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专利名称：一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及传感器技术领域，尤其涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器。
背景技术：
随着我国经济的快速稳定增长，人民生活水平不断提高，对食物消费的要求也越 来越高。回归大自然、消费无公害食品，已成为新时期消费的潮流和市场走向。但是环境污 染对农产品的卫生质量造成了很大威胁，食物中毒事件不断见诸报道，已引起人们的广泛关注。为了保障人们的食用安全，很多农产品批发市场、宾馆、饭店等场所都应用检测设 备检测农产品的农药残留情况。目前，我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制 分光光度法(农残快速检测仪)，可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检 测，具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重 超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛，国内已有多种农药 残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水 果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响，导致检测结果的不准确。但是上述方法 存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。

发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，以解决 上述技术问题。本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤酶膜的制作工 艺、玻碳电极的修饰工艺、酶膜的固定工艺，所述玻碳电极的修饰工艺采用功能化多壁碳对 所述玻碳电极进行修饰，包括以下步骤1)多壁碳纳米管的功能化称取IOmg的多壁碳纳米管(MWNTs)，放入IOOmL的烧 杯中，量取40mL浓HNO3和H2SO4混合液(V V = 1 3)加入所述烧杯中混合后，超声4h、 120°C离心回流3h，水洗至中性，红外炉干燥，室温下保存待用；2)清洗所述玻碳电极修饰前，用0. 3 μ m、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面， 抛光后用双蒸水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次2 3min，重复三次，最后依 次用1 1乙醇、1 IHNO3和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；3)测试清洗后，所述玻碳电极要在0.5mol/L&H2S04溶液中用循环伏安法活化， 扫描范围为-0. 6 1. 0V,扫速0. 1V/S，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止；最后在 0. 20mol/L KNO3中记录lX10_3mol/L K3Fe (CN)6溶液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极 的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0. IV 0. 6 ；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在 SOmV以下，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤2)中，处理所述玻碳电极，直到符合 要求；
4)修饰取2yL包含功能化的多壁碳纳米管0. 12(w/v)%、壳聚糖0.48(w/v)%、 戊二醛4. 7 (ν/ν) %的凝胶状混合物悬滴在清洗干净的所述玻碳电极表面，室温下干燥8h， 随后用0. Imol L—1磷酸盐缓冲液(pH 8.0)冲洗，4°C保存备用，完成所述玻碳电极的修饰。本发明采用功能化多壁碳对玻碳电极进行修饰，与传统的采用修饰方法相比，能 在较低的电压下获得较高的氧化峰电流，有效地防止了其他氧化物的干涉，提高本发明农 药残留检测的精度。将采用功能化多壁碳修饰过的玻碳电极，制成乙酰胆碱酯酶生物传感 器后，检测农药的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明生物传感 器制成的相应快速检测仪可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对有机 磷农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安 全生产与消费提供残留检测的技术支撑。所述酶膜的制作工艺包括壳聚糖膜的制作工艺、乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺、 乙酰胆碱酯酶的固定工艺。所述壳聚糖膜的制作工艺包括以下步骤1)将醋酸纤维膜置于0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，3°C下浸泡4 以上， 完成醋酸纤维膜的预处理；2)取0. Ig壳聚糖粉末，加入IOml 1% (m/m)的醋酸水溶液，搅拌IOmin至形成黄 色的溶胶，室温下3000r/min离心5min除去不溶颗粒；3)将所述醋酸纤维膜置于所述溶胶中浸泡12h，取出晾干后再置于0. lmol/L、 pH8. 0的PBS浸泡12h，取出晾干，制得所述壳聚糖膜。所述乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺包括以下步骤1)依次取200 μ L的AChE、20 yL 5% (体积分数)的戊二醛、60 yLl% (质量分 数)的牛血清蛋白(BSA)于ImL塑料离心管中，离心管置于冰浴上；2)添加0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液720 μ L，将上述物质充分混勻，当液体 的上部出现泡沫时，表示已经混勻，制得乙酰胆碱酯酶溶液。