专利名称：半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒的制作方法
半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒
技术领域：
本发明涉及医学/食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及半乳糖诊断/测定方法及其试剂盒。
背景技术：
牛奶在营养界素有“液体黄金”的美称，我国早在1992年由七部位联合提出“一杯牛奶强壮一个民族”的口号。奶类除不含纤维素外，几乎含有人体所需要的各种营养素。 牛奶中的乳糖进入人体后，经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿大脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。牛奶虽好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人体不能很好的消化吸收牛奶中的营养素，还会造成钙、磷、钾、铁等元素的吸收障碍，影响婴幼儿的体格和智力发育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨质疏松的重要原因。中国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达86. 7%，不耐受指数为0. 9。为了避免不适当饮奶对健康造成的损害，因此最好在饮奶前检查自己是否耐受乳糖，在饮用牛奶后，测试尿液中半乳糖的浓度，这是目前国外最常用的一种方法，更为简便、 经济、可靠。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种半乳糖的测定方法。本发明的另一个目的是提供一种半乳糖诊断/测定试剂盒。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶 (偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm波长处的吸光度变化测定半乳糖的方法。本发明半乳糖测定方法的的技术原理是根据下述半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、苹果酸脱氢酶的系列催化反应完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+苹果酰辅酶A乙酰辅酶A羧化酶乙酰辅酶A+腺苷三磷酸+ 二氧化碳二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)苹果酸+辅酶本发明的方法利用半乳糖激酶(galactokinase ；EC 2. 7. 1. 6)酶(偶)联乙酰辅酶 A 羧化酶(acetyl-CoA carboxylase ；EC 6. 4. 1. 2)、苹果酸脱氢酶(malatedehydro genase (oxaloacetate-decarboxylating) ；EC 1. 1. 1. 38 ；EC 1. 1. 1. 39 ；ECl. 1. 1. 40 ；EC1. 1. 1. 83)酶促反应终点法。半乳糖激酶酶解半乳糖反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合乙酰辅酶A羧化酶、苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算半乳糖的浓度大小。本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种半乳糖的测定方法。该半乳糖测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中，再将半乳糖浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试；将一定量的待测固体样品(如乳粉)像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其半乳糖浓度为0微摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、 苹果酸脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐(磷酸根)、苹果酰辅酶A与丙酮酸，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-lOOmmol/L、 l-100mmol/L,l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到
半乳糖的含量
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、苹果酸脱氢酶的系列催化反应完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+苹果酰辅酶A乙酰辅酶A羧化酶乙酰辅酶A+腺苷三磷酸+ 二氧化碳二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)苹果酸+辅酶。
2.一种半乳糖的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1. 1标准样品的制备将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到100微摩尔/升； 2. 1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试；将一定量的待测固体样品(如乳粉)像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其半乳糖浓度为0微摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、苹果酸脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐(磷酸根)、苹果酰辅酶A与丙酮酸，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、 l-100mmol/L,l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化； 2. 6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到半乳糖的含量
3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为终点法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测半乳糖样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。
4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio_NADH的还原型辅酶。
5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于5. 1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、苹果酰辅酶A、丙酮酸、半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的；5. 2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、苹果酰辅酶A与丙酮酸组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的；其中还原型辅酶、半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、苹果酸脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、苹果酰辅酶A、丙酮酸在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、苹果酰辅酶A与丙酮酸组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、乙酰辅酶A羧化酶与苹果酸脱氢酶组成的；试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与半乳糖激酶组成的；其中还原型辅酶、半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、苹果酸脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、苹果酰辅酶A、丙酮酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。
6.一种半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于6. 1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/L缓冲液稳定剂还原型辅酶半乳糖激酶乙酰辅酶A羧化酶苹果酸脱氢酶腺苷三磷酸单价磷酸盐1-lOOmmol/L苹果酰辅酶A1-lOOmmol/L丙酮酸1-lOOmmol/L。·6. 2根据权利要求6. 1所述的半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L还原型辅酶0. 1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸1-lOOmmol/L单价磷酸盐1-lOOmmol/L苹果酰辅酶A1-lOOmmol/L丙酮酸1-lOOmmol/L ；组成如下的试剂2 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L乙酰辅酶A羧化酶 1000-80000U/L苹果酸脱氧酶1000-80000U/L。·6. 3根据权利要求6. 1所述的半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L还原型辅酶0. 1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸1-lOOmmol/L单价磷酸盐1-lOOmmol/L苹果酰辅酶A1-lOOmmol/L丙酮酸1-lOOmmol/L ；组成如下的试剂2 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L乙酰辅酶A羧化酶 1000-80000U/L苹果酸脱氧酶1000-80000U/L ；组成如下的试剂3 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L。
全文摘要
本发明涉及利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据半乳糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、苹果酸脱氢酶的系列催化反应完成，本发明还涉及一种半乳糖诊断/测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差�。虼吮痉⒚鞯牟舛ǚ椒ㄓ胧约梁锌梢怨惴旱赜τ糜诹俅惨窖�/食品检验。
文档编号G01N33/66GK102297976SQ201010209698
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
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