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专利名称：用于评价早产风险的生物标志物的鉴定和定量的制作方法
用于评价早产风险的生物标志物的鉴定和定量相关申请的交叉引用该申请要求于2009年8月20日提交的美国临时申请序列号61/253，503的优先权。该申请通过引用以其整体就其全部教导结合到本文中。致谢导致本发明的研究部分地由国立卫生研究所资助(经费号为R21HD047319和U01HD050080)。在本发明中美国政府拥有一定权利。序列表的交叉引用用序列标识符号码(SEQ ID NO)来引用本文描述的肽。SEQ ID NO在数字上对应于序列标识符〈400>1、〈400>2等。用书写的计算机可读格式(CFR)表示的序列表通过引用 以其整体结合到本文中。背景早产影响全部孕妇的多于10%。其也是与新生儿相关的疾病和死亡的主要原因之一。与足月出生的婴儿相比较，过早出生的婴儿遭受40倍増加的新生儿死亡，并且对于主要医学并发症例如大脑性麻痹、慢性呼吸性疾病、失明和耳聋可处于显著増加的风险中。另夕卜，长期神经和发育问题已在多达70%出生体重小于I. 5磅的儿童中得到确定。据估计，仅在美国，这些并发症每年与数十亿美元的直接费用和未实现的潜能有夫。尽管该问题的重要性，但关于体内发生的什么导致早产和分娩，一直存在不确定性。虽然有效处理这些问题的能力由于存在关于早产(PTB)原因的不确定性而仍是有限的，但如果给予足够的预警，医学专业人员可采取医疗措施。如果ー个人可预测哪些孕妇有可能经历早产，则可给予可延迟或甚至预防早产的药物。另外，激素衍生物已知可提高胎儿肺成熟度，并且如果尽早检测到早产风险，如果经母亲给予胎儿所述衍生物，则因此可減少与早产有关的主要并发症之一。然而，目前似乎没有办法知道哪些孕妇处于出现该妊娠并发症的风险中。因此，ー个重要且未满足的需要是制定用于早期检测处于早产风险中的母亲的试验程序。概述本文描述了用于评价怀孕受试者早产风险的方法。这些方法包括检测和定量来自受试者的生物样品中与早产相关的第一生物标志物和第二生物标志物。亦详述了可用于预测早产的生物标志物。本发明的优点将在随后的描述中部分地阐述，并且根据描述部分地将为清楚明了的，或者可通过实施下述方面而领会。下述优点将通过在所附权利要求中所特别指出的元素和组合来实现和达到。应理解的是，以上一般性描述和以下详细描述两者均仅为示例性和说明性的且不为限制性的。附图简述结合到该说明书并构成该说明书的部分的


了下述几个方面。图I显示对于第一生物标志物筛查的接受者操作曲线(receiver operatorcurve (ROC))。图2显示对于第一生物标志物和第二生物标志物筛查的生物样品接受者操作曲线(ROC)。详述在公开并描述本发明化合物、组合物和/或方法之前，应理解的是，下述方面不限于特定化合物、合成方法或用途，因为这些当然可变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述具体方面的目的而并非g在限制。在该说明书和随后的权利要求书中，将提及许多术语，其将被限定具有以下含乂 必须指出的是，如说明书和所附权利要求中所用的，単数形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述”包括复数指示対象，除非上下文另外明确指明。因此，例如提及“生物标志物”包括两种或更多种这样生物标志物的混合物等。“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可发生或可不发生，并且所述描述包括其中事件或情形发生的情况和其中其不发生的情況。本文使用的“受试者”指处于早产风险并受益于本文所述方法的孕妇。本文使用的“早产(preterm birth) ”包括在完全妊娠期之前婴儿的分娩。例如，认为少于37周妊娠期婴儿的分娩为早产。术语早产是提早分娩(preterm delivery)和提前分娩(premature delivery)的同义词。本文使用的术语“生物标志物”可用于指以不同浓度存在于孕妇体内并用于预测早产风险的天然存在的生物分子。例如，生物标志物可为相对于未经历早产的受试者中相同生物标志物的量，以更高或更低量存在于处于早产风险的受试者中的肽。生物标志物可包括除肽以外的其它分子包括小分子，例如但不限于生物胺和类固醇。本文使用的术语“肽”可用于指包含通过ー个氨基酸的羧基与另ー个氨基酸的α氨基连接的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。肽不受长度限制，并且因此“肽”可包括多妝和蛋白质。本文使用的术语“分离的”，就肽而言，如果物质是天然存在的，则指的是已从其原始环境移出的物质。例如，存在于活动物中的天然存在的肽是未分离的，但是从自然系统中的ー些或所有共存物质中分离的相同肽是分离的。