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专利名称：基于磷光发光技术的免疫荧光试纸条及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于磷光发光技术的免疫荧光试纸条及其制备方法和应用，属于免疫试纸技术领域。
背景技术：
免疫分析法是基于抗原与相应抗体间免疫结合反应，即利用抗体(或抗原)作为选择性试剂来測定抗原、半抗原(或抗体)的方法。抗体与抗原间反应有极高的特异性，从而对免疫分析样品不需或仅需简单的预处理。抗体-抗原复合物有较高的稳定性，其稳定常数一般为109，甚至可达1015。遗憾的是，虽然抗体-抗原结合可显示某种催化特性，但从分析测试的角度考虑，免疫反应缺乏使用高灵敏性试剂所具备的分析信号反差，难以直接检测。因此，免疫反应必须通过与放射性同位素示踪、荧光或化学发光标记等高灵敏的标记 技术相结合，才能使其既具有极高的选择性，又具有极高的灵敏度。标记物的性质决定了信号检测的方法和其检测灵敏度，同时也影响和限制着测试方式的选择。根据标记物性质的不同，免疫分析法分为放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫分析法(FIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)等。由于荧光检测可以达到很高的灵敏度，又无放射性污染等环境问题，在免疫分析中占有十分重要的地位。为解决FIA受来自样品(特别是生物试样)较强且变化大的荧光背景，以及散射等因素的干扰问题，促进了长寿命、长波长荧光标记试剂(如镧系金属螯合物、P卜啉类化合物)的合成和时间分辨荧光技术的发展，目前非同位素标记分析的灵敏度已达到或超过放射免疫分析方法。磷光分析法是荧光分析法的姊妹技术，相对于荧光，它又有其很多独特的优越性(I)有大的Stokes位移，磷光的波长比荧光的波长长，和激发光谱离得较远，不会和激发光谱重叠，不仅可減少或消除试样(特别是生物试样)本底荧光和入射激发光的干扰，自吸收现象也有减轻；(2)由于T1 — S0自旋禁阻，磷光的寿命比荧光长，磷光的寿命约为10_3 10s，易于实现时间分辨測定；(3)选择性更好。但到目前，磷光免疫分析并未得到应有的发展。究其原因，主要受到磷光发光材料的限制，尤其是水溶性高，生物相容性好的磷光发光材料的缺乏，故未开发ー种既适合于免疫分析，又能显示磷光检测优势的磷光技木。尽管荧光免疫分析的研究和应用取得了广泛而深入的进展，但就磷光免疫分析而言，国内外尚都处于起步阶段。适于抗体(抗原)标记的、高发光效率磷光标记物的开发，是实现磷光免疫分析四个环节(抗体生产、标记试剂的选择、抗体(原)的标记、分析方式设计和分析信号检测)中最关键的环节。用于磷光免疫分析标记的试剂有三种一是高发光量子产率的荧光试剂(如异硫氰酸荧光素FITC) ; ニ是镧系元素(Eu、Tb、Sm、Gd和Dy等)离子与某些配体(如4，7-ニ苯基-1，10-菲罗啉ニ磺酸等)所形成的螯合物作为磷光标记物，发光波长处于长波，并有很长的发光寿命，能有效避开生物流体本底荧光的干扰，而且有很高的灵敏度。三是金属卟啉，特别是贵金属钼、钯的卟啉类化合物。金属卟啉是自然界中广泛存在的一类大环化合物，如血红素、叶绿素、VB12等，它们在生命体的新陈代谢以及很多基本生物过程中都起着不可忽视的作用。卟啉分子由四个吡咯环通过次甲基连结，形成一四配位卟啉核。卟啉环非常稳定，可与直径为3. 7埃的金属发生配位；它与过渡态金属形成的络合物尤其稳定，比如，Zn-四苯基卟啉(ZnTPP)，其稳定常数为1029。大部分金属都与卟啉形成I : I的络合物，只有Na、K、Li络合物的配合比为2 1，两个金属原子分别位于卟啉环平面的上方和下方。如图I所示，描述了卟啉能量跃迁产生磷光的原理。卟啉的电子吸收光谱主要有Soret带(又称B带)和Q带。Soret带位于400 450nm之间，摩尔吸光系数高(2 SxiO5Iiior1. L. cnT1)。而金属卩卜啉的Soret带吸收较弱，当环侧有亲电子基团时，Soret带将向长波方向移动。卟啉的Q带一般在450 650nm之间，有四个相关峰；当吡咯环氮上的氢被金属离子取代形成金属卟啉后，四个相关峰减弱或消失。卟啉和金属卟啉由于具有18电子大离域结构，所以，以其B带或Q带作为激发波长，均在600 700nm间(或更长的波长范围)有不同程度的突光发射；一般情况下，金属口卜啉的突光强度要弱于卟啉。