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专利名称：使用质谱分析法确定植物配型的方法
技术领域：
本发明涉及识别针对感兴趣的等位基因纯合的种子的方法，以及识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的方法。背景在植物育种或植物进化实验中的常规做法是由已知来源的种子来种植植物。这些种子被种植在实验田、生长室、温室或其他的生长条件下，其中它们与其他已知来源的植物进行异花授粉或自花授粉。所生成的种子是来自两个亲本植物或自花授粉植物的后代，并且将其收获、处理并种植以便于继续植物育种循环。为了辅助育种或推进选择过程，可以在植物、植物组织、种子和/或种子组织上进行特定实验室或基于大田的测试。基于已知的异花或自花授粉的植物世代被种植并且然后进行测试以便于弄清它们是否具有市场中所希望的特征。所希望的性状的实例包括但不限于，增加的产量、增加的纯合性、改进的或新近赋予的对于特定除草剂和/或有害生物和/或病原体的抗性和/或耐受性、增加的含油量、改变的淀粉含量、营养食品组合物、耐寒性以及具体的基于形态学的性状的增强。如可以理解的以及现有技术中已知的，这些实验在规模上可以是巨大的。需要庞大的劳动力来设计实验、种植种子、维持植物以及以另外的方式进行这些实验，这些实验可以包括成千上万的单个植物。此类实验还需要实质上的土地资源-当植物萌发、生长并产生种子时，一个实验可以占用数千英亩的土地数个月。然后，必须对大量种子单个地进行标记、收获并且处理。另一个复杂之处是这些实验的许多毫无结果。在文献中已有报道，一些种子公司在该实验的早期丢弃任何一个世代中的80%-90%的植物。因此，大部分花费在用于种子的生长、收获以及收获后处理的大量土地、人力和物力最终被浪费了。时间压力也是一个因素。为了更快速地推进植物的品系或品种以实现更多且更好的性状和特征，植物育种中的显著推进向种子公司施加了更多压力。因此，植物育种者以及有关的工作人员处于不断增加的压力之下，以便于更有效和更有力地处理这些世代，并且对应当继续进入下一世代育种的植物进行更多和更初期的选择。因此，出现了通过基于实验室的种子测试以实现在早期识别所感兴趣的性状的动作。此类测试总体上包括从该种子中去除组织样品，以使得这些种子在去除该组织样品之后仍有活力。对这些种子进行测试本身避免了这些种子在检验之前生长为不成熟的植株的需要，节省了时间、空间以及工作量。此外，在种植之前对这些种子进行测试允许消除缺乏这个或这些所希望性状的品系。换言之，可以选择并只种植那些包含这个或这些所希望性状的种子，以消除在识别并丢弃之前，缺乏这个或这些所希望性状的种子生长为不成熟的植物时发生的浪费。总之，在一个给定的种子亚群中，一个所希望的性状的早期识别可以减少用于实验测试所需要的土地量、必须检验的种子/植物量以及识别具有所希望的性状的种子/植物所需要的时间量。常规的种子测试技术目的在于使用传统的遗传检验确定种子的遗传组成。虽然已经证明此类技术对识别包含给定基因的种子而言是有用的，它们局限于它们可以提供的信息的量以及类型。因为每一个测试都必然地聚焦在一个感兴趣的单个基因上，如果希望调查多基因的话必须进行多个检验。此外，此类测试只能阐明一个给定的种子是否包含该感兴趣的基因-这些检验不能确定这些种子实际上是否会表达所希望的基因产物。常规的遗传测试也不能用于确定这些种子是否表达任意特定的蛋白形式。使用质谱分析法来定量衍生自胚乳(已经从这些种子中去除)的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量，通过提供识别针对一个等位基因纯合的种子的方法，本发明克服了本领域的许多缺点。本发明还提供了用于生产针对一个感兴趣的等位基因纯合的植物的方法。还提供了用于实施本发明的这些方法的系统。将在下文更详细地解释本发明。本说明书并非旨在成为实施本发明的所有的不同方法、或所有的加至本发明的特征的详细目录。例如，对于一个实施例所展示的特征可以结合在其他实施例中，并且对于一个特定的实施例所展示的特征也可以从那个实施例中删除。此外，鉴于本披露的内容，在此建议的不偏离本发明的多种变体以及对不同实施例的增添对于本领域的普通技术人员将是清楚的。因此，以下说明书旨在说明本发明的一些具体的实施例，并且不是穷尽性地限定所有的排列、组合以及其变体。发明概述提供了用于识别针对感兴趣的等位基因纯合的种子的方法。还提供了用于生产针对感兴趣的等位基因纯合的植物的方法。还提供了用于识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的方法。还提供了用于生产具有所希望性状的植物的方法。可以将此类方法用于增强植物发育的效率并且改进的技术包括但不限于，传统的育种、标记辅助的选择以及转化。在某些实施例中，提供了用于识别针对感兴趣的等位基因纯合的种子的方法。此类方法可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:I)从种子中去除胚乳的一部分；2)使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的一种感兴趣的蛋白；并且3)确定该种子针对感兴趣的等位基因纯合。在某些实施例中，提供了生产针对感兴趣的等位基因纯合的植物的方法。