专利名称：一种止血药物的检测方法
技术领域：
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种止血药物的检测方法，特别是涉及一种用于止血的胶囊剂(致康胶囊)的检测方法。
背景技术：
致康胶囊由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨(煅)、白及、没药(制)、海螵蛸、茜草、龙血竭等十四味中药材组成，具有协同作用，符合中药组方原则，达到标本兼治的目的。 该制剂吸收了古方“七厘散”、“锡类散”、“腐尽生肌散”、“铁扇散”和“刀剪散”等经典古方之精华，具有“止血、促进组织修复、消炎”之功效。在全国各地医院临床应用过程中证明具有显著的临床疗效，深得广大医务工作者和患者的信任。在现有的致康胶囊的检测方法中，未制定成份没药的TLC鉴别方法、土大黄苷的液相检测方法、大黄酚的含量检测方法、冰片含量的气相测定法，对黄连的薄层色谱鉴别方法中含有苯，易对人体和环境造成�：ΑＮ徊娇刂聘貌返闹柿浚Ｖぜ觳馊嗽钡纳硖褰】担跎倩肪澄廴荆枰愿貌返募觳饨懈慕佣徊奖Ｖじ貌返闹柿亢土菩�。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种止血药物的检测方法，该检测方法能够有效控制药物的质量，使药物质量达到稳定、可控、高效及安全的标准，从而更好地满足医疗需要。本发明的目的是采用如下技术方案来实现的。一种止血药物的检测方法，所述止血药物由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨、白及、没药、海螵蛸、茜草和龙血竭组成(即致康胶囊)，该检测方法包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药，其中，所述薄层色谱的条件包括采用体积比为28 35 0. 9 1. 2，优选为30 1的甲苯-醋酸乙酯作为展开剂；采用加热显色，显色剂为1 % w/v 5% w/v，优选为1 % w/v的香草醛浓硫酸溶液， 加热温度为80-120°C，优选为105°C。在一个具体实施方案中，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药包括如下步骤取止血药物内容物3g，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50ml，超声60分钟，滤过，滤液挥干，加水50ml使溶解，滤过，滤液用乙醚萃取3次，每次20ml，收集合并乙醚液，挥干，残渣加石油醚(60 90°C ) Iml使溶解，作为供试品溶液；另取没药对照药材0. 3g，同法制成对照药材溶液；再取不含没药的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液；吸取上述溶液各ΙΟμΙ，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为30 1的甲苯-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新制的香草醛浓硫酸溶液，在105°C加热至斑点清晰。上述鉴定方法阴性无干扰，样品重性形良好，可以作为鉴别致康胶囊中没药的依据。上述检测方法还包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连，其中，所述薄层色谱的条件包括采用体积比为5 8 2.5 4 1 2. 5 1 2. 5 0.25 0.4，优选为 6 3 1.5 1.5 0.3的甲苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-水作为展开剂。现有方法中以苯- 乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水为展开剂，因苯对人体和环境有很大的�：Γ鲜黾觳夥椒ㄊ褂昧思妆酱姹剑〉昧私虾玫男Ч�。在一个具体实施方案中，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连包括如下步骤取止血药物内容物3g，加盐酸甲醇溶液20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. lg，加盐酸甲醇5ml溶液，滤过，滤液作为对照药材溶液；再取不含黄连的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液； 吸取溶液各2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6 3 1.5 1.5 0.3的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水为展开剂，置氨蒸汽饱和的层析缸内，展开，取出，晾干， 置365nm的紫外光灯下检视。上述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷，其中，所述液相色谱的条件包括采用十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂；采用体积比为36 64的甲醇-水为流动相；以及采用320nm的检测波长。在一个具体实施方案中，采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷包括如下步骤(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为36 64的甲醇-水为流动相；检测波长为320nm ；理论板数按大黄苷峰计算应不低于2000 ；(2)对照品溶液的制备取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含10μ g的溶液，即得；(3)供试品溶液的制备取止血药物内容物，研细，取0. 5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液即得；(4)测定分别精密吸取上述两种溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定。大黄为致康胶囊中的主药，对疗效起着重要作用，而劣质大黄和土大黄等非正品大黄，在化学成分上与正品大黄存在较大差异(均含土大黄苷)，因而在药效上必然存在很大差别。现有市场大黄中伪品较多，且性状相似，《中国药典2010年版一部》中用纸色谱对其进行检测且没有对照品比较，人为误差较大，考虑到投料量和提取的影响，再用纸色谱进行控制其意义不大。本发明采用高效液相色谱法检测大黄中的土大黄苷，经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰，整个试验过程可操作性强， 可以作为控制本品内在质量的指标之一。增加该检测方法旨在为更好的保证产品质量，维护病人用药的安全有效，净化药品市场及秩序，打击制假售假的违法行为，是为人民用药安全有效负责任。