室温下，P卜啉本身不发磷光，当与某些金属形成络合物并与有序介质(如表面活性剤、蛋白质和核酸等生物大分子)共存时才在近红外区发射磷光；但只有极少数的金属卟啉发磷光，最常见的为钯卟啉和钼卟啉。钯/钼卟啉具有极强的磷光，其特点是长寿命(ms),长波长(600 IOOOnm)。最常见的有水溶性meso-四(4-磺酸苯基)P卜啉(H2TSPP4_) 和meso-四(4-N-三甲氨基苯基)卟啉(H2TMAP4+)的钯/钼络合物，以及非水溶性的八こ基卟啉(OEP)和四苯基-四苯并卟啉(Ph4TBP)的钯/钼络合物等。600 IOOOnm的近红外区是研究生物物质发光探针和光化学传感器的一个极为有用的区域。所以，具有特殊磷光特性的钯/钼卟啉便成为生物分析方面非常有效的探针分子，结合一些简单的检测仪器便可提供很高的灵敏度和选择性。如附图14所示，在外界激发下，钼卟啉在650nm发出强磷光，持续时间100微秒(吸收波范围390-410nm)，钯卟啉在670nm发出强磷光持续时间500微秒(吸收波范围400-420nm)。这些卟啉粒子也有很大的Stokes位移(均为280nm)。与其它发光材料相比较，钼/钯卟啉的优势在于极微的光漂白，使用便宜的强光源，如发光二极管就能有效激发。此外，生物样本和硝酸纤维素膜的背景荧光在390-420nm激发比在以铕离子为代表的时间分辨荧光的激发光波长365nm时都低。尽管390_420nm光透过硝酸纤维素膜也不尽理想，但优于365nm光，更适合于透射式測量。钼卟啉还可共价标记抗体，为检测各种样本提供了一个灵敏的快速检测技木。目前，免疫层析技术中所使用的标记物通常是酶、胶体金以及各种彩色微球标记物，这些标记物应用于免疫层析技术中有相同的特点物理吸附方式标记和通过颜色判断检测結果。其中物理吸附方式标记(即疏水性和静电吸附原理)的特点使得其容易形成非特异性干扰，需要在生产エ艺配方中添加非特异性干扰消除试剂，如吐温20等表面活性剂等，但使用这类试剂的同时，也容易造成基于这类标记物的假阳性或假阴性的結果。另外通过颜色判读结果在使用时必然受观察者主观影响大，尤其是弱阳性结果，且只能做出定性判断，而无法实现精确的定量判定。这些缺点大大限制了免疫层析技术在临床检测中的应用。公开号为CN102087293A
公开日为2011年6月8日，名称为“ー种全程定量检测肌钙蛋白I的免疫层析试纸条及其制备方法”的专利申请公开了ー种荧光定量技木，但这类传统有机荧光材料没有解决其固有的光漂白问题；同时，生物样品自身荧光的干扰及有机荧光分子的光不稳定性等也降低了待测物的荧光信号，必将导致检测灵敏度偏低，检测线性范围窄，难以满足临床检测的需求。公开号为CN102192983A
公开日为2011年9月21日、名称为“时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用”的专利申请则公开了其采用填充了镧系稀土元素及其螯合物的时间分辨荧光微球作为标记探针。但对现有稀土荧光生物标记探针来说，ー个主要的缺点是几乎所有的镧系稀土荧光探针都需采用紫外光激发。到目前为止，已知的几种可见光激发镧系稀土元素配合物由于存在着水溶性差、极性配位溶剂中不稳定、荧光量子产率低或缺乏活性标记基团等问题而无法直接用于生物标记。这在很大程度上限制了这类探针在活体生物样品測定中的应用。中国专利号为ZL200410034104. O、名称为“基于上转换发光技术免疫层析试纸条”的专利公开了ー种免疫层析试纸条。其常用的上转换荧光材料主要以氟化物和氧化物为基质，掺杂Yb和Er等稀土元素。上转换纳米荧光材料的激发光为红外光，在此激发波长下生物样品具有极低的背景荧光，而检测波长在可见区，不存在复杂基质样品背景荧光干扰测 定的问题。上转换纳米荧光材料的光学稳定性好，没有光漂白和褪色现象。目前阻碍上转换纳米荧光材料在生化分析中应用的主要问题是其较低的量子产率和大的粒径，一般很难得到粒径小于50nm的强突光性上转换突光材料。公开号为CN1811449
公开日为2006年8月2日、名称为“量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法”和公开号为CN101893623A
公开日为2010年11月24日、名称为“超灵敏量子点微球免疫层析试纸条快速检测方法”的专利申请均公开了基于量子点技术的免疫层析试纸。量子点纳米颗粒能够在光激发下发出荧光，作为ー种新型的无机荧光纳米材料已被广泛地应用于生命科学领域，在生物医学研究中显示了很好的应用价值，使其成为生物传感和成像測定中重要的荧光探针。但作为荧光标记物使用时量子点仍然存在着ー些问题，如溶液中存在的聚集问题、生物标记后的稳定性问题、闪烁性荧光发光问题、复杂生物样品的背景荧光干扰问题、潜在的细胞毒性和对细胞生理过程的干扰问题等。