此类方法可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:I)从种子中去除胚乳的一部分；2)使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的一种感兴趣的蛋白；3)确定该种子针对感兴趣的等位基因纯合；并且4)从该种子生长一种植物。在某些实施例中，该种子从一个包含该感兴趣的等位基因的第一植物或种质与一个包含该感兴趣的等位基因的第二植物或种质进行杂交而得来。在某些此类的实施例中，该第一植物或种质针对该感兴趣的等位基因是纯合的并且第二植物或种质针对该感兴趣的等位基因是杂合的，而在其他此类实施例中，该第一植物或种质针对该感兴趣的等位基因是杂合的并且第二植物或种质针对该感兴趣的等位基因是纯合的。在又此外的此类实施例中，该第一植物或种质以及第二植物或种质针对该感兴趣的等位基因都是杂合的。在某些实施例中，该种子从已经用该感兴趣的等位基因转化的植物中得来。
在某些实施例中，使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白包括将与感兴趣的肽相关联的峰和与标准品的已知量相关联的峰的相对强度进行比较。在某些实施例中，该标准品可以是一种同位素标记的、与感兴趣的肽化学上相同的肽。在某些实施例中，该标准品可以是一种无关的分子(例如，皮质醇)。在某些实施例中，使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白包括与感兴趣的肽相关联的峰的相对定量。在某些此类实施例中，将衍生自第一种子样品中的与感兴趣的肽相关联的峰的强度与衍生自另一个种子样品中的等效峰的强度不使用任何标准品或内标准进行比较。在某些实施例中，使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白包括与感兴趣的肽相关联的峰的相对定量。在某些此类实施例中，将衍生自第一种子样品中的与感兴趣的肽相关联的峰的强度与衍生自多个其他种子样品中的等效峰的强度不使用任何标准品或内标准进行比较。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因纯合可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:确定衍生自从第一种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量至少是衍生自从第二种子中去除的胚乳的一部分的一种样品中的感兴趣的蛋白量的大约两倍。某些此类实施例进一步包括确定该第二种子针对感兴趣的等位基因是杂合的。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因纯合可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:确定衍生自从第一种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量至少是衍生自从第二种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量的大约两倍并且确定衍生自从第三种子中去除的胚乳的一部分的样品中不包含可检出量的该感兴趣的蛋白。某些此类实施例进一步包括确定该第二种子针对感兴趣的等位基因是杂合的，确定该第三种子不包含该感兴趣的等位基因和/或确定该第三种子不包含感兴趣的功能等位基因(即，如果存在的话，该感兴趣的等位基因就功能而言，不导致可检出的量的感兴趣蛋白)。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因纯合可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:确定该种子不包含可检出量的感兴趣的蛋白。在某些此类实施例中，与该感兴趣的等位基因相关联的所希望性状的至少一个是该感兴趣的蛋白的下降或消除。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因纯合可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:将衍生自已经从第一种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量与一个或多个参比值进行比较。在某些此类实施例中，这个或这些参比值可以与其相关联或获得自:衍生自从种子(针对感兴趣的等位基因纯合)中去除的胚乳的一部分的样品，衍生自从种子(针对感兴趣的等位基因杂合)中去除的胚乳的一部分的样品，衍生自从种子(不包含感兴趣的等位基因)中去除的胚乳的一部分的样品和/或衍生自从种子(针对感兴趣的功能等位基因)中去除的胚乳的一部分的样品。在某些实施例中，提供了用于识别针对一个感兴趣的等位基因纯合的种子的系统。此类系统可以包括、主要由以下项组成或由以下项组成:I)用于从种子中去除胚乳的一部分的装置；以及