上述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚，其中，所述液相色谱的条件包括采用十八烷 基硅烷键合硅胶的填充剂；采用体积比为60 40 1的乙腈_水-冰醋酸为流动相；以及采用254nm的检测波长。在一个具体实施方案中，采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚包括如下步骤(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为60 40 1的乙腈-水-冰醋酸为流动相；检测波长254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000 ；(2)对照品溶液的制备取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml各含5 μ g的混合溶液，即得；(3)供试品溶液的制备取止血药物内容物，研细，取约0. 4g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率200W，频率40kHz) 40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过；精密吸取上述滤液 10ml，置烧瓶中，蒸干，加lmol/L盐酸溶液30ml，加三氯甲烷20ml，加热回流1小时，冷却， 分取三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷振摇提取3次，每次IOml，合并三氯甲烷液，蒸至近干， 用甲醇定量转移至IOml量瓶中，并稀释至刻度；用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；(4)测定分别精密吸取上述两种溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。大黄为致康胶囊处方中的君药，其有效成分为大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚以及甙类等蒽醌类成分。大黄素，大黄酚为其中含量较高的成分。致康胶囊的功能主治为清热凉血，化瘀止血。用于崩漏，吐血及便血。文献报道大黄酚的口服和皮下注射，均有明显缩短血液凝固时间的作用，具有止血作用，为制剂中的活性成分。现有技术中仅对大黄素进行了测定，为了更好地控制制剂质量，本发明对大黄酚的含量进行了测定。 用大黄素和大黄酚双分组控制制剂质量。经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰。整个试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。上述检测方法还包括采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量，其中所述气相色谱的条件包括采用聚乙二醇-20Μ为固定相，涂布浓度为10% ；以及采用柱温120°C保持1分钟，再以5°C /min升至180°C，保持2分钟。在一个具体实施方案中，采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量包括如下步骤(1)色谱条件与系统适用性试验以聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布浓度为10%，柱温120°C保持1分钟，再以 5°C /min升至180°C，保持2分钟，理论板数按龙脑峰计算应不低于1900 ；(2)校正因子测定
取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每Iml含Img的溶液，另取冰片对照品8mg，精密称定，置IOml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，吸取Iul，注入气相色谱仪，计算校正因子；(3) 测定取止血药物内容物，研细，取0.6g，精密称定，置IOml量瓶中，加内标溶液适量，超声处理(功率200W，频率40kHz) 20分钟，放冷，加内标溶液至刻度，摇勻，滤过，吸取Iul，注入气相色谱仪，测定。冰片为合成龙脑，具有开窍醒神，清热止痛的功效，对致康胶囊的临床疗效，起着重要的作用。本发明确定了冰片含量的测定方法，且经过方法学考察证明本方法灵敏度高， 重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰，整个试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。与现有技术相比，本发明至少存在以下有益效果1、本发明了增加了没药的薄层色谱鉴定，此方法阴性无干扰，样品重性形良好，可以作为鉴别致康胶囊中没药的依据。2、本发明在采用薄层色谱鉴定黄连时，使用甲苯-醋酸乙酯_异丙醇_甲醇_水为展开剂，减少了对人体和环境有很大的危害，取得了较好的效果。3、本发明增加了土大黄苷的液相色谱检测方法，试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。4、本发明增加了大黄酚的含量测定，用大黄素和大黄酚双组分控制制剂质量，经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰。5、本发明增加了冰片含量的气相色谱检测法，试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。本发明通过对止血药物致康胶囊中多种成分进行检测，能够有效控制致康胶囊的质量，使致康胶囊质量达到稳定、可控、高效及安全，是对产品的投料要求及原料的质量控制严格，克服现有技术的不足，提高产品的质量、疗效、生物利用度，更好的满足医疗的需要。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1是致康胶囊中没药的薄层色谱鉴定图，其中，1表示没药阴性；2-4表示三批样品；5表示没药对照药材；图2是致康胶囊中黄连的薄层色谱鉴定图，其中，1表示黄连阴性；2-4表示三批样品；5表示黄连对照药材；图3是土大黄苷的紫外光谱图；图4是大黄酚的紫外光谱图。
