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专利名称：基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法
技术领域：
本发明涉及无机纳米材料制备及光谱应用技术领域，特别是一种基于表面等离子体增强能量转移的生物传感器的构建方法。
背景技术：
生物传感器是指接近分子尺寸、在与被分析物相互作用时能够给出实时信号的一种生物化学分析器件。生物传感器具有体积小、成本低、不需要预处理以及不受外界电磁场影响等优点，近年来被广泛应用于生命科学、材料科学和医学等研究领域，科技进步要求生物传感器的发展趋势为更高的灵敏度和更低的检测限、更好的选择性和更少的物质干扰、更高的准确度和更好的精密度、更完善可信的形态分析、更高的分析速度和自动化程度、更小的样品量实施微损或无损分析、实施原位(in situ)、活体(in vivo)、实时(real time)
和在线(on line)分析、分析器件小型化、微型化和智能化等。基于荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器已被广泛研究，荧光共振能量转移是指当一对合适的物质构成一个能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对时,两者相隔距离在I. 0-10. O纳米内，并且供体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效地重叠，以供体的激发光激发，供体分子由基态跃迁到激发态之后，由于偶极-偶极相互作用，供体分子激发态能量h V就有可能以非辐射的形式有效地被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子而弛豫，即发生荧光共振能量。荧光共振能量转移作为I. 0-10. O纳米距离范围内的光学“分子尺”，具有高分辨率、高灵敏度，简单方便等优点，被越来越广泛地应用于核酸检测、免疫分析以及生物大分子相互作用的研究中。贵金属纳米团簇是指在一定的分子层保护下，由几个到几百个贵金属(金或银)原子组成的相对稳定的聚集体。目前，利用模板法、单分子层保护法或配体蚀刻法，采用硫醇、树枝状聚合物、DNA、蛋白质等保护剂或模板剂可合成水溶性好、发光颜色可调的贵金属纳米团簇。贵金属纳米团簇直径通常小于2纳米，介于单原子和纳米粒子或者大体积的贵金属之间。该尺度接近电子的费米波长，此时，连续的能态性质分裂为离散的能态，并出现类似分子的尺寸依赖效应。当电子从价带(5cT)激发到导带(esp1)时，贵金属纳米团簇可在可见区到近红外区范围内显示出尺寸依赖的荧光性质。与小分子荧光染料和荧光蛋白相t匕，荧光贵金属纳米团簇材料用作荧光探针具有光物理性质好、比表面积大、抗光漂白、生物相容性好、表面易于修饰以及荧光性质可调等优点，在化合物检测、生物传感与成像、光电子学和纳米医学等领域具有巨大应用前景。尽管基于荧光共振能量转移的生物传感器的应用较为成熟，但是由于其特有的能量转移有效距离(I. 0-10.0纳米)使得在设计能量转移体系时需要复杂的表面功能化和供体受体之间化学键和步骤，导致开发新型、高效的生物传感器受到了较大限制。本方法旨在提供一种基于表面等离子体增强能量转移(SPEET)的生物传感器构建方法，这种新颖的能量转移模式是借助贵金属的表面等离子体性质显著增强体系内供体和受体之间的能量转移效率并且扩大了能量转移的有效距离(22纳米)，使得基于表面等离子体增强能量转移设计的生物传感器更加灵活实用。同时引入荧光金纳米团簇和金纳米粒子分别作为供体和受体，使得生物传感器的定量方法更加灵敏和准确。实验合成的蛋白质包覆的金纳米团簇的最大激发波长在520纳米，最大发射波长在690纳米，巯基乙胺修饰的金纳米粒子最大吸收波长在520纳米，金纳米团簇的最大激发波长和金纳米粒子的最大吸收波长发生重叠，并且在缓冲介质中由于表面正负电荷发生静电吸附作用使得两者距离拉近，这两点即作为表面等离子体增强能量转移的必要条件。将蛋白质包覆的金纳米团簇和巯基乙胺修饰的金纳米粒子混合，两者发生表面等离子体增强能量转移使得体系荧光猝灭，当有肝素钠存在时，由于肝素钠较大的负电荷密度使得带正电的巯基乙胺修饰的金纳米粒子发生聚集而使其最大吸收波长红移，同时肝素钠聚合长链的分子构型拉远了巯基乙胺修饰的金纳米粒子和蛋白包覆的金纳米团簇之间的距离，从而打破表面等离子体增强能量转移使得体系荧光恢复。

发明内容
本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，该构建方法同时引入荧光金纳米团簇和金纳米粒子分别作为供体和受体，使得生物传感器的定量方法更加灵敏和准确。 