2)用于使用质谱分析法来定量衍生自从胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的装置。在某些实施例中，提供了识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的方法。此类方法可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:I)从种子中去除胚乳的一部分；2)使用质谱分析法来定量衍生自从该胚乳部分的样品中的一种感兴趣的蛋白；并且3)确定该种子可能生产一种具有所希望性状的植物。在某些实施例中，提供了生产具有所希望性状的植物的方法。此类方法可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:I)从种子中去除胚乳的一部分；2)使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳部分的样品中的一种感兴趣的蛋白；3)确定该种子可能生产一种具有所希望性状的植物；并且4)从该种子生长一种植物。在某些实施例中，该种子从一个具有该感兴趣的性状的第一植物或种质与一个缺乏该感兴趣的性状的第二植物或种质进行杂交而得来。在某些实施例中，该种子从已经用与该感兴趣的性状相关联的等位基因转化的植物中得来。在某些实施例中，使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白包括将与感兴趣的肽相关联的峰和与一个已知量的标准品相关联的峰的相对强度进行比较。在某些实施例中，该标准品可以是一种同位素标记的、与感兴趣的肽化学上相同的肽。在某些实施例中，该标准品可以是一种无关的分子(例如，皮质醇)。在某些实施例中，使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白包括与感兴趣的肽相关联的峰的相对定量。在某些此类实施例中，将衍生自第一种子样品中的与感兴趣的肽相关联的峰的强度与衍生自另一个种子样品中的等效峰的强度不使用任何标准品或内标准进行比较。在某些实施例中，使用质谱分析法来定量衍生自胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白包括与感兴趣的肽相关联的峰的相对定量。在某些此类实施例中，将衍生自第一种子样品中的与感兴趣的肽相关联的峰的强度与衍生自多个其他种子样品中的等效峰的强度不使用任何标准品或内标准进行比较。在某些实施例中，确定一个种子可能生产具有所希望性状的植物可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:确定衍生自从第一种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量高于衍生自从第二种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量。在某些此类实施例中，衍生自从该第一种子中去除的该胚乳的部分的样品中的感兴趣的蛋白量至少是衍生自从该第二种子中去除的该胚乳的部分的样品中的感兴趣的蛋白量的大约两倍。某些此类实施例进一步包括确定该第二种子可能生产缺乏所希望性状的植物。在某些实施例中，确定一个种子可能生产具有所希望性状的植物可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:确定衍生自从第一种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量低于衍生自从第二种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白量。在某些此类实施例中，衍生自从该第一种子中去除的该胚乳的部分的样品中的感兴趣的蛋白量是衍生自从该第二种子中去除的该胚乳的部分的样品中的感兴趣的蛋白量的至少大约一半。某些此类实施例进一步包括确定该第二种子可能生产一种具有所希望性状的植物。在某些实施例中，确定一个种子可能生产具有所希望性状的植物可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:确定衍生自从该种子中去除的胚乳的一部分的样品中不包含可检出量的感兴趣的蛋白。在某些此类实施例中，所希望性状的至少一个与该感兴趣的蛋白的下降或消除相关联。在某些实施例中，确定一个种子可能生产具有所希望性状的植物可以包括、主要由以下步骤组成或由以下步骤组成:将衍生自从第一种子中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白的量与一个或多个参比值进行比较。在某些此类实施例中，这个或这些参比值可以与其相关联或获得自:衍生自从种子(生产具有所希望性状的植物)中去除的胚乳的一部分的样品，衍生自从种子(生产缺乏所希望性状的植物)中去除的胚乳的一部分的样品，在这些衍生自从种子(生产具有所希望性状的植物)中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白的平均量和/或在这些衍生自从种子(生产缺乏所希望性状的植物)中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白的平均量。在某些实施例中，提供了用于识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的系统。此类系统可以包括、主要由以下项组成或由以下项组成:I)用于从种子中去除胚乳的一部分的装置；以及2)用于使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳部分的样品中的一种感兴趣的蛋白的装置。在下文给出的附图