所述乙酰胆碱酯酶的固定工艺包括以下步骤1)取预处理好的壳聚糖膜一片浸入乙酰胆碱酯酶溶液中，4°C下保持他；幻他后，取出所述壳聚糖膜，分别用0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液冲洗至少 两次，直到液体中没有泡沫为止；3)将所述壳聚糖膜浸泡在0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，4°C下保存，制 得酶膜，完成固定。所述酶膜的固定工艺采用以下方法将固定有乙酰胆碱酯酶的酶膜通过0型圈固 定在功能化多壁碳修饰过的玻碳电极上，制得乙酰胆碱酯酶生物传感器。有益效果由于采用上述技术方案，本发明制成的乙酰胆碱酯酶生物传感器具有 结构简单、灵敏度高、能重复检测等优点。采用本发明制得的相应检测仪检测农药残留是具 有灵敏度高、操作简单等优点。


图1为本发明的制作流程示意图；图2为本发明功能化多壁碳修饰过的玻碳电极的结构示意5
图3为本发明经酶膜固定后的玻碳电极的结构示意图。
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示进一步阐述本发明。参照图1、图2、图3，一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下 步骤第一步，酶膜的制作工艺，第二步，玻碳电极的修饰工艺，第三步，酶膜的固定工艺。 第二步中，玻碳电极的修饰工艺采用功能化多壁碳对玻碳电极4进行修饰，包括以下步骤 第21步，多壁碳纳米管的功能化称取IOmg的多壁碳纳米管5，放入IOOmL的烧杯中，量 取40mL浓HNO3和H2SO4混合液(V V = 1 3)加入烧杯中混合后，超声4h、120°C离心 回流3h，水洗至中性，红外炉干燥，室温下保存待用。第22步，清洗玻碳电极4修饰前，用 0. 3 μ m、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用双蒸水洗去表面污物，再移入超声 水浴中清洗，每次2 ;3min，重复三次，最后依次用1 1乙醇、1 IHNO3和去离子水超声 清洗，氮气环境下干燥。第23步，测试清洗后，玻碳电极4要在0. 5mol/L的H2SO4溶液中 用循环伏安法活化，扫描范围为-0. 6 1. 0V，扫速0. 1V/S，反复扫描直至达到稳定的循环 伏安图为止；最后在0. 20mol/L KNO3中记录lX10_3mol/L K3Fe (CN)6溶液的循环伏安曲线， 以测试玻碳电极4的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0. IV 0. 6 ；当循环伏安曲线中 的峰电位差在SOmV以下，玻碳电极4可使用，否则要重新返回第22步，直到符合要求。第 24步，修饰取2 μ L包含功能化的多壁碳纳米管50. 12 (w/v) %、壳聚糖0. 48 (w/v) %、戊二 醛4. 7 (ν/ν) %的凝胶状混合物悬滴在清洗干净的玻碳电极4表面，室温下干燥8h，随后用 0. Imol L—1磷酸盐缓冲液(pH 8.0)冲洗，4°C保存备用，完成玻碳电极4的修饰。本发明采用功能化多壁碳对玻碳电极4进行修饰，与传统的采用普鲁士蓝修饰方 法相比，能在较低的电压下获得较高的氧化峰电流，有效地防止了其他氧化物的干涉，提高 本发明农药残留检测的精度。将采用功能化多壁碳修饰过的玻碳电极4，制成乙酰胆碱酯酶 生物传感器后，检测农药的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明 制成的监测仪可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对有机磷农药残留 是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消 费提供残留检测的技术支撑。第一步中，酶膜的制作工艺包括第11步，壳聚糖膜的制作工艺，第12步，乙酰胆碱 酯酶溶液的制作工艺，第13步，乙酰胆碱酯酶的固定工艺。第11步，壳聚糖膜的制作工艺包 括以下步骤第111步，将醋酸纤维膜置于0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，3°C下浸 泡48h以上，完成醋酸纤维膜的预处理。第112步，取0. Ig壳聚糖粉末，加入IOml 1% (m/ m)的醋酸水溶液，搅拌IOmin至形成黄色的溶胶，室温下3000r/min离心5min除去不溶颗 粒。第113步，将醋酸纤维膜置于溶胶中浸泡12h，取出晾干后再置于0. lmol/L、pH8. 0的 PBS浸泡12h，取出晾干，制得壳聚糖膜。第12步，乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺包括以下步骤第121步，依次取200 μ L 的AChE、20yL 5% (体积分数)的戊二醛、60yLl% (质量分数)的牛血清蛋白(BSA)于 ImL塑料离心管中，离心管置于冰浴上。第122步，添加0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶 液720 μ L，将上述物质充分混勻，当液体的上部出现泡沫时，表示已经混勻，制得乙酰胆碱酯酶溶液。第13步，乙酰胆碱酯酶的固定工艺包括以下步骤第131步，取预处理好的壳聚 糖膜一片浸入乙酰胆碱酯酶溶液中，4°C下保持他。第132步，他后，取出壳聚糖膜，分别用 0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液冲洗至少两次，直到液体中没有泡沫为止。第133步，将 壳聚糖膜浸泡在0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，4°C下保存，制得酶膜6，完成固定。第三步中，酶膜的固定工艺采用以下方法将酶膜6通过0型圈7固定在功能化多 壁碳修饰过的玻碳电极4上，制得乙酰胆碱酯酶生物传感器。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
权利要求