这样分离的肽可为组合物的部分并且仍可被分离，因为所述组合物不是其自然环境的部分。“分离的”肽还包括合成的或经重组DNA技术制备的物质。本文使用的术语“特异性免疫反应的”指的是可测量和可重现的特异性免疫反应例如肽与抗体之间的结合，所述抗体决定生物样品中或肽和其它生物制品的异源种群中肽的存在情況。术语“特异性免疫反应的”可包括结构形状和表面特征的特异性识别。因此，在指定条件下，与特定肽特异性免疫反应的抗体不以显著量结合存在于样品中的其它肽。多种免疫測定方式可用于测定与特定肽特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定被常规用于选择与肽特异性免疫反应的单克隆抗体。參见例如Harlow和Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(其通过引用结合到本文中)中的可用于测定特定免疫反应性的免疫測定方式和条件。本文使用的术语“抗体”指的是与给定抗原特异性免疫反应的免疫球蛋白。术语“抗体”意欲包括任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗体及其片段。本文使用的“抗体”还包括抗体制剂。使用本领域已知的各种技术，抗体可用可检测标记来标记。标记可为放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、酶或酶辅因子或本领域已知的任何其它标记。在ー些方面，与目的肽结合的抗体可不被标记，但反而可通过与第一抗体特异性结合的经标记第二抗体的结合来检测。本文使用的术语“检测”是指ー种或多种生物标志物例如肽及其它生物分子的不可检测的、低的、正常的、或高血清浓度的定量测量。本文使用的术语“定量化”和“定量”可互換使用并且指测定样品中物质(例如生物标志物)的量或丰度(无论是相对还是绝对的)的方法。本文使用的术语“约”用于提供数值范围端点的灵活性，条件是给定的值可为所述端点的“高一点”或“低一点”而不影响所需結果。 为了方便起见，本文使用的多个条目、结构元素、组成元素和/或物质可呈现在共同列表中。然而，这些列表应解释为好像列表的各成员各自确定为单独且独特的成员。因此，仅基于其在共同组中的呈现而没有相反指明，所述列表中的单个成员不应解释为相同 列表中任何其它成员的实际等价物。本文中浓度、量及其它数值数据可用范围格式来表达或呈现。应理解所述范围格式仅为了方便和简洁起见而使用并因此应灵活地解释为不仅包括作为范围界限明确列举的数值，而且还包括所述范围内包括的所有单个数值或子范围，好像每ー数值和子范围被明确列挙。作为例证，“约I-约5”的数值范围应解释为不仅包括明确列举的约I-约5的值,而且还包括所指明范围内的单个值和子范围。因此，包括在该数值范围内的为单个值例如2、3和4及子范围例如1-3、2-4和3-5等，以及单独地1、2、3、4和5。该同样的原理适用于仅将一个数值列举为最小或最大值的范围。另外，不论所描述范围或特性的宽度，所述解释应适用。本文描述了用于鉴定处于早产风险中的怀孕受试者的方法。已鉴定了第一生物标志物和第二生物标志物，其可用于鉴定可处于早产风险中的在妊娠早期-中期期间的怀孕受试者。所述标志物可使得能够诊断区分早产与显示类似症状的其它病况。尽早鉴定处于更大早产风险中的受试者将具有相当大的价值，这样可更密切地监测受试者。当表明早产的第一生物标志物和第二生物标志物在受试者中可量化时，使用本文所述方法测试怀孕受试者可在怀孕期间的任何时间进行。例如，一方面，第一生物标志物和第二生物标志物可在约20周-约34周妊娠时测试。另ー方面，第一生物标志物和第二生物标志物可在约24周-约32周妊娠时测试。应指出的是，这些范围不应视为限制，因为所述测试可在怀孕期间的任何时刻进行。相反地，提供这些范围是为了表明其中所述测试最有可能在大多数受试者中进行的妊娠周期的时期。在鉴定处于早产风险的受试者中有用的生物标志物包括各种肽和其它生物分子。用本文所述与早产发生率相关的技术和方法，已鉴定了某些肽和其它生物分子。这些肽和其它生物分子中一种或更多种的定量提供受试者早产风险的一些指征(indication)，并因此可提供预防性治疗的机会。应指出的是，预测早产并发症的任何生物标志物应视为在本发明权利要求书的范围内。然而，一方面，与早产并发症相关的第一生物标志物或第二生物标志物的非限定性实例可包括经发现与对照受试者(即未经历早产并发症的孕妇)存在统计差异(p彡0. 01)和p (概率)值< 0. 02作为截断的分子和肽。一方面，生物标志物包括第一生物标志物和第二生物标志物。