和说明书中详细解释了本发明的上述以及其他目的和方面。详细描述本发明提供了识别并生产植物的方法，该植物来自针对一个感兴趣的等位基因纯合的种子。还提供了用于识别针对一个感兴趣的等位基因纯合的种子的系统。还提供了识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的方法。和依赖遗传测试以建立种子是否包含一个感兴趣的等位基因和/或种子针对一个感兴趣的等位基因纯合还是杂合的常规种子切片技术不同，本发明的方法/系统允许本领域的普通技术人员使用质谱分析法在单个样品中同时确定一对或多对感兴趣的等位基因的基因型状态。此外，本发明的方法/系统允许本领域的普通技术人员使用质谱分析法从单个样品中确定一对或多对感兴趣的等位基因事实上在该种子中是否表达和/或一种或多种感兴趣的蛋白是否作为特定的构象异构体存在。本发明的方法可以使用自动化、高通量的系统实施，该系统允许本领域普通技术人员以比以前的技术更有效且有成本效益的方式处理大容量的种子。参见例如美国专利号
7,591, 101 (描述一种自动化的种子米样器)。本发明的方法/系统可以与传统的育种计划、标记辅助选择计划和/或植物转化计划结合使用。值得注意地是，本发明的方法/系统可以用于同时监控并识别多个重组事件和/或转化事件。
定义虽然认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，给出以下定义是为了使本披露的主题容易理解。除非另有定义，在此所使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在此采用的技术的参考文献旨在参照本领域中通常理解的技术，包括对本领域的普通技术人员而言很明显的那些技术的变化或等效技术的替换。在此提及的所有专利、专利公开以及非专利公开以其全文通过引用而结合。如在此使用的，术语“一种/ 一个(a或an)”或“该”(the)可以表示一个或多于一个。例如，“一个”标记可以意味着一个标记或多个标记。同样地，“一个”感兴趣的等位基因可以意味着多个感兴趣的等位基因的Iv感兴趣的等位基因。如在此使用的，术语“和/或”是指并包括一个或多个相关地列出的项的任何的与所有的可能组合，并且当用可替代地(“或”)解释时组合的缺少。如在此使用的，当提及可测量的值如质量、剂量、时间、温度以及类似物的量时，术语“约”旨在包含特定量的20%、10%、5%、1%、0.5%或者甚至0.1%的变化。如在此使用的，术语“等位基因”是指在一个特定的基因座处发生的两个或更多个不同的核苷酸或核苷酸序列之一。如在此使用的，术语“回交”以及“进行回交”是指由此子代植物反复地向后和它的亲本之一杂交的方法。在回交方案中，“供体”亲本是指具有所希望的、要被渗入的基因或基因座或等位基因的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指该基因或基因座或等位基因向其中渗入的亲本植物。例如，参见瑞格特等人，标记辅助的回交:一个实际的例子，《技术和分子标记利用专题讨论会》(Ragot, M.et al.Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example, in Techniques etUtilisations des Marqueurs Moleculaiees Les COLLOquesj Vol.72，pp.45-56 (1995));以及奥於肖等人，回交育种中的标记辅助的选择，《“分子标记数据的分析”专题讨论会纪要》(Openshawet al., Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, in Proceedings of theSymposium Analysis ofMoleculae Marker Dataj ”pp.41-43(1994))。初次杂交产生了 Fl世代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，以此类推。如在此使用的，术语“杂交”或“杂交的”是指配子通过授粉从而产生子代(例如细胞、种子或植物)的融合。术语包括有性杂交(一个植物由另一个授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠是来自相同的植物时)两者。术语“进行杂交”是指通过授粉从而产生子代的配子融合行为。如在此使用的，术语“栽培品种”以及“品种”是指一组相似的植物，这些植物在结构和/或遗传特征和/或表型性状和/或性能上可以与在同一种类中的其他品种区分出来。如在此使用的，可互换使用的术语“所希望的等位基因”以及“感兴趣的等位基因”是指与所希望的性状相关联的等位基因。一个“感兴趣的等位基因”和/或“所希望的等位基因”可以与给定性状的增加或减少以及给定性状的存在或不存在相关联，取决于所希望的表型的性质。如在此使用的，可互换使用的术语“所希望的性状”以及“感兴趣的性状”是指给定性状的增加或减少，以及给定性状的存在或不存在，取决于所希望的表型的性质。在某些实施例中，所希望的性状可以与感兴趣的蛋白的存在或不存在相关联。在某些实施例中，所希望的性状可以与感兴趣的蛋白产物的提高或减少相关联。如在此使用的，术语“良种”以及“良种品系”是指任何实质上纯合的、并且针对所希望的农艺性状的从育种和选择所得到的品系。如在此使用的，术语“片段化的肽”是指当使用一种技术如电子转移解离(ETD)、电子俘获解离(E⑶)、碰撞诱导解离(CID)或红外多光子解离(IRMPD)使感兴趣的蛋白经受碎裂时产生的肽。