发明内容
本发明的目的是为了解决上述背景技术提出的现有技术存在的问题，进而提供一种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条及其制备方法和应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的—种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条，包括样品垫、结合物垫、分析膜、检测线、质控线、吸水垫和衬垫，所述衬垫的一面涂覆有胶水或粘附双面胶，所述样品垫、结合物垫、分析膜和吸水垫依次粘附在涂覆有胶水或粘附双面胶的衬垫上，分析膜上面设有检测线和质控线。—种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条的制备方法，①磷光材料标记物的制备将生物活性分子分别用缓冲液稀释，分别加入磷光材料溶解液，搅匀，室温反应至少I小时，用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，收集标记物，用磷酸盐缓冲液稀释混勻后保存；②样品垫的制备用纤维素膜作为样品垫固相材料，裁切成条状，用0. 01 % 0. 5 %聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、0. 01% 0. 05%表面活性剂的0. 01 0. 3M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH值为7. 2 7. 6，浸泡处理后，将样品垫放入真空干燥箱内干燥后取出，真空密封备用;③结合物垫的制备用玻璃纤维素膜作为结合物垫固相材料，裁切成条状，用含1% 5%牛血清白蛋白、0. I 2%聚こニ醇、0.5 2%蔗糖、0.01% 0. 1%表面活性剂的0.01 0. IM pH7. 2磷酸盐缓冲液稀释磷光材料标记物，制成悬液，用喷膜机喷涂在玻璃纤维素膜上，将结合物垫放入真空干燥箱内干燥后取出，真空密封备用；④分析膜的制备用缓冲液稀释检测线和质控线所使用的抗体至适合浓度，采用喷膜机分别喷涂在分析膜的检测线和质控线位置上，将喷膜后的分析膜放入真空干燥箱内，干燥后取出真空 密封备用；⑤吸水垫的制备选用Imm厚的滤纸作为吸水垫固相材料,将其裁切成25mmX300mm的条带,吸水垫在干燥环境保存备用；⑥成品试纸条的制备按照反应顺序，先将分析膜粘附在衬垫中间位置上，在分析膜上端粘附吸水垫，吸水垫在分析膜上方，二者重叠I 2mm ;在分析膜下端粘附结合物垫，结合物垫在分析膜上方，二者重叠I 2mm ;再在结合物垫下端粘贴样品垫，样品垫在结合物垫上方，二者重叠I 2mm ;将衬垫以及上面粘贴的样品垫、结合物垫、分析膜和吸水垫一同裁切成细条，即成一种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条。一种基于磷光发光技术的免疫荧光试纸条在检测生物样品中的应用，检测对象为全血、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、粪便以及前列腺液标本中抗原、抗体、药物、激素、毒品、抗生素、肿瘤标志物目标待测物，以及蔬菜、水果、食品、水源中农药、抗生素的残留检測。本发明中，对于定量检测项目，通过建立待测物标准品与磷光信号强度标准曲线，来实现定量检测。对于定性检测项目，则通过建立待测物临界值(Cut-off)的方式，来实现结果的判定，检测结果SCut-Off值则为阳性，反之则为阴性結果。本发明具有以下优点本发明采用磷光发光材料即钼/钯卟啉作为生物标记物，结果在緑色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，并可进行仪器判读，从而实现对目标被检测物的定量检测。本发明依据其待测物发生免疫反应方式的不同，将试纸条分为夹心法模式、竞争法模式、间接法模式和捕获法模式，依据检测对象的性质不同，可采用不同检测模式对样品中的不同待测物进行快速、灵敏地定性和定量检测分析。


图I为磷光产生原理示意图；图2为基于磷光发光技术的免疫突光试纸条的结构不意图；图3为夹心法模式反应示意图；图4为竞争法模式反应不意图5为间接法模式反应示意图；图6为捕获法模式反应示意图；图7为装配试纸条时各部分的粘贴示意图；图8为免疫层析试纸条的结构示意图；图9为试纸条检测卡的外部俯视图；图10为试纸条检测卡内部结构图(上为盖板，下位背板)；图11为双抗体夹心法模式检测标准工作曲线图；