在该方面，第一生物标志物可包括与早产有关的肽例如具有以下氨基酸序列或其任何组合的肽QLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO I)、NVHSAGAAGSRMNFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO 2)、NVHSAGAAGSRM NFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO 3)。另ー方面，第ニ生物标志物可包括与早产有关的全长蛋白或蛋白质的肽片段。该第二生物标志物可包括但不限于促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子α I型受体或其任何组合。在又另一方面，第二生物标志物包括促肾上腺皮质激素释放因子、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子α I型受体或其任何组合。这些全长蛋白的序列可在www. ncbi. nlm. nih. gov得到。用于鉴定生物标志物的如在国际公布号WO 2008/079407(其通过引用以其整体结合到本文中用于该申请内的所有目的)中公开的蛋白质组学技术，可用于鉴定和定量用于评价怀孕受试者中早产风险的生物标志物。一方面，用于测试怀孕受试者潜在早产的方法可包括与对照(即在不经历早产的孕妇中生物标志物的相对浓度或量)相比较，检测存 在于生物样品中与早产有关的第一和第二生物标志物组合的浓度或量的差异。一方面，蛋白质组学系统和方法可用于鉴定和定量第一和第二生物标志物。例如，本文可使用比较来自不同生物样品的多个质谱，在使用补偿非生物差异的方法之后对量不同的质量离子进行定位，分离并表征目的生物标志物。这样的方法可包括分馏多个生物样品中的每ー个以形成多个洗脱，在多个洗脱时间得到来自多个洗脱中每ー个的多个质谱，并且找到生物样品之间似乎量上不同的目的分子离子峰。方法可另外包括鉴定对应于在生物样品之间基本上一致的内源性參考分子的质谱參考峰，所述内源性參考分子具有与目的峰基本上类似的洗脱时间和质荷比，并且通过将目的峰标准化为内源性參考分子的质谱峰来补偿每ー个生物样品在多个洗脱之间的非生物变异。方法可进ー步包括实施碰撞诱导的裂解研究，所述研究使用多个碰撞能量中的每ー个，一次运行ー个并将所生成的许多碎片离子质谱求和而不是平均化以形成単一的累积子碎片质谱，并且使用子碎片质谱以建立氨基酸序列数据，其然后用于鉴定对应于単一比对的质谱中目的峰的肽。另ー方面，含有第一和第二生物标志物的生物样品可经分馏以形成多个洗脱，在多个洗脱时间得到来自多个洗脱中每ー个的多个质谱，并且鉴定对应于多个洗脱中每ー个中洗脱的内源性比对分子的质谱比对峰。方法可进ー步包括通过比对来自多个洗脱中每ー个的质谱比对峰而比对来自各洗脱的许多质谱，将许多所比对的质谱求和形成単一比对的质谱，并且鉴定对应于单一比对的质谱中目的峰的肽。尽管考虑各种技术，但一方面比对许多质谱可进ー步包括目视比对许多质谱。另外，分馏存在于多个生物样品中的多种生物分子中的每ー种可通过许多方法来实现，例如通过毛细管液相色谱(cLC)。用于检测和定量本文所述第一和第二生物标志物的具体方法和參数在实施例中提供。用于检测和定量本文所描述第一和第二生物标志物的蛋白质组学技术利用对于用作内部対照的所有血清为天然的分子，其可用于校正样品加载、电离效率和质谱仪灵敏度的差异。进ー步关于以上讨论，如果在比较组之间峰可显示量上相似，其被选为參考，在与候选生物标志物相同的洗脱窗口中来自柱的洗脱物在其质荷比方面与候选生物标志物相似，并且足够丰富，使得每ー个样品将具有多于3倍噪声水平的量。这里所描述的參考峰为与试样处理、色谱加载、电离效率或仪器灵敏度波动相关但不是由于峰数量的生物差异的峰高或面积的定量校正。该參考称为内部定量对照。在其它方面，外部对照可用于促进生物标志物的定量。在该方面，可将已知量的化合物加入到生物样品中以便可计算生物标志物与対照的比率。所述比率然后可与来自对照样品的比率相比较以评价早产的风险。如以上所描述的，包括SEQ ID NOs 1_3或其任何组合的第一生物标志物已被鉴定为早产的预测物(predictor)。内部定量对照用于定量SEQ ID NOs 1_3。用于SEQ IDNO I (m/z 677)的參考(即内部对照)对于其单同位素峰的+3荷电状态具有673. 36的m/Z0中性母体质量(neutral parent mass)为2017. 07质量单位,并且色谱洗脱时间为15. 5分钟。然而，假定洗脱时间将在不同日或伴随更换柱稍微变化，将洗脱时间提供为其洗脱时间相对于内部时间对照的分数(0. 9968，即其洗脱比内部时间对照早其自身保留时间的