如在此使用的，术语“基因型”是指一个个体(或个体组)在一个或多个基因座处的遗传组成，与可观察到的和/或可检出的和/或显示的性状(表型)相对。基因型由一个或多个个体已经从它的亲本遗传的、已知基因座的这个或这些等位基因定义。可以使用术语基因型指一个个体在单个基因座处、在多个基因座处的遗传组成，或者更通常地，可以使用术语基因型指一个个体针对它的基因组中所有基因座的遗传组成。基因型可以例如使用标记而被间接表征和/或通过核酸序列而被直接表征。如在此使用的，术语“种质”是指一个个体(例如一个植物)的或来自一个个体、一组个体(例如，一个植物品系、种类、品种或家族)的遗传物质、或来自一个品系、品种、种类或培养物的克隆。种质可以是一个生物体或细胞的一部分，或可以从该生物体或细胞中分离。通常，种质提供了具有特定的分子结构的遗传物质，该分子结构提供了对于一个生物体或细胞培养物的一些或所有遗传品质的物理基础。如在此使用的，种质包括新植物可以从其生长的细胞、种子或组织以及可以被培养成整个植物的植物部位如叶、茎、花粉、或细胞。“单倍型”是一个个体在多个基因座处的基因型，S卩，等位基因的组合。典型地，用单倍型描述的基因座是物理上以及遗传上相连的，即，在相同染色体片段上。术语“单倍型”可以指在特定基因座如一个单标记基因座处的多态性，或在沿着一条染色体片段的多个基因座处的多态性。“杂优类群”包括当与来自不同杂优类群的基因型杂交时表现良好的一组基因型。霍尔奥尔等人，玉米育种，《玉米和玉米改进》(Hallauer et al., Corn breeding, in Cornand Corn Improvement p.463-564(1998))。基于几个标准如系谱、基于分子标记的联合以及杂种组合的性能，近交系被分为杂优类群，并且被进一步细分为杂优类群内的家族。斯密斯等人，《理论与应用遗传学》(Smith et al.，Theor.Appl.Gen.80:833 (1990))。如在此使用的，术语“杂合的”是指其中不同的等位基因位于同源染色体上相应的基因座上的遗传状况。如在此使用的，术语“纯合的”是指其中相同的等位基因位于同源染色体上相应的基因座上的遗传状况。如在此使用的，术语“杂种”是指当至少两个遗传上不同的亲本杂交时产生的种子和/或植物。如在此使用的，术语“近交”是指实质上纯合的植物或品种。该术语可以是指遍及它们的整个基因组实质上是纯合的或者相对于该基因组的一部分实质上是纯合的植物或品种。如在此使用的，术语“离子化的肽”是指当使用一种技术如电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、快原子轰击(FAB)或大气压化学电离(APCI)使属于感兴趣的蛋白的肽经受电离时产生的肽。如果种子有超过50%的可能将产生具有所希望的性状的植物，那么该植物“可能产生具有所希望的性状的植物”。在某些实施例中，该种子有大约99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%或55%的可能将产生具有所希望的性状的植物。一个“基因座”是一个染色体上的位置，其中一个基因或标记或等位基因在这里定位。在某些实施例中，一个基因座可能包括一个或多个核苷酸。如在此使用的，术语“玉蜀黍(maize)”是指玉蜀黍属(Zea mays L.ssp.)的一种植物，并且还被称为“玉米”(corn)。如在此使用的，术语“玉蜀黍植物”包括整个玉蜀黍植物、玉蜀黍植物细胞、玉蜀黍植物原生体、玉蜀黍植物可以由之再生的玉蜀黍植物细胞或玉蜀黍组织培养物、玉蜀黍植物愈伤组织以及在玉蜀黍植物或玉蜀黍植物的部分中完整的玉蜀黍植物细胞，这些玉蜀黍植物的部分是如玉蜀黍种子、玉蜀黍穗、玉蜀黍花、玉蜀黍子叶、玉蜀黍叶、玉蜀黍莖、玉蜀黍芽、玉蜀黍根、玉蜀黍根尖以及类似物。如在此使用的，术语“感兴趣的肽”是指属于感兴趣的蛋白的一种肽。在某些情况中，“感兴趣的肽”包括或者是“蛋白水解的肽”、一种“离子化的肽”或“片段化的肽”。如在此使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指一种生物体的一种或多种性状。该表型可以是裸眼的或通过本领域中已知的任何其他评价方法(例如显微术、生物化学分析法或一种电机的测定)可观察到。在一些情况下，表型是由一个单个的基因或基因座来直接控制的，即一种“单基因性状”。在其他情况下，表型是多个基因的结果。应指出，如在此使用的，术语“水优化表型”考虑到可能影响水优化的环境条件，以使得水优化效果是真实且可再现的。如在此使用的，术语“植物”可以指整个植物、其任何部分或衍生自植物的细胞或组织。因此，术语“植物”可以指以下的任何:整个植物、植物成分或器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子和/或植物细胞。植物细胞是植物的细胞，取自植物，或者通过从取自植物的细胞培养获得。如在此使用的，术语“种群”是指共享一个共同的遗传来源的植物的遗传异质性集