图12为竞争法模式检测标准工作曲线图；图13为磷光材料的化学结构式示意图；图14为磷光材料的激发和发射光谱曲线图。
具体实施例方式下面将结合附图对本发明做进ー步的详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述实施例。如图2、图7和图8所不,本实施例所涉及的一种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条，包括样品垫I、结合物垫2、分析膜3、检测线4、质控线5、吸水垫6和衬垫7，所述衬垫7的一面涂覆有胶水或粘附双面胶，所述样品垫I、结合物垫2、分析膜3和吸水垫6依次粘附在涂覆有胶水或粘附双面胶的衬垫7上，分析膜3上面设有检测线4和质控线5。所述样品垫I和结合物垫2之间设有重叠区域，二者重叠I 2mm，重叠处样品垫I在上，结合物垫2在下。所述结合物垫2和分析膜3之间设有重叠区域，二者重叠I 2mm，重叠处结合物垫2在上，分析膜3在下。所述分析膜3和吸水垫6之间设有重叠区域，二者重叠I 2mm，重叠处吸水垫6在上，分析膜3在下。所述检测线4与质控线5间隔5mm。样品垫I是试纸条在使用过程中滴加待测样品的部位。结合物垫2中固定有磷光材料标记抗原或磷光材料标记抗体等活性分子结合物，在加入待测样品后，在此开始发生抗原-抗体免疫反应。分析膜3是层析试纸的核心部分，在其表面上分别固定有检测线4和质控线5 ;检测线4含有与待测样品发生免疫反应的抗原或抗体，质控线5含有与磷光材料标记物产生免疫反应的抗体。吸水垫6在整个检测过程中，通过虹吸作用提供液体流过整个试纸条的动力。各部分之间有重叠区域，以保证液体在试纸条上流动的连续性。当进行检测时，样品滴加在样品垫I上，样品通过渗透和虹吸作用进入结合物垫2，使其中的磷光材料标记物溶解释放，在吸水垫6的虹吸作用下，液体进入分析膜3，依次流经检测线4和质控线5，并发生特异性免疫反应，产生具有指示性的磷光信号。—种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条的制备方法，①磷光材料标记物的制备将生物活性分子分别用缓冲液稀释，分别加入磷光材料溶解液，搅匀，室温反应至少I小时，用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，收集标记物，用磷酸盐缓冲液稀释混勻后保存；
②样品垫的制备用纤维素膜作为样品垫固相材料，裁切成条状，用0. 01 % 0. 5 %聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、0. 01% 0. 05%表面活性剂的0. 01 0. 3M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH值为7. 2 7. 6，浸泡处理后，将样品垫放入干燥箱内干燥后取出，真空密封备用；③结合物垫的制备用玻璃纤维素膜作为结合物垫固相材料，裁切成条状，用含1% 5%牛血清白蛋白、0. I 2%聚こニ醇、0.5 2%蔗糖、0.01% 0. 1%表面活性剂的0.01 0. IM pH7. 2磷酸盐缓冲液稀释磷光材料标记物，制成悬液，用喷膜机喷涂在玻璃纤维素膜上，将结合物垫放入干燥箱内干燥后取出，真空密封备用； ④分析膜的制备用缓冲液稀释检测线和质控线所使用的抗体至适合浓度，采用喷膜机分别喷涂在分析膜的检测线和质控线位置上，将喷膜后的分析膜放入干燥箱内，干燥后取出真空密封备用;⑤吸水垫的制备选用Imm厚的滤纸作为吸水垫固相材料,将其裁切成25mmX300mm的条带,吸水垫在干燥环境保存备用；⑥成品试纸条的制备按照反应顺序，先将分析膜粘附在衬垫中间位置上，在分析膜上端粘附吸水垫，吸水垫在分析膜上方，二者重叠I 2mm ;在分析膜下端粘附结合物垫，结合物垫在分析膜上方，二者重叠I 2mm ;再在结合物垫下端粘贴样品垫，样品垫在结合物垫上方，二者重叠I 2mm ;将衬垫以及上面粘贴的样品垫、结合物垫、分析膜和吸水垫一同裁切成细条，即成一种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条。如图9和图10所示，将试纸条装配于塑料卡内，样品垫正对加样孔，分析膜正对检测窗，即成为ー种快速定量检测的免疫层析检测卡。所述生物活性分子为抗HBs单克隆抗体B、羊抗兔IgG抗体、HIV抗原B、兔抗吗啡单克隆抗体B、鼠抗人IgG抗体或基因工程重组戊肝抗原(HEV-Ag)。所述衬垫7由聚对苯ニ甲酸こニ醇酯材料制成。