0.0032倍)和作为其洗脱时间与SEQ ID NO I (m/z 677)比较的分数(I. 0558，即其洗脱比生物标志物早其自身洗脱时间的0. 05286)。第二内部定量对照用作SEQ ID NO 2 (m/z 857)和 SEQ ID NO 3 (m/z 860)的參考。參考分子的m/z在其+5荷电状态为842. 39，中性母体质量为4206. 07质量单位。色谱洗脱 时间为约15. 8分钟。然而，考虑到洗脱时间可变性，其洗脱时间更适当地相对于内部时间对照和SEQ ID NO 2 (m/z 857)的洗脱时间来描述。关于内部时间对照，内部定量对照在内部时间对照的洗脱之后洗脱为其自身洗脱时间0. 0159倍洗脱时间的因子(或时间对照标志物的1.0161的比率)。关于SEQ ID NO 2 (m/z 857)，内部定量标志物在生物标志物之后实现其自身洗脱时间0. 0539倍的因子(或生物标志物洗脱时间的I. 0700的因子)。尽管各质量可由洗脱时间(保留时间)确定，洗脱时间(保留时间)也可表示为内部时间对照的函数。这通过生物标志物之前的时间标记与目的峰之后的时间标记之间的目的峰的相对位置来測定。认为该测定为Rf值。Rf值计算如下Rf =(生物标志物的洗脱时间-时间标记之前的洗脱时间)/ (时间标记之后的洗脱时间-时间标记之前的洗脱时间)。使用上述技术，包括SEQ ID NOs 1_3或其任何组合的第一生物标志物已被鉴定为早产的指示物(indicator)。关于第一生物标志物(即SEQ ID NOs 1-3或其任何组合)的鉴定和定量的具体细节在实施例中提供。对于SEQ ID NOs 1-3的另外结构性质在下文提供。SEQ ID NO 1，其为肽，在677具有质量离子峰(m/z)，平均质量为2026. 98道尔顿，平均洗脱时间为14. 30±0. 47分钟，和Rf值为0. 535±0. 052。SEQ ID NO 2，其为肽，在857具有质量离子峰(m/z)，平均质量为4279. 25道尔顿，平均洗脱时间为17. 20±2. 04分钟，和Rf值为0. 781 ±0. 086。SEQ ID NO 3，其为肽，在860具有质量离子峰(m/z)，平均质量为4295. 25道尔顿，平均洗脱时间为16. 13±1. 97分钟，和Rf值为0. 695±0. 134。使用以上和在实施例中描述的技术，第二生物标志物，其包括促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子a I型受体或其任何组合，当与第一生物标志物(即SEQ ID NOs 1-3或其任何组合)结合时已被鉴定为早产的指示物。因此，提供了用于评价怀孕受试者潜在早产的方法。一方面，方法包括检测来自受试者的生物样品中与早产有关的本文所描述第一和第二生物标志物，其中所述第一生物标志物具有与序列(由SEQID NO I、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3表示的序列)相同或同源的氨基酸序列，和所述第二生物标志物包括促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子α I型受体或其任何组合。接着，对生物样品中第一和第二生物标志物的丰度进行定量。在处理和分离之后第一和第二生物标志物的丰度作为也存在于生物样品中用作内部对照组的參考分子的函数得以测量。本文使用的术语“丰度”代表在给定质谱中经质谱仪测量的特定质量离子的数目或在代表完全洗脱区间的几个质谱中观察到的特定质量离子数目的总和。生物标志物丰度对该内部对照的标准化減少非生物变异并提高在风险预测中利用生物标志物的能力。换句话说，通过选择在受试者之间以相对恒定的丰度存在于生物样品中用于參考的分子，在生物样品处理中的差异可经校正，特别是当比较在不同日实施且可经长的时间期间展开的运行吋。这样，依所涉及的特定生物标志物而定，生物标志物的相对丰度可变化。因此可对于每ー个生物标志物/參考比率建立特定截断值使得高于或低于一定值的生物标志物峰值丰度与參考峰值丰度的比率可为早产风险显著増加的预测。对于潜在早产的测试也可通过比较来自受试者具有表明正常分娩的已知丰度的那些相同生物标志物的生物样品中第一和第二生物标志物的丰度来实现。一方面，如果第 一生物标志物为单独的SEQ ID NO I或与SEQ ID NOs 2和3的任何组合的SEQ ID NO 1，如果受试者具有所测量的SEQ ID NO I丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约50%，那么可发生早产。另ー方面，如果受试者具有所测量的单独SEQ ID NO I或与SEQ ID NOs2和3组合的SEQ ID NO I的丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约30%，那么可发生早产。在又另一方面，如果受试者具有所测量的单独SEQ ID NO I或与SEQ ID NOs 2和3组合的SEQ ID NO I的丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约10%，那么可发生早产。