具体实施例方式下面通过实施例详细说明本发明，应当理解，下述实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1致康胶囊中没药的薄层色谱鉴定1、试验条件双槽展开缸(上海信谊)；硅胶G (薄层色谱用，青岛海洋化工厂)； 羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；薄层板自制，厚度0.3mm。其余试剂均为分析纯。2、试验步骤取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)内容物3g，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50ml，超声60分钟，滤过，滤液挥干，加水50ml使溶解，滤过， 滤液用乙醚萃取3次，每次20ml，收集合并乙醚液，挥干，残渣加石油醚(60 90°C ) Iml使溶解， 作为供试品溶液。另取没药对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例和工艺制备的不含没药的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10 μ 1， 分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯(30 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新制的香草醛浓硫酸溶液，在105°C加热至斑点清晰。三批供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显一相同颜色的蓝色斑点。 而阴性样品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，未显相同颜色的斑点，阴性无干扰。说明方中其它药味不影响没药的检出，因此，可以作为鉴别致康胶囊中没药的依据(见图1)。实施例2致康胶囊中黄连的薄层色谱鉴定1、试验条件双槽展开缸(上海信谊)；硅胶G (薄层色谱用，青岛海洋化工厂)； 羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；薄层板自制，厚度0.3mm。其余试剂均为分析纯。2、试验步骤取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)内容物3g，加盐酸甲醇溶液20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0. lg，加盐酸甲醇5ml溶液，滤过，滤液作为对照药材溶液。再取按处方比例和工艺制备的不含黄连的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水(6 3 1.5 1.5 0.3)为展开剂，置氨蒸汽饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。三批供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。而阴性样品色谱中， 在与对照药材色谱相应位置上，未显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。说明方中其它药味不影响黄连的检出，因此，可以作为鉴别致康胶囊中黄连的依据(见图2)。实MMl采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷一、检测方法参照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。1、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(36 64)为流动相；检测波长为 320nm ；理论板数按大黄苷峰计算应不低于2000。2、对照品溶液的制备取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含10μ g的溶液，即得。3、供试品溶液的制备取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)内容物，研细，取0. 5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液即得。4、测 定分别精密吸取上述两种溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定。结果判断供试品色谱中应不得出现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。二、方法学研究(1)测定波长的选择称取土大黄苷对照品适量，用甲醇溶解，在200 700nm范围内进行光谱扫描，结果在320nm波长处有最大吸收，故将检测波长选定为320nm。(见图3)(2)色谱条件与系统适用性试验色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(36 64)为流动相；检测波长为320nm ；流速1. Oml/min,理论板数按土大黄苷峰计算应不低于2000，分离度大于 1. 5。(3)对照品溶液的制备取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含10μ g的溶液，即得。(4)干扰性试验称取不含大黄的阴性样品，同样品方法制备阴性对照样品。结果阴性无干扰。(5)回收率试验取样品6份，分别加入土大黄苷对照品溶液5ml (0. 0801mg/ml)，置50ml量瓶中，再加甲醇适量，超声处理(功率200W，频率40kHz) 40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取
续滤液即得加样回收样品溶液，以下式计算回收率，结果见表1。
权利要求
1.一种止血药物的检测方法，所述止血药物由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨、白及、没药、海螵蛸、茜草和龙血竭组成，该检测方法包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药，其中，所述薄层色谱的条件包括采用体积比为28 35 0.9 1.2，优选为30 1的甲苯-醋酸乙酯作为展开剂；采用加热显色，显色剂为w/v 5% w/v，优选为w/v的香草醛浓硫酸溶液，力口热温度为80-120°C，优选为105°C。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药包括如下步骤取止血药物内容物3g，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50ml，超声60分钟，滤过，滤液挥干，加水50ml使溶解，滤过，滤液用乙醚萃取3次，每次20ml，收集合并乙醚液，挥干，残渣加石油醚(60 90°C ) Iml使溶解，作为供试品溶液；另取没药对照药材0. 3g，同法制成对照药材溶液；再取不含没药的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液；吸取上述溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为30 1的甲苯-乙酸乙酯为展开齐IJ，展开，取出，晾干，喷以新制的香草醛浓硫酸溶液，在105°C加热至斑点清晰。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连，其中，所述薄层色谱的条件包括采用体积比为5 8 2. 5 4 1 2. 5 1 2. 5 0.25 0.4，优选为 6 3 1.5 1.5 0.3的甲苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-水作为展开剂。