它们的波动表明病理学病征(PTL 1)，所以测量KL-6水平用于间质性肺炎的诊断和治疗策略的确定。已经公开了，通过测量血清MUC-1/KL-6水平预测由干扰素施用引起的间质性肺炎发作的方法(PTL 2)，通过测量KL-6在肺癌患者中检查预后的方法(PTL 3)，和通过测量胰液中的KL-6检测胰管内乳头状黏液癌或胰腺癌的方法(PTL 4)。近年来，增加了对于KL-6测量的需要，所述KL-6 测量用于间质性肺炎包括药物诱导的间质性肺炎、胶原蛋白失调诱导的间质性肺炎等的诊断和确定治疗策略，用于诊断具有肺癌、胰腺癌等的患者，和用于以类风湿性关节炎、局限性肠炎、全身型幼年特发性关节炎、巨淋巴结增生等的抗体制剂来治疗的患者中的间质性肺炎的诊断和确定治疗策略。在专利文献1-4中，已经将酶联免疫吸附测定(在下文中，ELISA法)用于KL_6测量。虽然ELISA是一种可靠方法，但对于大量样品的快速、容易和廉价测试，胶乳免疫凝集测定是较好的，并且其广泛用作用于测量痕量组分的临床试剂。然而，当通过免疫测量方法诸如ELISA或胶乳免疫凝集测试含有类风湿因子的样品时，因为来自取决于样品的类风湿因子的干扰而发生非特异性反应是已知的问题(NPL 2)。另外，由于来自嗜异抗体(抗-鼠免疫球蛋白抗体HAMA等和抗-山羊免疫球蛋白抗体HAGA等)的干扰而发生非特异性反应是已知的问题。已知的是，从结合至胶乳的抗体除去Fc部分的方法，一种使用结合至类风湿因子的抗体的方法(PTL 5)，和其它类似方法，在胶乳免疫凝集测定中抑制来自类风湿因子的干扰。然而，本发明人已经发现了即使通过上述方法也不能充分抑制其中发生非特异性反应的样品。现有技术文献专利文献[专利文献1]日本公开的审查的申请号1995-31207[专利文献2]日本公开的未审查申请号2005-121441[专利文献3]日本专利公布号4083855[专利文献4]日本公开的未审查申请号2006-308576[专利文献5]日本公开的未审查申请号1995-U818非专利文献[非专利文献1]间质性肺炎活性的新血清指示剂.唾液酸化糖类抗原KL-6(Newserum indicator of interstitial pneumonitis activity. Sialylated carbohydrate antigen KL-6). Kohno N, Kyoizumi S, Awaya Y, Fukuhara H, Yamakido M, Akiyama M.胸 (Chest). 1989 年 7 月；96(1) :68_73。[非专利文献2]用通过胶乳凝集方法检测C-反应性蛋白的类风湿因子的干扰 (Interference by rheumatoid factor with the detection of C-reactive protein by the latex agglutination method). Deyo RA, Pope RM, Persellin RH.风iS病学杂志 (J. Rheumatol) · 1980 年 5-6 月；7 (3) :279_87。发明概述本发明要解决的问题本发明目的是提供用于准确测量KL-6的测定试剂和测定法，特别是，用于准确测量含有类风湿因子和/或其它非特异性物质的样品中的KL-6的测定试剂和测定法。解决问题的方法通过本发明人的广泛研究显示，含有类风湿因子和/或其它非特异性物质的样品中的KL-6可以利用免疫测定试剂准确测量，所述免疫测定试剂包含含有类风湿因子干扰抑制剂的PH 4. O至5. 5的溶液和其上固定抗KL-6抗体的不溶载体。这导致本发明的完成。 更具体而言，本发明具有下列配置。(1)KL_6免疫测定试剂，所述免疫测定试剂包含含有类风湿因子干扰抑制剂的溶液(pH 4. O至5. 5)和含有其上固定抗KL-6抗体的不溶载体的溶液。(2)上述(1)的免疫测定试剂，其中所述不溶载体是胶乳颗粒。