另ー方面，如果第一生物标志物为SEQ ID NO 2，如果受试者具有所测量的SEQ IDNO 2丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约50%，那么可发生早产。另ー方面，如果受试者具有所测量的SEQ ID NO 2丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约30%，那么可发生早产。在又另一方面，如果受试者具有所测量的SEQ ID NO 2丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约10%，那么可发生早产。另ー方面，如果第一生物标志物为SEQ ID NO 3，如果受试者具有所测量的SEQ IDNO 3丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约55%，那么可发生早产。另ー方面，如果受试者具有所测量的SEQ ID NO 3丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约35%，那么可暗示早产。在又另一方面，如果受试者具有所测量的SEQ ID NO 3丰度为小于至少22周妊娠的对照丰度的约15%，那么可发生早产。可含有第一生物标志物和第二生物标志物的任何类型生物样品可经筛查，包括这样的非限制性实例例如血清、血浆、血液、尿、脑脊液、羊水、滑液、宫颈阴道分泌物、灌洗液、组织及其组合。尽管第一生物标志物(即SEQ ID NOs 1-3或其任何组合)和第二生物标志物存在于大多数孕妇体内，但持续经历早产的许多孕妇在妊娠期间与具有正常分娩的妇女相比较具有较低血清浓度的第一生物标志物。然而，依所筛查的具体蛋白质或肽而定，与具有正常分娩的妇女相比较，持续经历早产的妇女的第二生物标志物(即促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子α I型受体或其任何组合)更低或更高。关于第二生物标志物血清浓度的进ー步细节參见实施例部分的表16。值得注意的是，先前已评价了第二生物标志物对于早产的可预测性。參见GoldenbergRL,Iams JD, Mercer BM, Meis PJ, Moawad A,DasA, Miodovnik M, Vandorsten PJ,CaritisSN, Thurnau G, Dombrowski MP ；Maternal-Fetal Medicine Units Network。早产预测研究关于用于自发性早产的多标志物试验(The Preterm Prediction Study toward amultipIe-marker test for spontaneous preterm birth). Am J Obstet Gynecol 2001 ；185(3) :643-510然而，如由以上所提及參考文献指出的那样，当在不存在第一生物标志物下检测和定量第二生物标志物(即促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子a I型受体或其任何组合)时，其不提供足够的用于临床预测PTB的特异性或灵敏度。一方面，与对照相比，PTB病例中第一生物标志物(即SEQ ID NOs 1_3或其任何组合)较不丰富。因此，比较来自受试者的生物样品中ー种或更多种第一生物标志物的丰度相对于来自未经历早产受试者的已知对照浓度，或者相对于来自所测试受试者的己知生物标志物浓度，可预测早产。具有较高或较低第一生物标志物丰度的那些受试者可具有增加的早产风险，并可因此足够早地被鉴定以使得能够适当治疗。在预测早产中特定生物标志物的丰度在以下详细描述。 —方面，为了计算早产受试者和对照受试者的生物标志物丰度，在28周妊娠时对第一生物标志物取对数比。例如，log 676. 7/673. 36 (SEQ ID NO I/參考峰)的对数比得到平均对照为 0.579±0. 101 和平均 PTB 为-0. 015±0. 090。log 856. 8/842. 8 (SEQ ID NO 2/參考峰)的对数比得到平均对照(未经历早产的受试者)为0. 231±0. 102和平均PTB(处于早产风险中的受试者)为-0. 149±0.095(实施例中表12)。參照实施例中表12，计算其它生物标志物的对数比。log 860. 0/842. 8 (SEQ ID NO 3/參考峰)的对数比得到平均对照为0. 201 ±0. 096和平均PTB为-0. 204±0. 088。换句话说，处于早产风险中的受试者将最可能单独或共同地呈现SEQ ID NO I减小、SEQ ID NO 2减小和SEQ ID NO 3减小。考虑到所述描述，一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO I (m/z 677)的丰度与參考分子在m/z 673的丰度的比率被测量为小于约I. 