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连包括如下步骤取止血药物内容物3g，加盐酸甲醇溶液20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至 lml，作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. lg，加盐酸甲醇5ml溶液，滤过，滤液作为对照药材溶液；再取不含黄连的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液；吸取溶液各2μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6 3 1.5 1.5 0. 3的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水为展开剂，置氨蒸汽饱和的层析缸内，展开，取出，晾干， 置365nm的紫外光灯下检视。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷，其中，所述液相色谱的条件包括采用十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂；采用体积比为36 64的甲醇-水为流动相；以及采用320nm的检测波长。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷包括如下步骤(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为36 64的甲醇-水为流动相；检测波长为320nm ；理论板数按大黄苷峰计算应不低于2000 ；(2)对照品溶液的制备取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含10μ g的溶液，即得；(3)供试品溶液的制备取止血药物内容物，研细，取0. 5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理40 分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液即得；(4)测定分别精密吸取上述两种溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚，其中，所述液相色谱的条件包括采用十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂；采用体积比为60 40 1的乙腈-水-冰醋酸为流动相；以及采用254nm的检测波长。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚包括如下步骤(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为60 40 1的乙腈-水-冰醋酸为流动相；检测波长254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000 ；(2)对照品溶液的制备取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml各含5 μ g的混合溶液，即得；(3)供试品溶液的制备取止血药物内容物，研细，取约0. 4g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率200W，频率40kHz) 40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过；精密吸取上述滤液 10ml，置烧瓶中，蒸干，加lmol/L盐酸溶液30ml，加三氯甲烷20ml，加热回流1小时，冷却， 分取三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷振摇提取3次，每次IOml，合并三氯甲烷液，蒸至近干， 用甲醇定量转移至IOml量瓶中，并稀释至刻度；用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；(4)测定分别精密吸取上述两种溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量，其中所述气相色谱的条件包括采用聚乙二醇-20Μ为固定相，涂布浓度为10% ；以及采用柱温120°C保持1分钟，再以5°C /min升至180°C，保持2分钟。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的检测方法，其特征在于，采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量包括如下步骤(1)色谱条件与系统适用性试验以聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布浓度为10%，柱温120°C保持1分钟，再以5°C / min升至180°C，保持2分钟，理论板数按龙脑峰计算应不低于1900 ；(2)校正因子测定取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每Iml含Img的溶液，另取冰片对照品 8mg，精密称定，置IOml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，吸取lul，注入气相色谱仪，计算校正因子；(3)测定取止血药物内容物，研细，取0. 6g，精密称定，置IOml量瓶中，加内标溶液适量，超声处理(功率200W，频率40kHz) 20分钟，放冷，加内标溶液至刻度，摇勻，滤过，吸取Iul，注 入气相色谱仪，测定。
全文摘要
本发明提供一种止血药物的检测方法，所述止血药物由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨、白及、没药、海螵蛸、茜草和龙血竭组成，该检测方法包括采用薄层色谱法鉴定所述致康胶囊中的没药、采用薄层色谱法鉴定所述致康胶囊中的黄连、采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷、检测大黄中的大黄酚以及采用气相色谱法检测所述致康胶囊中冰片的含量。本发明能够有效控制致康胶囊的质量，使致康胶囊质量达到稳定、可控、高效及安全，是对产品的投料要求及原料的质量控制严格，克服现有技术的不足，提高产品的质量、疗效、生物利用度，更好的满足医疗的需要。
文档编号G01N30/90GK102323371SQ201110121149
公开日2012年1月18日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年5月11日
发明者张琼, 胡小虎 申请人:西安千禾药业有限责任公司
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