(3)KL-6免疫测定法，所述免疫测定法包括使用样品、类风湿因子干扰抑制剂和其上固定抗KL-6抗体的不溶载体来测量伴随着不溶载体凝集的吸光度变化，所述不溶载体凝集由在PH 4. O至5. 5的溶液中样品中KL-6和不溶载体上固定的抗KL-6抗体之间的免疫反应所致。(4)KL-6免疫测定法，其中将含有类风湿因子干扰抑制剂的pH 4. O至5. 5的溶液和其上固定抗KL-6抗体的不溶载体加入到样品，并且测量伴随着不溶载体凝集的吸光度变化，所述不溶载体凝集由样品中的KL-6和不溶载体上固定的抗KL-6抗体之间的免疫反应所致。(5)上述(3)或(4)的免疫测定法，其中所述不溶载体是胶乳颗粒。关于本发明中使用的类风湿因子干扰抑制剂没有特别的限制，只要它抑制免疫测定中类风湿因子干扰，并且可以提及与类风湿因子诸如IgM、IgG和IgA反应的 HBR(Scantibodies Lab)和动物来源的免疫球蛋白作为实例。如上所述，动物来源的免疫球蛋白可以是多克隆或单克隆抗体。使用的上述类风湿因子干扰抑制剂的量优选为10至200 μ g/mL。作为用于本发明的含有类风湿因子干扰抑制剂的pH 4. O至5. 5的溶液，可以提及向其添加类风湿因子干扰抑制剂的pH 4. O至5. 5的缓冲溶液，诸如柠檬酸、乙酸、甘氨酸和 Good' s缓冲液，并且上述缓冲溶液的浓度优选为5至200mM。如专利文献1中所述，可以在使用肺腺癌来源的细胞系VMRC-LCR作为抗原将小鼠免疫后，根据单克隆抗体生产的常规方法制备本发明中使用的抗KL-6抗体(通过细胞融合的产生特异性抗体的组织培养和肿瘤系的起源(Derivation of specificantibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion). Kohler G, MilsteinC.欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.) · 1976 年 7 月；6(7) :511-9)。作为本发明中使用的不溶载体的实例，可以提及有机聚合物粉末、无机粉末、微生物、血细胞和细胞碎片。作为上述有机聚合物粉末的实例，可以提及天然聚合物粉末诸如不溶琼脂糖、纤维素和不溶葡聚糖以及合成聚合物粉末诸如聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸酯共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物， 特别地，其中已经均勻悬浮合成聚合物粉末的胶乳是合乎需要的。作为上述无机粉末的实例，可以提及金属碎片诸如金、钛、铁和镍；二氧化硅；氧化铝和碳粉。虽然上述不溶载体的平均粒径取决于测定和测量装置，但是通常使用具有0. 05 至1. Oym直径的颗粒。作为将抗KL-6抗体固定在上述不溶载体上的方法实例，可以提及化学或物理结
I=I O上述其上固定抗KL-6抗体的不溶载体通常存在于溶液中，并且作为使用的溶液的实例，可以提及Tris、甘氨酸和Good' s缓冲液。可以提及生理学(生物学)来源的体液作为“分析物”，其是本发明测定法中的主要测量目标。可以具体提及血液、血清、血浆、尿、唾液、痰、泪、耳垢或前列腺液，但样品可以不限于这些。胶乳凝集和血细胞凝集反应是用于使用上述试剂测量抗体-抗原反应的测量系统的实例。作为测量由上述反应所引起凝集的方法，可以采用通过其进行光学检验凝集程度的方法。特别地，在光学检验方法中，将含有上述类风湿因子干扰抑制剂和样品的pH 4. O 至5. 5的溶液与上述其上固定抗KL-6抗体的不溶载体的溶液混合以后，测量伴随着不溶载体的凝集的散射光强度、吸光度或透射光强度，所述不溶载体的凝集由样品中KL-6和固定在不溶载体上的抗KL-6抗体之间的免疫反应所引起。这里，上述混合物的pH优选在4. O 至5. 5范围内。可以使用300至IOOOnm的测量波长，并且所述测定基于本领域技术人员的知识，根据使用的不溶载体的粒径、浓度和反应时间，测量散射光强度、吸光度或透射光强度的增加或减少。