口 ο如在此使用的，术语“子代”以及“子代植物”是指由一株或多株亲本植物的植物性或有性生殖产生的植物或种质。子代植物可以通过一个单个亲本植物的克隆或自花授粉，或者通过两个亲本植物的杂交获得。如在此使用的，术语“感兴趣的蛋白”是指由感兴趣的等位基因或由包含该感兴趣的等位基因的核苷酸序列编码的一种蛋白。如在此使用的，术语“蛋白水解的肽”是指当感兴趣的蛋白酶消化时产生的一种肽。如在此使用的，术语“参比值”是指衍生自一个或多个样品中的感兴趣的蛋白的量的值，这个或这些样品衍生自一个参比种子或多个参比种子。在某些实施例中，关于编码该感兴趣的蛋白的感兴趣的等位基因的这个或这些参比种子的配型是已知的。在某些实施例中，已知是否这个或这些种子生产了或将要生产具有所希望的性状的一个或多个植物。例如，一个参比值可以衍生自一个样品中的感兴趣的蛋白的量的值，这个样品衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分，已知该参比种子针对一个感兴趣的等位基因是纯合的和/或已知该参比种子生产了或产生一个具有所希望的性状的植物。类似地，一个参比值可以衍生自多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量的值，这些样品衍生自从多个参比种子中去除的胚乳部分，已知这些参比种子针对一个感兴趣的等位基因是纯合的和/或已知这些参比种子生产了或产生多个具有所希望的性状的植物。如在此使用的，可互换使用的术语“样品”以及“衍生自胚乳的[一个/该]部分的样品”是指一个衍生自从一个种子中去除的胚乳的一部分的样本。该样本可以由从该种子中去除的胚乳部分的任何部分组成，或者可以包括从该种子中去除的胚乳部分的全部。该样本可以处于其天然的形式，或它可能已经在用于分析、测试或调查的制品中进行了物理地/化学地处理。“硬杆(Stiff Stalk)”杂优类群代表了在美国北部以及加拿大玉米种植区的主要杂优类群。还可以将其称作“爱荷华州硬杆合成的(1wa Stiff Stalk Synthetic)”或“ BSSS ”杂优类群。如在此使用的，术语“转基因”是指包含一条核苷酸序列(例如，编码蛋白和/或其他功能基因产物的核苷酸序列)的核酸分子，该核酸分子作为异源的或外源的核苷酸序列被弓I入一个细胞中。在某些实施例中，该转基因可以是包含来自一个生物体的一条核苷酸序列的核酸分子，该核酸分子被引入另一个和/或不同生物体的细胞中。该核酸分子可以在该生物体的细胞中瞬时表达和/或被稳定地整合入该生物体细胞的基因组中。在某些实施例中，来自一个植物的一个基因或编码序列可以作为一个转基因被引入另一个植物的基因组中。如在此使用的，术语“转化”、“进行转化”或“转化的”是指将一个或多个外源的或异源的核酸分子(例如，一个转基因或编码序列)引入一个细胞中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。“瞬时转化”在多核苷酸的背景下意为被引入细胞中并且不整合到该细胞的基因组中的多核苷酸。如在此使用的，“稳定的转化”或“稳定地转化的”意为一种被引入细胞中并且整合到该细胞的基因组中的核酸。这样，该整合的核酸能够被其子代遗传，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。如在此使用的，“基因组”还包括核基因组以及质粒基因组，并且因此包括该核酸分子整合进入的，例如叶绿体基因组。如在此使用的，稳定转化还可以指一种例如作为微型染色体在染色体外保持的转基因。将一个外源的或异源的核酸序列引入一个植物中的方法是已熟知的并且包括用根瘤土壤杆菌直接感染或共培养植物细胞(豪斯彻等人，《科学》(Horsch etal.Science227:1229(1985)))以及使用涂覆有包含转基因的核酸的金颗粒的微弹轰击法。一种“所不希望的等位基因”是与所不希望的性状相关联的一个等位基因。包含所不希望的等位基因的种子和/或植物可以从育种计划或种植中识别出并去除。种子切片本发明提供了一种用于从种子中去除胚乳的一部分的方法。该胚乳部分可以通过任何本领域中已知的、现有的或未来的方法去除，包括但不限于，用锐刀片去除胚乳的一部分、在种子中钻一个小洞并收集所得的粉末并且用激光切割该种子。参见例如美国专利号7，591，101 ;戴等人，《植物科学动态》(Day et al.Trends Plant Sc1.10:397 (2005));纳尔逊等人，《植物生物学年鉴》(Nelson et al.Ann.Rev.Plant.Biol.57:181 (2006) ) 在某些实施例中，以保护种子活力的方式从该种子中去除该胚乳部分。在某些此类实施例中，去除该胚乳部分之后，活力可以保持至少大约六个月。在某些此类实施例中，去除该胚乳部分之后，用保护物质对该种子进行处理。该保护物质可以包括本领域中已知的、用于保护种子不受环境条件伤害的任何物质，包括但不限于聚合物以及杀真菌剂。质谱分析法本发明提供了使用质谱分析法以识别和/或定量样品中的感兴趣的蛋白的方法，该样品衍生自从种子中去除的胚乳的一部分。一般而言，基于在进行质谱分析法之前如何制备样品，可以将此类方法分为两个不同的类。使用蛋白水解的消化作用的方法通常包括:从该样品中提取一种或多种蛋白，消化提取的这个或这些蛋白，电离所得的肽，根据它们的质/荷比(m/z)分选离子化的肽，检测这些离子化的肽并且基于与一种或多种属于感兴趣的蛋白的蛋白水解肽相关联的一个或多个峰的相对强度对该蛋白进行定量。任选地，在消化之前，可以将该感兴趣的蛋白与该样品中存在的其他蛋白的某些部分分开。相比之下，“由顶向下”的方法不要求在质谱分析之前对该感兴趣的蛋白进行蛋白水解的消化作用。此类“由顶向下”的方法因此允许对完整的感兴趣的蛋白进行分析。