0，那么其可为早产风险显著増加的预测。另ー方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO I (m/z 677)的丰度与參考分子在m/z 673的丰度的比率被测量为小于约0.8，那么其可为早产风险显著増加的预测。在又另ー方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO I (m/z 677)的丰度与參考分子在m/z 673的丰度的比率被测量为小于约0. 6，那么其可为早产风险显著増加的预测。另外，一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 2 (m/z 857)的丰度与參考分子在m/z 843的丰度的比率被测量为小于约0.6，那么其可为早产风险显著増加的预测。另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 2 (m/z 857)的丰度与參考分子在m/z 843的丰度的比率被测量为小于约0. 5，那么其可为早产风险显著増加的预测。在又另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 2 (m/z 857)的丰度与參考分子在m/z 843的丰度的比率被测量为小于约0. 44，那么其可为早产风险显著増加的预测。另外，一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 3 (m/z 860)的丰度与參考分子在m/z 843的丰度的比率被测量为小于约0.6，那么其可为早产风险显著増加的预测。另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 3 (m/z 860)的丰度与參考分子在m/z 843的丰度的比率被测量为小于约0. 4，那么其可为早产风险显著増加的预测。在又另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 3 (m/z 860)的丰度与參考分子在m/z 843的丰度的比率被测量为小于约O. 2，那么其可为早产风险显著増加的预测。在某些方面，以上所计算的对数比可用于统计学预测处于经历早产风险中的孕妇的风险。第一生物标志物和第二生物标志物预测能力的ー种公用量度为其灵敏度和特异性。本文使用的“灵敏度”为作为真阳性率定义的统计术语(例如经生物标志物正确鉴定，后来经历早产的孕妇百分数)。本文使用的术语“特异性”定义为真阴性率(例如正确鉴定无并发症妊娠的孕妇百分数)。为了使用本文描述的第一生物标志物和第二生物标志物用于预测早产，建立数字阈值。为了建立数字阈值，对于特定生物标志物的数值范围考虑从最低至最高并且在每ー个点受试者百分数正确鉴定为阳性和在相同点对照百分数错误鉴定为阳性。对于特定生物标志物的值范围可通过从具体数据集的最低至最高取实际数量值来计算。这称为接受者操作曲线(ROC)。一方面，假阳性率可限于20%，其通常认为是临床试验所能容许的最大值。假阳性率(即由生物标志物鉴定处于经历早产风险中的无并发症妊娠的妇女百分数)根据100%减去真阴性率来计算。在20%或更小假阳性率的阈值，其相当于特异性为80%或者更高，确定用于确定某人处于风险中还是不处于风险中的阈值。
參照实施例中的表13和14，对于4个对数比(即第一生物标志物)中每ー个的阈值经測定用于鉴定处于早产风险中的受试者。计算每一个的阈值使得存在80%或者更多的特异性(真阴性率)，其与不多于20%的假阳性率相同。使用数学上測定的阈值，4个比率独立地提供灵敏度(真阳性)和特异性(真阴性)比率(表13和14)。參照表14，SEQ IDNO I ( BP log 677/673)的比率对于预测早产提供最大的灵敏度(65% )和特异性(85% )0因此，一方面，鉴定和定量存在于孕妇中的SEQ ID NO 1(即log 677/673)为经历早产可能性的准确预测物。尽管SEQ ID NO 1(即log 677/673)的比率为有用的，也预期对数比的组合可用于预测早产风险。因此，本文鉴定的第一生物标志物(即SEQ ID NOs 1-3)为预测早产风险的强有力工具。本文所描述的第一生物标志物可预测早产。然而，在ー些情况下对于早产的测试预测值可通过筛查和定量第二生物标志物而改迸。一方面，可筛查来自受试者的生物样品中的第一生物标志物和第二生物标志物,其中所述第一生物标志物为与由SEQ ID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3表示的序列相同或同源的氨基酸序列或其任何组合，和所述第ニ生物标志物为促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子α I型受体或其任何组合。