为了实施本发明的免疫测定，应当在其中样品、类风湿因子干扰抑制剂和其上固定抗KL-6抗体的不溶载体存在于pH 4. 0至5. 5溶液中的条件下，进行样品中的KL-6和固定在不溶载体上的抗KL-6抗体之间的免疫反应。优选地，作为上述pH 4. 0至5. 5的溶液的实例，可以提及5至200mM的柠檬酸、乙酸、甘氨酸和Good' s缓冲液。发明效果根据本发明，在使用不溶载体的凝集反应的免疫测定法诸如胶乳免疫凝集测定法中，即使当存在关于可归因于类风湿因子或嗜异抗体的非特异性反应、其中干扰不被结合至类风湿因子的抗体或多种动物来源抗体所抑制的非特异性反应、可归因于除类风湿因子或嗜异抗体以外的某物的非特异性反应、归因于使用抗体制剂的非特异性反应等的发生或增强的顾虑时，也可以快速、容易、廉价和准确地测试许多样品。
具体实施例方式材料和方法< 抗 KL-6 抗体 >将通过专利文献1中(特别在第一实施例中)描述的方法获得的抗体用作抗KL-6 抗体。专利文献1中描述的抗体生产方法如下---------1)免疫用5X IO6由肺腺癌细胞系(在下文，VMRC-LCR)获得的细胞将八周龄雌性BALB/c 小鼠皮下免疫，并且随后，以2周间隔用8X IO6细胞将小鼠腹膜内注射两次。2)细胞融合在最终免疫以后三天，将脾除去并将其通过不锈钢筛以制备细胞混悬液。将脾细胞(8. 4X IO7)与P3-NSI-Ag4/l(NSI)8-氮鸟嘌呤抗性骨髓瘤细胞(4. 2 X IO7)混合并且离心。接着，将ImL的45%聚乙二醇(平均分子量6000)加入到沉淀，并且将混合物轻轻搅拌 2分钟。在洗涤以后，将混合物悬浮在含有10%胎牛血清的RPMI培养基(完全RPMI培养基)中，并且以每孔0. ImL将IO6细胞加至96孔微量培养板。在M小时以后，添加0. ImL 含有100 μ M次黄嘌呤、0. 4 μ M氨基喋呤和16 μ M胸苷的完全RPMI培养基(HAT培养基)。 在培养开始后的第二、第三、第五、第七和第十天，将0. ImL培养上清液丢弃并且添加等体积(0. ImL)的HAT培养基。12天以后在全部孔中观察到杂交瘤的增殖。3)杂交瘤的选择通过酶免疫测定选择针对VMRC-LCR细胞产生抗体的杂交瘤。如下进行酶免疫测定在96-孔微量细胞培养板中培养VMRC-LCR细胞直到汇合，在0. 25%戊二醛中固定5至7分钟，并且洗涤五次。接着，添加0. ImL杂交瘤培养上清液，并且允许混合物在室温反应1小时。洗涤五次以后，添加50 μ L辣根过氧化酶-缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白作为第二抗体并且允许其反应1小时。洗涤六至七次以后，添加含有1. 过氧化氢溶液和 150 μ g/mL的2，2 ‘-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的100 μ L的50mM 柠檬酸缓冲液，并且允许混合物在室温下显色10分钟。接着，加入50μ L的10%草酸以终止反应。通过微量培养板分光光度计测量405nm的吸光度，并且选择具有0. 02以上吸光度的杂交瘤。将选择的杂交瘤转至其中已经附着BALB/c小鼠胸腺细胞(饲养细胞)的M孔培养板，并且用含有100 μ M次黄嘌呤和16 μ M胸苷的完全RPMI培养基(HT培养基)培养。达到汇合以后，通过酶免疫测定再次选择产生抗VMRC-LCR细胞的抗体的杂交瘤。接着，通过有限稀释法克隆所选择的杂交瘤。简言之，将细胞稀释至50或10细胞 /mL,以每孔0. ImL将其加至含有饲养细胞的96孔微量细胞培养板，并且用HT培养基培养2 周。选择来自具有单杂交瘤集落的孔的克隆。这些克隆通过酶免疫测定与VMRC-LCR细胞反应，并且选择杂交瘤克�。鲈咏涣隹寺》置诓欢哉Ｈ朔纬上宋赴允痉从Φ目固�。通过冷冻切片的免疫过氧化物酶染色，由这些克隆中选择与人肺成纤维细胞反应的克隆。