如图14所不,所述磷光材料为金属卩卜啉系列突光染料,所述金属卩卜啉为钼/钮ロ卜啉，所述金属卟啉的激发光光谱范围为390-420nm，发射光波长范围为600_700nm。一种基于磷光发光技术的免疫荧光试纸条在检测生物样品中的应用，检测对象为全血、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、粪便以及前列腺液标本中抗原、抗体、药物、激素、毒品、抗生素、肿瘤标志物目标待测物，以及蔬菜、水果、食品、水源中农药、抗生素的残留检測。本发明中，对于定量检测项目，通过建立待测物标准品与磷光信号强度标准曲线，来实现定量检测。对于定性检测项目，则通过建立待测物临界值(Cut-off)的方式，来实现结果的判定，检测结果SCut-off值则为阳性，反之则为阴性結果。当进行样品检测时，将样品滴加在样品垫上，样品通过渗透和虹吸作用进入结合物垫，使其中的磷光材料标记的结合物重新溶解，并在吸水垫的虹吸作用下，从结合物垫释放并进入分析膜，向吸水垫方向流动。在分析膜中移动过程中，磷光标记物、目标待测物、检测线、质控线之间将发生特异性的免疫反应，并在检测线和质控线产生具有指示性的光信号。依据在试纸条上检测线所发生免疫学反应方式的不同，可将试纸条分为夹心法模式、竞争法模式、间接法模式和捕获法模式。夹心法模式试纸条主要用于检测样品中的大分子蛋白，如病原体微生物感染产生的抗原抗体等。对抗原进行检测的方法为双抗体夹心法，对抗体进行检测的方法为双抗原夹心法。附图3即为夹心法模式试纸条示意图。在双抗体夹心法试纸条制备过程中，首先将磷光材料标记目标待测物特异性抗体AS (即仅能与目标待测物A抗原表位反应)，并固定在结合物垫内；将待测物特异性抗体BlO(即仅能与目标待测物B抗原表位反应)固定在分析膜检测线；将能与特异性抗体A反应的ニ抗11固定在分析膜的质控线。在检测过程中，当检测线和质控线同时都产生磷光信号，是为阳性反应结果，说明检测样品中含有目标待测物9 ;当检测线没有产生磷光信号而质控线产生磷光信号，是为阴性反应结果，说明检 测样品中不含有目标待测物9。在夹心法模式中，检测线磷光信号強度的高低与样品中目标待测物9浓度成正比关系，即目标待测物9浓度越高，磷光信号強度越高。将上述抗体A与抗体B更换成抗原A和抗原B，即建立双抗原夹心法试纸条，可对病原体微生物感染产生的抗体进行检測。检测过程、结果判断与双抗体夹心法检测抗原相同。竞争法模式试纸条主要用于检测样品中的小分子抗原、半抗原。如こ肝病毒e抗体和核心抗体、小分子激素、药物、毒品以及食品中残留的农药及抗生素等成分。附图4即为竞争法模式试纸条示意图。在竞争法试纸条制备过程中，首先将磷光材料标记目标待测物特异性抗体A12 (即仅能与目标待测物A抗原表位反应)，并固定在结合物垫内；然后将目标待测物抗原13 (含有抗体A特异性反应抗原表位A)固定在分析膜检测线；将能与特异性抗体A反应的ニ抗15固定在分析膜的质控线。当样品中目标待测物13浓度高时，检测线不产生磷光信号而质控线产生磷光信号，是为阳性反应结果，说明检测样品中含有超过一定浓度的目标待测物13 ;当检测线和质控线都产生磷光信号，是为阴性反应结果，说明检测样品中目标待测物13低于一定浓度甚至浓度为零。在竞争法模式中，检测线磷光信号強度的高低与样品中目标待测物13浓度成反比关系，即目标待测物13浓度越高，磷光信号強度越低。间接法模式试纸条主要用于检测病原体微生物感染后产生的IgG抗体。附图5即为间接法模式试纸条示意图。在间接法试纸条制备过程中，首先将磷光材料标记抗抗体16(主要是抗人免疫球蛋白IgG抗体)，并固定在结合物垫内；然后将某种抗原17固定于分析膜检测线；将IgG19固定于分析膜质控线。在检测过程中，当检测线和质控线同时都产生磷光信号，是为阳性反应结果，说明检测样品中含有目标待测物18 ;当检测线没有产生磷光信号而质控线产生磷光信号，是为阴性反应结果，说明检测样品中不含有目标待测物18。在间接法模式中，检测线磷光信号強度的高低与样品中目标待测物18浓度成正比关系，即目标待测物18浓度越高，磷光信号強度越高。间接法的优点在于只要变换检测线抗原就可利用同一磷光标记抗抗体建立检测相应抗体的方法。以葡萄球菌蛋白A替代抗人免疫球蛋白IgG抗体，可实现对多种动物的IgG抗体的检测。间接法模式一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用间接法直接測定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到分析膜检测线上，从而影响检测灵敏度。