在该方面，当単独筛查第二生物标志物时，其不为PTB的指征。然而，当以与第一生物标志物的组合(即SEQ ID NOs 1_3或其任何组合)来筛查第二生物标志物时，与单独筛查第一生物标志物相比较，预测PTB的灵敏度増加。一方面，当针对PTB而一起筛查第一和第二生物标志物时，灵敏度为大于80%或者为80-90%。在某些方面，灵敏度为90%或者更大。另ー方面，当针对PTB而一起筛查第一和第二生物标志物时，特异性为至少80%。为了比较，当仅检测和定量第一生物标志物时，灵敏度为约65%。一方面，当筛查生物样品中的第二生物标志物时，所述第二生物标志物为至少两种选自以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子α I型受体。另ー方面，当筛查生物样品中的第二生物标志物时，所述第二生物标志物为至少三种选自以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。在另一方面，当筛查生物样品中的第二生物标志物时，所述第二生物标志物为至少四种选自以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。在又另一方面，当筛查生物样品中的第二生物标志物时，所述第二生物标志物为五种蛋白质，其包括促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。表1-6包括但不限于其可经筛查以预测PTB的第一和第二生物标志物的可能组合。在这些表中，第一生物标志物包括SEQ ID NO I (单独或者与SEQ ID NOs 2和3组合)、SEQ ID NO 2 (单独或者与SEQ ID NOs I和3组合)和SEQ ID NO 3 (单独或者与SEQ IDNOs I和2组合)并且第二生物标志物包括蛋白质(即促肾上腺皮质激素释放因子、防卫
素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子a I型受体或其任何组合)的各种组合。例如，在表I中，第一生物标志物为SEQ ID NO I并且第二生物标志物选自包括以下的列表促肾上腺皮质激素释放因子、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子a I型受体或其任何组合。因此，一方面，第一生物标志物可包括SEQ ID NO I并且第二生物标志物可包括促肾上腺皮质激素释放因子。另ー方面，第一生物标志物可包括SEQ ID NO I并且第二生物标志物可包括促肾上腺皮质激素释放因子和凝血酶抗凝血酶复合物。在又另一方面，第一生物标志物可包括SEQ ID NO I并且第二生物标志物可包括促肾上腺皮质激素释放因子、凝血酶抗凝血酶复合物和铁蛋白。在又另一方面，第一生物标志物可包括SEQ ID NOs 1、2和3并且第二生物标志物可包括促肾上腺皮质激素释放因子、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。表1-6每ー个可通过该方法来解释。
权利要求
1.用于评价怀孕受试者中早产风险的方法，所述方法包括 (a)检测存在于来自受试者的生物样品中的第一生物标志物和第二生物标志物的组合，其中所述第一生物标志物包含氨基酸序列SEQ ID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或其任何组合，和所述第二生物标志物为包括以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子a I型受体或其任何组合；和 (b)定量生物样品中所述第一和第二生物标志物的量。
2.权利要求I的方法，其中步骤(b)包括測量所述第一和第二生物标志物的丰度。
3.权利要求2的方法，所述方法还包括比较生物样品中所述第一和第二生物标志物的丰度与来源于未经历早产受试者的对照生物样品中所述第一和第二生物标志物的对照浓度，以确定早产风险増加。
4.权利要求3的方法，其中确定早产风险增加包括确定所述生物样品中至少ー种肽的丰度显著低于对照生物样品中至少ー种肽的对照浓度。
5.权利要求2的方法，所述方法还包括比较生物样品中所述第一和第二生物标志物的丰度与来自受试者的生物样品中參考分子的对照浓度，以确定早产风险増加。
6.权利要求I的方法，其中所述第一生物标志物包括至少两种具有氨基酸序列SEQIDNO I、SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 3 的肽。
7.权利要求I的方法，其中所述第一生物标志物包括至少三种具有氨基酸序列SEQIDNO I、SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 3 的肽。