具体而言，通过外科步骤获得人肺癌和其它器官的癌以及正常组织并且制备4-μ m 的冷冻切片。在丙酮固定以后，添加杂交瘤克隆培养上清液，并且允许将混合物在室温反应 30分钟。在彻底洗涤以后，允许混合物与生物素化的抗小鼠IgG抗体在室温反应(对γ 链、λ链和κ链反应)30分钟。进一步洗涤以后，添加抗生物素蛋白-生物素化的辣根过氧化酶，并且允许混合物在室温下反应1小时。彻底洗涤以后，添加含有0. 5mg/mL 二胺基联苯胺(作为底物)和0. 01%过氧化氢(pH 7. 0)的50mMTris-HCl缓冲液，并且允许混合物显色。用这样的方式，获得产生单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体与肺泡上皮；细支气管上皮；支气管腺浆液细胞；甲状腺滤泡细胞；食管上皮；贲门腺细胞；胰管上皮；管上皮；膀胱变移上皮；子宫内膜；肺腺癌；肺鳞状细胞癌；肺小细胞癌；胃、十二指肠乳头、胆管、胰腺、结肠、直肠、甲状腺和乳腺的腺癌；和食管鳞状细胞癌反应，但不与支气管上皮; 表面胃粘膜细胞；幽门腺；十二指肠上皮；结肠上皮；直肠上皮；肝细胞；胰腺外分泌细胞； 胰腺内分泌细胞；肾小球细胞；宫颈鳞状上皮细胞；皮层；宫颈鳞状细胞癌；和肝细胞癌反应。该杂交瘤命名为KL-6细胞并且将其产生的单克隆抗体命名为抗KL-6抗体。4)单克隆抗体产生体内移植预先(5至10天前)用0. 5mL的2，6，10，14-四甲基十五烷腹膜内注射待用杂交瘤移植的BALB/c小鼠，并且腹膜内移植5X IO6杂交瘤细胞。3周以后，在移植小鼠中腹膜内杂交瘤肿瘤形成并且腹部扩大。因此，在腹水和血清中产生高浓度单克隆抗体，并且收集这些流体。---------〈胶乳颗粒的制备〉简言之，将IlOOg蒸馏水、200g苯乙烯、0. 2g苯乙烯磺酸钠和50g蒸馏水中溶解 1. 5g过硫酸钾的水溶液在装有搅拌器、回流冷凝器、温度检测器、氮气入口和夹套的2-L玻璃反应容器中混合。用氮气替换容器的气氛，并且在搅拌的条件下将混合物在70°C聚合48 小时。聚合以后，将上述溶液经过滤纸过滤并回收胶乳颗粒。通过至少100个颗粒的图像分析来测量获得的胶乳颗粒的直径。使用透射电子显微镜(JEM-1010，JE0L)以10，000X 放大率获取用于胶乳颗粒图像分析的照片。平均直径是0. 2 μ m。
实施例[实施例1](含有抗KL-6抗体固定化的胶乳颗粒的溶液(含有其上固定抗KL-6抗体的胶乳颗粒的溶液；在下文中称为试剂2、的制备)将调至0. 7mg/mL的抗KL-6抗体溶液(5mM Tris-HCl，pH 8. 0)加至等量的含有 1. 0%具有0. 2 μ m平均粒径的胶乳颗粒的溶液(5mM Tris_HCl，pH8. 0)。在4°C搅拌2小时以后，添加等量的2. 0% BSA溶液(5mM Tris-HCl,pH 8. 0)，并且将混合物在4°C搅拌1小时。 离心以后，弃去上清液，并且将沉淀在5mM Tris-HCl，pH 8. 0中再悬浮。用5mM Tris-HCl, PH 8. 0将该混合物稀释，以致在600nm波长的吸光度是4. 5Abs。该溶液用作试剂2。
含有类风湿因子干扰抑制剂的溶液(在下文中，试剂1)的制备。具体而言，制备含有IOOOmM 氯化钠、1.0% BSA 和 50 μ g/mL HBR(Scantibodies Lab,3KC533)的30mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)并且将其用作试剂1。(样品)通过N-assay Nittobo TIA RF (日东纺医学株式会社(Nittobo Medical Co., Ltd.))测量来自具有风湿病的患者的样品中类风湿因子的浓度并且使用Picolumi (注册商标)KL-6(三光纯药株式会社(Sanko Junyaku Co.，Ltd.))测量KL-6的浓度；根据各产品文件和制造商的指导书测量每一个。将测量的KL-6值表示为100%并且与根据本发明的免疫测定法的测量值相比。