同时，类风湿因子会干扰IgM的检测，导致特异性变差。捕获法模式试纸条主要用于检测病原体微生物感染后产生的IgM抗体。附图6即为捕获法模式试纸条示意图。在捕获法试纸条制备过程中，首先将磷光材料标记某种抗原20，并固定在结合物垫内；然后将抗抗体22 (主要是抗人免疫球蛋白IgM抗体)固定于分析膜检测线；将能与抗原反应的特异性抗体23固定于分析膜质控线。在检测过程中，当检测线和质控线同时都产生磷光信号，是为阳性反应结果，说明检测样品中含有目标待测物21 ；当检测线没有产生磷光信号而质控线产生磷光信号，是为阴性反应结果，说明检测样品中不含有目标待测物21。在捕获法模式中，检测线磷光信号強度的高低与样品中目标待测物21浓度成正比关系，即目标待测物21浓度越高，磷光信号強度越高。本发明提供的磷光标记的生物活性分子，包括抗原、抗体、抗抗体、葡萄球菌蛋白A、受体配体、药物、细胞等。
磷光材料为钼/钯卟啉化合物，结构式见附图13，R1_R8修饰基团，用来标记抗原、抗体等生物活性分子，基团可以是氨基(-NH2)、羧基(-C00H)、巯基(-SH)、硫氰酸基(-NCS)等任何一个或几个的组合，以硫氰酸基(-NCS)为首选。如图14所示，钼卟啉的激发光波长为380nm,发射波长为648nm ;钮卩卜啉的激发波长为393nm,发射波长为667nm。本发明传感器的透镜及其焦距等具体光学结构和參数据此来设计。实施例I :双抗体夹心法模式检测こ型肝炎病毒表面抗原HBsAg定量检测こ型肝炎病毒表面抗原免疫层析试纸条制备方法，包括如下步骤I、磷光发光材料标记抗HBs的制备将抗HBs单克隆抗体B和羊抗兔IgG抗体，分别用0. IM pH9. 6碳酸氢钠-碳酸钠溶液稀释至lmg/ml,各取5ml抗体溶液,分别加入30mg磷光发光材料金属P卜啉溶解液,搅匀，室温孵育I小时，每隔15分钟混匀一次。最后用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化,收集标记好的金属卟啉标记抗HBs抗体B和羊抗兔IgG抗体，用含0. I %聚こニ醇、2%牛血清白蛋白、2%蔗糖、0. 05%表面活性剂的0. OlM pH7. 2磷酸盐缓冲液稀释，用试剂瓶密封包装，于2 8°C条件下保存。2、样品垫的制备选用纤维素膜作为样品垫的固相载体材料，将其裁切成5mm X300mm规格的条带。将样品垫至于长方形容器内，用含0. 2%聚こニ醇6000、2. 5%牛血清白蛋白、0. 03%表面活性剂的0. 05M pH7. 4磷酸盐缓冲液浸泡30min。浸泡处理后，将样品垫取出，置于洁净的网状支架上，放入60°C的干燥箱内干燥80分钟后取出用铝箔袋抽真空密封备用。3、结合物垫的制备选用玻璃纤维素膜作为结合物垫的固相载体，将其裁切成5mmX300mm规格的条带。将2 8°C保存备用的金属卟啉标记抗HBs抗体B和羊抗兔IgG抗体，用含I % -5 %牛血清白蛋白、0. 1-2%聚こニ醇、0. 5-2%蔗糖、0. 01% -0. 1%表面活性剂的0. 01-0. IM pH7. 2磷酸盐缓冲液稀释制成悬液。用喷膜机喷膜划线，膜液量为10ul/mm，然后置于洁净的网状支架上，放入37°C的干燥箱内干燥60分钟后取出用铝箔袋抽真空密封保存。4、分析膜的制备检测线包被液的制备用50mM pH7. 6磷酸盐缓冲液，内含甲醇I %、海藻糖0. 5%,牛血清白蛋白0. 5%，稀释抗HBs多克隆抗体A至终浓度2mg/ml。质控线包被液的制备用50mM pH7. 6磷酸盐缓冲液，内含甲醇1%、牛血清白蛋白0. 8%，稀释兔IgG至终浓度0. 5mg/ml。选用硝酸纤维素膜作为固相载体，将其裁切成25mmX300mm规格的条带。用喷膜机在25mm宽的分析膜上，从下往上IOmm处喷膜划线，膜液量为2ul/mm，作为检测线。用喷膜机在25mm宽的分析膜上，从下往上15mm处喷膜划线，膜液量为I. 5ul/mm，作为质控线。检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，将分析膜放置37°C干燥箱处理50分钟，取出后用铝箔袋抽真空装袋密封保存备用。 5、吸水垫的制备选用Imm厚的滤纸作为吸水垫固相材料,将其裁切成25mmX300mm的条带。吸水垫