本发明的技术方案一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，步骤如下I)蛋白质包覆的荧光金纳米团簇的制备在反应各器中依次加入氣金Ife溶液和蛋白质溶液，在37° C水浴中避光磁力揽祥下反应10分钟后,逐滴加入浓度为lmol/L的氢氧化钠溶液,调节体系的pH为12. O,然后继续反应36小时，得到蛋白质包覆的荧光金纳米团簇的粗产物，将粗产物用超滤膜在6000转/分钟的转速下超滤离心30分钟，弃掉下清液，将分离后的蛋白质包覆的荧光金纳米团簇重新分散在10倍体积的超纯水中，在4° C下避光保存；2)巯基乙胺修饰的金纳米粒子的制备在反应容器中依次加入高纯水、巯基乙胺溶液和氯金酸溶液，磁力搅拌下室温避光反应20分钟，然后迅速加入新配置的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌避光反应30分钟，即得到酒红色的巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液，在4° C下避光保存；3)基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的实验体系构建在一组离心管中分别加入巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液、超纯水和pH为5. O的磷酸-醋酸-硼酸缓冲溶液作为测试容器，然后在各测试容器中分别加入浓度为O. I -4. O μ g/mL的肝素钠标准溶液和待测溶液,混合均匀后室温反应20分钟,最后向反应体系中加入蛋白质包覆的荧光金纳米团簇溶液，反应20秒后测定体系荧光强度。所述蛋白质为胰蛋白酶、人血清白蛋白、溶菌酶、胰岛素或胃蛋白酶。所述氯金酸溶液的浓度为25. 4mmol/L,蛋白质溶液浓度为30mg/mL,巯基乙胺溶液浓度为213mmol/L，硼氢化钠溶液浓度为lOmmol/L，氯金酸溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1，高纯水、巯基乙胺溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液的体积比为37. 5 :0. 4 :2. 23 O. 01。所述磷酸-醋酸-硼酸缓冲溶液浓度为40mmol/L，磷酸、醋酸和硼酸的重量比为98 60 62o所述巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液、超纯水、磷酸-醋酸-硼酸缓冲溶液与蛋白质包覆的荧光金纳米团簇的体积比为300 :1200 :500 :50。本发明的优点及效果该方法所涉及的纳米材料的合成，步骤简单，不需要苛刻的设备、条件，操作安全简便，毒性小、成本低，所用合成和检测仪器设备均为普通设备，反应条件简单，室温或者37° C水浴反应即可，没有苛刻的条件要求。该方法引入蛋白质包覆的荧光金纳米团簇和巯基乙胺修饰的金纳米粒子分别作为能量转移的供体和受体，利用表面等离子体增强能量转移的理念实现对于目标物肝素钠的快速、准确和高灵敏度高选择性定量。本方法首次将表面等离子体增强能量转移的理念应用于生物传感器的构建，并充分发挥了贵金属纳米材料的合成简单、发光效率高、荧光性质稳定和生物相容性好等优势，建立了一种简便快速和高灵敏度高选择性的定量方法，克服了传统能量转移方法中纳米材 料合成复杂、供体受体选择条件苛刻以及能量转移效率低等缺点，可以拓展能量转移理念作为生物传感器构建中的应用，在生物化学分析和临床诊断等领域具有重大的实践意义。


图I为该生物传感器的荧光光谱图。图2为该生物传感器的线性检测图。
具体实施例方式实施例I :一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，步骤如下I)蛋白质包覆的荧光金纳米团簇的制备在50mL圆底烧瓶中依次加入IOmL浓度为25. 4mmol/L的氯金酸溶液和IOmL浓度为30mg/mL的胰蛋白酶溶液，在37° C水浴中避光磁力搅拌反应10分钟后，逐滴加入ImL浓度为lmol/L的氢氧化钠溶液，调节体系的pH为12. 0，然后继续反应36小时，得到胰蛋白酶包覆的荧光金纳米团簇的粗产物，将粗产物用超滤膜在6000转/分钟的转速下超滤离心30分钟，弃掉下清液，将分离后的胰蛋白酶包覆的荧光金纳米团簇重新分散在超纯水中，在4° C下避光保存；2)巯基乙胺修饰的金纳米粒子的制备在50mL圆底烧瓶中依次加入37. 5mL高纯水、400 μ L浓度为213mmol/L的巯基乙胺溶液和2. 23mL浓度为25. 4mmol/L的氯金酸溶液，磁力搅拌下室温避光反应20分钟，然后迅速加入10 μ L新配置的浓度为lOmmol/L的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌避光反应30分钟，即得到酒红色的巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液，在4° C下避光保存；3)基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的实验体系构建在一组5mL离心管中分别加入300 μ L巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液、1200 μ L超纯水和500 μ L pH为5. O浓度为40mmol/L的磷酸-醋酸-硼酸缓冲溶液作为测试容器，该缓冲溶液中磷酸、醋酸和硼酸的重量比为98 60 :62，然后在各测试容器中分别加入浓度为O. I - 4. O μ g/mL的肝素钠标准溶液和待测溶液,混合均匀后室温反应20分钟,最后向反应体系中加入50 μ L胰蛋白酶包覆的金纳米团簇溶液，反应20秒后测定体系荧光强度。实施例2 一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，步骤和方法与实施例I基本相同，不同之处在于蛋白质为牛血清白蛋白，相应制得牛血清白蛋白包覆的荧光金纳米团簇。实施例3 一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，步骤和方法与实施例I基本相同，不同之处在于蛋白质为溶菌酶，相应制得溶菌酶包覆的荧光金纳米团簇。实施例4