(KL-6浓度的测定)将试剂1和试剂2混合，并且使用日立(Hitachi) 7170自动分析仪测量含有类风湿因子的样品中KL-6的浓度。具体而言，将150 μ L试剂1加至2. 5 μ L样品并且在37°C温育5分钟以后，添加50 μ L试剂2，并且将混合物搅拌。在570nm的主波长和SOOnm的次波长，经过接下来的5分钟来测量与凝集有关的吸光度变化。通过将吸光度变化应用于校准曲线来计算KL-6的浓度，所述校准曲线是通过测量已知浓度标准物质获得的。(混合物的pH测定)以和上述KL-6测定中相同比例将样品、试剂1和试剂2混合以后，使用Castany LAB F-21pH 计(Horiba Ltd.)测量 pH。[实施例2至4]代替实施例1的试剂1中30mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4. 0)，使用pH 4.5(实施例 2)、pH 5. 0 (实施例3)和pH 5. 5 (实施例4)的30mM柠檬酸盐缓冲液。使用和实施例1相同试剂和相同测定进行测量。(比较例1至6)使用和实施例1相同试剂和相同测定进行测量，不同之处在于，使用pH 3. 5的 30mM甘氨酸缓冲液(比较例1)和pH 6.0(比较例2) ,6.5(比较例3) ,7.0(比较例4)、 7. 5 (比较例5)和8. 0 (比较例6)的30mM磷酸盐缓冲液，代替实施例1的试剂1中30mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4. 0)。结果和讨论对于含有高浓度类风湿因子的样品(升高的类风湿因子样品)研究当试剂1的PH 改变时非特异性反应抑制的有效性。将对于升高的类风湿因子样品A和B以及正常样品C 的pH 3. 5至8. 0的试剂1的测量结果(实施例1至4，比较例1至6)显示在表1中。
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权利要求
1.KL-6免疫测定试剂，所述免疫测定试剂包含含有类风湿因子干扰抑制剂的pH 4. 0 至PH 5. 5的溶液和含有其上固定抗KL-6抗体的不溶载体的溶液。
2.权利要求1的免疫测定试剂，其中所述不溶载体是胶乳颗粒。
3.KL-6免疫测定法，所述免疫测定法包括使用样品、类风湿因子干扰抑制剂、和其上固定抗KL-6抗体的不溶载体，测量伴随着不溶载体凝集的吸光度变化，所述不溶载体凝集由在pH 4. 0至pH 5. 5的溶液中所述样品中KL-6和所述不溶载体上固定的抗KL-6抗体之间的免疫反应所致。
4.KL-6免疫测定法，所述免疫测定法包括向样品加入含有类风湿因子干扰抑制剂的 pH 4. 0至pH 5. 5的溶液和其上固定抗KL-6抗体的不溶载体的溶液，和测量伴随着不溶载体凝集的吸光度变化，所述不溶载体凝集由所述样品中KL-6和固定在所述不溶载体上的抗KL-6抗体之间的免疫反应所致。
5.权利要求3或4的免疫测定法，其中所述不溶载体是胶乳颗粒。
全文摘要
本发明目的在于提供用于准确测量KL-6的测定试剂和测定法，特别是，用于准确测量含类风湿因子和/或除类风湿因子以外的非特异性物质的样品中的KL-6的测定试剂和测定法。可以使用免疫测定试剂来准确测量含有类风湿因子和/或除类风湿因子以外的非特异性物质的样品中的KL-6，所述免疫测定试剂包含含有类风湿因子干扰抑制剂的pH值为4.0至5.5的溶液，和其上固定抗KL-6抗体的不溶载体的溶液。
文档编号G01N33/53GK102422159SQ20108002040
公开日2012年4月18日 申请日期2010年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者山本光章, 近藤纯一, 金子智惠 申请人:爱代尔株式会社, 积水医疗株式会社
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