在干燥环境保存备用。6、制备检测HBsAg的免疫层析试纸条按照反应顺序，先将分析膜粘附在衬垫中间位置上，在分析膜上端粘附上吸水垫，吸水垫在分析膜上方，二者重叠l_2mm ;在分析膜下端粘附上结合物垫，结合物垫在分析膜上方，二者重叠l-2mm。再在结合物垫下端粘贴样品垫，样品垫在结合物垫上方，二者重叠l-2mm。将粘贴好样品垫、结合物垫、分析膜、吸水垫的衬垫裁切成一定规格的细条，即成ー种快速定量检测的免疫层析试纸条。将试纸条装配于塑料卡内，样品垫正对加样孔，分析膜正对检测窗，即成为ー种快速定量检测的免疫层析检测卡。7、HBsAg免疫层析试纸的检测将待检测血清样品20ul加于检测卡加样孔中，再加入IOOul pH7. 20. 05M磷酸盐缓冲液，待反应IOmin后，用磷光生物传感器判读检测窗中的检测线和质控线，以得出结果。8、标准工作曲线的绘制首先，将提纯的HBsAg标准品用I : 10稀释的正常人血清(采用pH7. 20. 02M PB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份样品。其次,姆个样品分别用10个HBsAg试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最終根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C結果，列于下表。(表I)
浓度(ng/ml) |" 010|" 2550「100200
T 平均值 "0.227210.974447.395879.4031784. 198 3770.301
C 平均值 "13. 83312. 98313. 76613. 26412. 87313. 037
T/C" 0.0216.2532.566.30138.61289.2以T/C值作为X坐标，以HBsAg浓度作为Y坐标绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式为Y = 0. 6923X+1. 5243，拟合系数的平方为R2 = 0. 9991。结果见附图11 :HBsAg检测标准工作曲线。9、实际检测结果
对实施例I的试纸条进行性能方面的测定，最低检测限为0. Olng/mlo同时对临床样品进行检测。将58例收集自医院的HBsAg临床样品(其中阳性37份，阴性21份)同时用胶体金免疫层析试纸与本系统进行双盲法检测胶体金免疫层析试纸法——31份阳性，27份阴性(即6份阳性漏检)；钼卟啉试纸与仪器法——37份阳性，21份阴性，与实际结果完全吻合。同时，与胶体金免疫层析试纸的定性检测相比，钼卟啉试纸与仪器法给出了每份样品的最终浓度。将此58例收集自医院的HBsAg临床样品，同时与美国罗氏(Roche)公司HBsAg电化学发光法试剂检测进行相关性分析，以电化学发光检测结果作为X坐标，钼卟啉试纸与仪器法结果作为Y坐标绘制相关性分析曲线，表达式为Y = O. 9993X-2. 6157，相关性系数为r = 0. 9988。按照统计学分析，r > 95%, P < 0. 01，具有正相关关系。在批内精密度方面，利用实施例I的试纸条，对含量分别为高值、中值和低值的样品，连续进行至少10次检测，计算变异系数(CV)。对于HBsAg含量高值(100ng/ml)、中值(40ng/ml)、低值(5ng/ml)样品各一份分别測定10次，根据其測定的数据，采用SPSS统计方法分析，以测定结果均值土标准差表示，高值98. 3±3. 6ng/ml, CV2. 9 % ;中值39. 6±1. 8ng/ml，CV5. 6% ;低值 4. 7±0. 6ng/ml, CV7. 9% ;检测结果 CV 值均小于 15%。在批间精密度方面，利用实施例I的试纸条，对ー份HBsAg临床阳性样品用PH7. 20. 02M PB缓冲液稀释10倍，连续进行至少10次检测，结果列于下表。计算该份样品重复检测的变异系数(CV)为4. 73%。(表2)
权利要求
1.一种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条，其特征在于，包括样品垫、结合物垫、分析膜、检测线、质控线、吸水垫和衬垫，所述衬垫的一面涂覆有胶水或粘附双面胶，所述样品垫、结合物垫、分析膜和吸水垫依次粘附在涂覆有胶水或粘附双面胶的衬垫上，分析膜上面设有检测线和质控线。
2.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫和结合物垫之间设有重叠区域，二者重叠I 2mm，重叠处样品垫在上，结合物垫在下。
3.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于，所述结合物垫和分析膜之间设有重叠区域，二者重叠I 2mm，重叠处结合物垫在上，分析膜在下。