1.一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤酶膜的制作工 艺、玻碳电极的修饰工艺、酶膜的固定工艺，其特征在于，所述玻碳电极的修饰工艺采用功 能化多壁碳对所述玻碳电极进行修饰，包括以下步骤1)多壁碳纳米管的功能化称取IOmg的多壁碳纳米管(MWNTs)，放入IOOmL的烧杯中， 量取40mL浓HNO3和H2SO4混合液加入所述烧杯中混合后，超声4h、120°C离心回流池，水洗 至中性，红外炉干燥，室温下保存待用；2)清洗所述玻碳电极修饰前，用0.3 μ m、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，抛光 后用双蒸水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次2 3min，重复三次，最后依次用 1 1乙醇、1 IHNO3和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；3)测试清洗后，所述玻碳电极要在0.5mol/L的H2SO4溶液中用循环伏安法活化，扫 描范围为-0. 6 1. 0V,扫速0. 1V/S，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止；最后在 0. 20mol/L KNO3中记录lX10_3mol/L K3Fe (CN)6溶液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极 的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0. IV 0. 6 ；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在 SOmV以下，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤2)中，处理所述玻碳电极，直到符合 要求；4)修饰取2μ L包含功能化的多壁碳纳米管0. 12&八)％、壳聚糖0. 48(W/v)%、戊二 醛4. 7 (ν/ν) %的凝胶状混合物悬滴在清洗干净的所述玻碳电极表面，室温下干燥8h，随后 用0. Imol Γ\ρΗ 8. 0的磷酸盐缓冲液冲洗，4°C保存备用，完成所述玻碳电极的修饰。
2.根据权利要求1所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在 于，浓HNO3和H2SO4混合液的体积分数之比为V V=I 3。
3.根据权利要求1所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在 于，所述酶膜的制作工艺包括壳聚糖膜的制作工艺、乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺、乙酰胆 碱酯酶的固定工艺。
4.根据权利要求3所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在 于，所述壳聚糖膜的制作工艺包括以下步骤1)将醋酸纤维膜置于0.lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，3°C下浸泡48h以上，完 成醋酸纤维膜的预处理；2)取0.Ig壳聚糖粉末，加入IOml 1% (m/m)的醋酸水溶液，搅拌IOmin至形成黄色的 溶胶，室温下3000r/min离心5min除去不溶颗粒；3)将所述醋酸纤维膜置于所述溶胶中浸泡12h，取出晾干后再置于0.lmol/L、pH8. 0的 PBS浸泡12h，取出晾干，制得所述壳聚糖膜。
5.根据权利要求4所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在 于，所述乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺包括以下步骤1)依次取200μLWAChEdOyL 5% (体积分数)的戊二醛、60 μ Ll % (质量分数) 的牛血清蛋白(BSA)于ImL塑料离心管中，离心管置于冰浴上；2)添加0.lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液720 μ L，将上述物质充分混勻，当液体的上 部出现泡沫时，表示已经混勻，制得乙酰胆碱酯酶溶液。
6.根据权利要求5所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在 于，所述乙酰胆碱酯酶的固定工艺包括以下步骤1)取预处理好的壳聚糖膜一片浸入乙酰胆碱酯酶溶液中，4°C下保持他；2) 后，取出所述壳聚糖膜，分别用0.lmol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗至少两 次，直到液体中没有泡沫为止；3)将所述壳聚糖膜浸泡在0.lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，4°C下保存，制得酶 膜，完成固定。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备 方法，其特征在于，所述酶膜的固定工艺采用以下方法将固定有乙酰胆碱酯酶的酶膜通过 0型圈固定在功能化多壁碳修饰过的玻碳电极上，制得乙酰胆碱酯酶生物传感器。
全文摘要
本发明涉及传感器技术领域，尤其涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器。一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤酶膜的制作工艺、玻碳电极的修饰工艺、酶膜的固定工艺，玻碳电极的修饰工艺采用功能化多壁碳对玻碳电极进行修饰，包括以下步骤多壁碳纳米管的功能化、清洗、测试、修饰。由于采用上述技术方案，本发明制成的乙酰胆碱酯酶生物传感器具有结构简单、灵敏度高、能重复检测等优点。
文档编号G01N27/36GK102103115SQ20111002803
公开日2011年6月22日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者刘君峰, 孙霞, 杜淑媛, 王相友, 赵文苹 申请人:山东理工大学