8.权利要求I的方法，其中所述第二生物标志物为至少两种选自以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。
9.权利要求I的方法，其中所述第二生物标志物为至少三种选自以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。
10.权利要求I的方法，其中所述第二生物标志物为至少四种选自以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。
11.权利要求I的方法，其中所述第二生物标志物为促肾上腺皮质激素释放因子、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物和肿瘤坏死因子a I型受体。
12.权利要求1-11中任ー项的方法，其中所述第一生物标志物为SEQID NO I。
13.权利要求I的方法，其中检测步骤(a)包括蛋白质组学技木。
14.权利要求I的方法，其中检测步骤(a)包括(I)在使得能够形成抗体-抗原复合物的条件下使所述生物样品与抗体接触，所述抗体对所述第一或第二生物标志物具有免疫特异性；和(2)測定所述抗体-抗原复合物的形成以检测生物样品中的所述第一或第二生物标志物。
15.权利要求14的方法，其中所述抗体包括单克隆抗体。
16.权利要求14的方法，其中所述抗体与载体分子偶联或缀合。
17.权利要求14的方法，其中所述抗体与固体载体偶联或缀合。
18.权利要求17的方法，其中在形成所述抗体-抗原复合物之后，去除未结合固体载体上抗体的生物样品的任何组分。
19.权利要求1-18中任ー项的方法，其中所述生物样品包括血清、血浆、血液、尿、脑脊液、羊水、滑液、宫颈阴道分泌物、灌洗液或其任何组合。
20.权利要求1-18中任ー项的方法，其中所述生物样品为血清。
21.权利要求1-18中任ー项的方法，其中所述生物样品为血液。
22.用于评价怀孕受试者中早产风险的方法，所述方法包含(a)自受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品与第一抗体和第二抗体接触，其中在使所述样品与所述第一抗体和第二抗体接触时，所述第一抗体结合第一生物标志物并形成第一抗体-抗原复合物和所述第二抗体结合第二生物标志物并形成第二抗体-抗原复合物；其中所述第一生物标志物包含氨基酸序列SEQ ID NO USEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3或其任何组合并且所述第二生物标志物为包括以下的蛋白质促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子α I型受体或其任何组合；(C)对所述第一抗体-抗原复合物和第二抗体-抗原复合物的形成进行测定以定量生物样品中的其第一生物标志物和第ニ生物标志物的量；和(d)比较生物样品中的所述第一生物标志物和第二生物标志物的量与未经历早产受试者中相同生物标志物的量以评价早产风险。
23.权利要求22的方法，其中所述第一抗体和第二抗体独立地包括单克隆抗体。
24.用于评价怀孕受试者中早产风险的试剂盒，所述试剂盒包括(a)至少第一和第二抗体，其中所述第一抗体能够选择性结合具有包含SEQID NO I、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的氨基酸序列的第一生物标志物并形成第一抗体-抗原复合物，和其中所述第二抗体能够选择性结合包括促肾上腺皮质激素释放因子、防卫素、铁蛋白、乳铁蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、肿瘤坏死因子α I型受体或其任何组合的第二生物标志物并形成第二抗体-抗原复合物；和(b)測定所述第一抗体-抗原复合物和第二抗体-抗原复合物形成的与所述第一抗体和第二抗体功能性相关的指示物。
25.权利要求24的试剂盒，所述试剂盒还包括经配置以定量生物样品中所述第一生物标志物和第二生物标志物量的指示物。
26.权利要求24的试剂盒，其中所述第一抗体和第二抗体独立地包括单克隆抗体。
全文摘要
本文描述用于评价怀孕受试者中早产风险的方法。所述方法包括检测和定量来自受试者的生物样品中与早产有关的第一生物标志物和第二生物标志物。本文亦描述用于预测早产风险的分离的生物标志物和试剂盒。
文档编号G01N33/53GK102822669SQ201080049381
公开日2012年12月12日 申请日期2010年8月19日 优先权日2009年8月20日
发明者S·W·格拉夫, M·S·埃斯普林 申请人:犹他州大学研究基金会, 布里格姆·扬大学, Ihc医疗卫生服务公司