4.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于，所述分析膜和吸水垫之间设有重叠区域，二者重叠I 2mm，重叠处吸水垫在上，分析膜在下。
5.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于，所述检测线与质控线间隔5mm。
6.一种权利要求I所述试纸条的制备方法，其特征在干， ①磷光材料标记物的制备 将生物活性分子分别用缓冲液稀释，分别加入磷光材料溶解液，搅匀，室温反应至少I小时，用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，收集标记物，用磷酸盐缓冲液稀释混匀后保存； ②样品垫的制备 用纤维素膜作为样品垫固相材料，裁切成条状，用0. 01% 0. 5 %聚こニ醇、I % 5%牛血清白蛋白、0. 01% 0. 05%表面活性剂的0. 01 0. 3M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH值为7. 2 7. 6，浸泡处理后，将样品垫放入真空干燥箱内干燥后取出，真空密封备用； ③结合物垫的制备 用玻璃纤维素膜作为结合物垫固相材料，裁切成条状，用含1% 5%牛血清白蛋白、0. I 2%聚こニ醇、0. 5 2%蔗糖、0. 01% 0. 1%表面活性剂的0. 01 0. IM pH7. 2磷酸盐缓冲液稀释磷光材料标记物，制成悬液，用喷膜机喷涂在玻璃纤维素膜上，将结合物垫放入真空干燥箱内干燥后取出，真空密封备用； ④分析膜的制备 用缓冲液稀释检测线和质控线所使用的抗体至适合浓度，采用喷膜机分别喷涂在分析膜的检测线和质控线位置上，将喷膜后的分析膜放入真空干燥箱内，干燥后取出真空密封备用; ⑤吸水垫的制备 选用Imm厚的滤纸作为吸水垫固相材料，将其裁切成25mmX300mm的条带，吸水垫在干燥环境保存备用； ⑥成品试纸条的制备 按照反应顺序，先将分析膜粘附在衬垫中间位置上，在分析膜上端粘附吸水垫，吸水垫在分析膜上方，二者重叠I 2mm ;在分析膜下端粘附结合物垫，结合物垫在分析膜上方，二者重叠I 2mm ;再在结合物垫下端粘贴样品垫，样品垫在结合物垫上方，二者重叠I 2mm ;将衬垫以及上面粘贴的样品垫、结合物垫、分析膜和吸水垫一同裁切成细条，即成ー种基于磷光发光技术的免疫突光试纸条。
7.根据权利要求6所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述生物活性分子为抗HBs单克隆抗体B、羊抗兔IgG抗体、HIV抗原B、兔抗吗啡单克隆抗体B、鼠抗人IgG抗体或基因工程重组戊肝抗原。
8.根据权利要求6所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述衬垫由聚对苯ニ甲酸こニ醇酯材料制成。
9.根据权利要求6所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述磷光材料为金属卟啉系列荧光染料，所述金属卟啉为钼/钯卟啉，所述金属卟啉的激发光光谱范围为390-420nm，发射光波长范围为600_700nm。
10.一种权利要求6所述制备方法制备的免疫荧光试纸条在检测生物样品中的应用，其特征在于，检测对象为全血、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、粪便以及前列腺液标本中抗原、抗体、药物、激素、毒品、抗生素、肿瘤标志物目标待测物，以及蔬菜、水果、食品、水源中农药、抗生素的残留检测。
全文摘要
本发明提供了一种基于磷光发光技术的免疫荧光试纸条及其制备方法和应用，试纸条采用磷光发光材料即铂/钯卟啉作为生物标记物，结果在绿色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，并可进行仪器判读，从而实现对目标被检测物的定量检测。试纸条包括样品垫、结合物垫、分析膜、吸水垫和衬垫。结合物垫固定有磷光发光材料标记物，分析膜上固定有检测线和质控线。本发明还公开了该试纸条的制备方法和在生物样品定量检测中的应用。依据其待测物发生免疫反应方式的不同，将试纸条分为夹心法模式、竞争法模式、间接法模式和捕获法模式，依据检测对象的性质不同，可采用不同检测模式对样品中的不同待测物进行快速、灵敏地定性和定量检测分析。
文档编号G01N33/558GK102866251SQ20121020332
公开日2013年1月9日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者谢爱武 申请人:深圳市艾瑞生物科技有限公司