例I基本相同，不同之处在于蛋白质为胰岛素，相应制得胰岛素包覆的荧光金纳米团簇。实施例5一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，步骤和方法与实施例I基本相同，不同之处在于蛋白质为胃蛋白酶，相应制得胃蛋白酶包覆的荧光金纳米团簇。图I为该生物传感器荧光光谱图，图中表明随着肝素钠浓度的增加，体系的荧光强度增加，这是由于肝素钠浓度越高，巯基乙胺修饰的金纳米粒子的最大吸收波长红移程度越大，同时金纳米粒子和金纳米团簇之间的距离越远，因此表面等离子体增强能量转移效率被削弱，使得体系荧光恢复。图2为该生物传感器的线性检测图，图中表明本方法基于表面等离子体增强能量转移建立的生物传感器对于肝素钠的检出限为O. 05μ g/mL，线性检测范围为O. I -4. O μ g/mL作为标准对比曲线。
权利要求
1.一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于步骤如下 1)蛋白质包覆的荧光金纳米团簇的制备 在反应容器中依次加入氯金酸溶液和蛋白质溶液，在37° C水浴中避光磁力搅拌下反应10分钟后,逐滴加入浓度为lmol/L的氢氧化钠溶液,调节体系的pH为12. O,然后继续反应36小时，得到蛋白质包覆的荧光金纳米团簇的粗产物，将粗产物用超滤膜在6000转/分钟的转速下超滤离心30分钟，弃掉下清液，将分离后的蛋白质包覆的荧光金纳米团簇重新分散在10倍体积的超纯水中，在4° C下避光保存； 2)巯基乙胺修饰的金纳米粒子的制备 在反应容器中依次加入高纯水、巯基乙胺溶液和氯金酸溶液，磁力搅拌下室温避光反应20分钟，然后迅速加入新配置的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌避光反应30分钟，即得到酒红色的巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液，在4° C下避光保存； 3)基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的实验体系构建 在一组离心管中分别加入巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液、超纯水和pH为5. O的磷酸-醋酸-硼酸缓冲溶液作为测试容器，然后在各测试容器中分别加入浓度为O. 1-4. O yg/niL的肝素纳标准溶液和待测溶液，混合均勾后室温反应20分钟，最后向反应体系中加入蛋白质包覆的荧光金纳米团簇溶液，反应20秒后测定体系荧光强度。
2.根据权利要求I所述基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于所述蛋白质为胰蛋白酶、人血清白蛋白、溶菌酶、胰岛素或胃蛋白酶。
3.根据权利要求I所述基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于所述氯金酸溶液的浓度为25. 4mmol/L，蛋白质溶液浓度为30mg/mL，巯基乙胺溶液浓度为213mmol/L，硼氢化钠溶液浓度为lOmmol/L，氯金酸溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1，高纯水、巯基乙胺溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液的体积比为37. 5 :0. 4 :2. 23 O. 01。
4.根据权利要求I所述基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于所述磷酸-醋酸-硼酸缓冲溶液浓度为40mmol/L，磷酸、醋酸和硼酸的重量比为98 60 62o
5.根据权利要求I所述基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于所述巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液、超纯水、磷酸-醋酸-硼酸缓冲溶液与蛋白质包覆的荧光金纳米团簇的体积比为300 :1200 :500 :50。
全文摘要
一种基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法，步骤如下1)制备蛋白质包覆的荧光金纳米团簇；2)制备巯基乙胺修饰的金纳米粒子；3)构建基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的实验体系。本发明的优点是该构建方法引入蛋白质包覆的金纳米团簇和巯基乙胺修饰的金纳米粒子分别作为能量转移的供体和受体，利用表面等离子体增强能量转移的理念实现了对于目标物肝素钠的快速、准确和高灵敏度高选择性定量；该方法所涉及的纳米材料的合成，步骤简单，不需要苛刻的设备、条件，操作安全简便，毒性小、成本低，所用合成和检测仪器设备均为普通设备，反应条件简单，室温或者37oC水浴反应即可。
文档编号G01N21/64GK102866139SQ201210353558
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者严秀平, 刘敬民 申请人:南开大学