本领域中已知的质谱分析的任何现有的或未来的方法都可以在本发明的方法/系统中使用，包括但不限于，分析物分离技术如液相色谱法(LC)以及高效液相色谱法(HPLC);电离技术如电喷雾电离(ESI)、电喷雾解吸电离(DESI)、实时直接分析电离(DART)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)以及大气压化学电离(APCI);碎裂技术如电子转移解离(ETD)、电子俘获解离(E⑶)、碰撞诱导解离(CID)以及红外多光子解离(IRMPD);以及分析仪如 飞行时间分析仪(T0F)、四相质谱仪、三相四极质谱仪、死离子阱、傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-1CR)以及轨道阱。可以在例如以下文献中发现示例性的科学试验计划:波瑞曼等人，《质谱快讯》(Bereman et al.Rapid Comm.MassSpectrom.20:3409 (2006));克瑞斯托尼等人，《质谱快讯》(Cristoni et al.Rapid Comm.Mass Spectrom.16:1686 (2002));韩等人，《科学》(Han et al.Science314:109 (2006))；库柏特等人，《农业与食品化学杂志》(Kubec et al.J.Ag.Food Chem.58:1121 (2010))；莱曼等人，《植物学杂志》(Lehmann et al.Plant J.55:1039 (2008));里特等人，《化学年报》(Little et al.Anal.Chem.66:2809 (1994));洛佩斯等人，《色谱分析杂志》(Lopezet al.J.Chromatographyl216:7222 (2009));迈克士等人，《生物化学与生物物理学文献》(Mikesh et al.Biochim.Biophys.Actal764:1811 (2006))；沙夫等人，《色谱分析杂志》(Schaff et al.J.Chromatography886:89 (2007));谢尔曼等人，《蛋白质组学》(Sheoranet al.Proteomics5:3752 (2005))以及维库柏等人，《实验生物学杂志》(Wienkoop etal.J.Exp.Biol.59:3307(2008))。蛋白提取可以从一个样品中通过本领域中已知的、任何现有的或未来的方法提取蛋白(或其片段)，这些方法包括但不限于由谢尔曼等人，《植物科学》(Sheoran et al.(PlantSciencel76:99 (2009))中描述的这些方法。以下是可以用来实行本发明的方法的提取流程的实例:1.TCA-丙酮提取将种子切片在液氮中研磨为细粉，并且用包含10% (w/v)三氯乙酸以及1% (w/v)DTT的丙酮进行提取。将提取的样品在-20° C储存过夜并且然后在4° C以25，000xg离心20min。将所得的颗粒在-20° C用丙酮(包含1% (w/v) DTT)中的悬浮液洗涤I小时。I1.苯酚提取将种子切片在液氮中研磨为细粉，并且通过在Iml苯酚(Tris pH8.8缓冲的)以及Iml提取缓冲液(0.1M Tris-HCl pH8.8、5mM EDTA、20mMDTT、30%蔗糖)中进一步研磨该粉末进行提取。将提取的样品在4° C以25，OOOx g离心IOmin之前，在4° C涡旋30min。在4° C以25，OOOx g离心20min之前，通过在-20° C添加5倍体积的、100%甲醇中的0.1M乙酸铵，在-20° C涡旋并孵化过夜，将来自苯酚层(上层)的蛋白沉淀出。将所得的颗粒用100%甲醇中的0.1M乙酸铵洗涤两次，用80%丙酮洗涤两次并且用80%丙酮(包含IOmM DTT)洗涤一次。II1.SDS 提取将种子切片研磨为细粉，并且在225mM Tris pH6.9,50%甘油、5%SDS以及250mMDTT中进行提取。将提取的样品在95° C孵化5min，然后在室温以2，OOOx g离心15min。收集所得的上清液。IV.Tris-HCl 提取将种子切片在液氮中研磨为细粉，并且与包含50mM Tris-HCl pH8.8的Tris-HCl缓冲液、5mM EDTA、20mM DTTUOOmM KCl以及2mM甲苯磺酰氟(PMSF)混合。融化之后，将该混合物研磨额外的30min。V.Tris-HCl提取以及沉淀将种子切片在液氮中研磨为细粉，并且与包含50mM Tris-HCl pH8.8的Tris-HCl缓冲液、5mM EDTA、20mM DTTUOOmM KCl以及2mM甲苯磺酰氟(PMSF)混合。融化之后，在4° C以25，OOOx g离心20min之前,将该混合物在4° C研磨额外的30min。离心之前,通过添加5倍体积的100%丙酮，在-20° C涡旋并孵化2小时，将来自上清液的蛋白沉淀出。将所得的颗粒用80%丙酮洗涤两次。V1.DESI “提取”将一种带电荷的溶剂以一个角度电喷雾到样品的表面上，致使离子化的蛋白或肽从该样品表面释放出。在某些实施例中，用带电荷的溶剂喷雾之前，该样品的表面被喷雾有蛋白酶溶液(例如，包含胰蛋白酶的溶液)。正如本领域普通技术人员将理解的，该带电荷的溶剂的组合物可以变化，取决于感兴趣的一种或多种目标蛋白。例如，该溶剂可能包含甲醇-水(1:1包含1%乙酸)或乙腈-水(1:1包含0.1%甲酸)。蛋白分离提取的蛋白可以通过本领域中已知的、任何现有的或未来的方法进行分离，这些方法包括但不限于由谢尔曼等人，《蛋白质组学》(Sheoran etal.Proteomics5:3752 (2005))中描述的这些方法。以下是可以用来实行本发明的方法的分离流程的实例:
1.一维(1-D)电泳将包含提取的蛋白的样品与等体积的SDS还原缓冲液(2%SDS、25%甘油、0.5%β -巯基乙醇以及0.625mM Tris-HCl pH6.8)混合并且根据本领域普通技术人员已知的方法通过SDS-PAGE进行分离。参见，例如，雷米，《自然》(Laemmli, Nature227:680(1970))。将该凝胶进行染色并分析。可以使用任何已知的方法对该凝胶进行染色，这些方法包括但不限于，考马斯亮蓝(CBB)染色、银染色和/或SYPRO 红宝石色染色(伯乐实验室公司，加利福尼亚州，赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA))。例如，可以在4° C将该凝胶用在5:1:4甲醇:乙酸:水溶液里的0.25%CBB染色过夜并且在4° C用2:1:7甲醇:乙酸:水溶液脱色。可替代地，可以将该凝胶在室温用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液里的0.1%CBB染色并且用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液脱色I小时。可以根据任何已知的方法进行银染色，该方法包括但不限于，由莫茨等人，《蛋白质组学》(Mortz etal.Proteomicsl:1359 (2001))中描述的方法。将该凝胶固定在1: 0.7:8.3甲醇:乙酸:水溶液中之后，可以进行SYPRO 红宝石色染色过夜。可以使用任何已知的方法/装置来分析这些凝胶，该方法/装置包括但不限于，视觉上检查该凝胶以确定与感兴趣的蛋白相对应的点/带是否存在于该凝胶中。I1.二维(2-D)电泳在22。C，使用再水合溶液(8M脲、2%CHAPS、20mM DTT、2%固定的pH梯度缓冲液(PH3-10)以及0.002%溴酚蓝)，将包含提取的蛋白的样品载荷到具有4-7或3_10的线性pH梯度的ImmobiIine DryStrip (安玛西亚生物科学公司，瑞典，乌普萨拉(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden))上持续 16 小时。使用 Multiphor II 水平电泳系统(GE医疗保健生命科学公司，新泽西州，皮斯卡塔韦(GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ))进行第一维等电聚焦,应用250V持续I小时,经2小时渐升至3，500V,并且保持在3，500V直到总数达到75kVh。使用Protean II XI mult1-cell (伯乐实验室公司，加利福尼亚州,赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA))进行第二维等电聚焦。将该条带在平衡缓冲液(6M 脲、30% 甘油、2%SDS、50mM Tris-HCl pH8.8,0.01% 溴酚蓝以及 IOmM DTT)中平衡15min,随后在包含2%碘乙酰胺的平衡缓冲液平衡额外的15min。平衡之后，将该条带应用于垂直SDS聚丙烯酰胺凝胶(12%溶解并且5%堆积)上并且用在包含溴酚蓝的SDS缓冲液中的0.5%低熔点的琼脂糖密封。在10° C，将电泳在电泳缓冲液pH8.3 (25mM Tris碱、192mM甘氨酸以及0.1%SDS)中，在25mA持续30min并且在40mA持续3.5小时。将该凝胶进行染色并分析。可以使用任何已知的方法对该凝胶进行染色，该方法包括但不限于，考马斯亮蓝(CBB)染色、银染色和/或SYPRO 红宝石色染色(伯乐实验室公司，加利福尼亚州，赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA))。例如，可以在4° C将该凝胶用在5:1:4甲醇:乙酸:水溶液里的0.25%CBB过夜染色并且4° C用2:1:7甲醇:乙酸:水溶液脱色。可替代地，可以将该凝胶在室温用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液里的0.1%CBB染色并且用4:1:5甲醇:乙酸:水溶液脱色I小时。可以根据任何已知的方法进行银染色，该方法包括但不限于，由莫茨等人，《蛋白质组学》(Mortz etal.Proteomicsl:1359 (2001))中描述的方法。将该凝胶固定在1: 0.7:8.3甲醇:乙酸:水溶液中之后，可以进行SYPRO 红宝石色染色过夜。可以使用任何已知的方法/装置来分析这些凝胶，该方法/装置包括但不限于，PhoretixTM2D(非线性动力学公司，英国，泰恩河畔纽卡斯尔(Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle upon Tyne, UK)),Progenesis SameSpots(非线性动力学公司，英国，泰恩河畔纽卡斯尔(Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastleupon Tyne, UK))或者TOQuest (伯乐实验室公司，加利福尼亚州，赫拉克勒斯(Bio-RadLaboratories, Inc., Hercules, CA))图像分析软件。蛋白消化提取的和/或分离的蛋白可以通过本领域中已知的、任何现有的或未来的方法进行消化，该方法包括但不限于，由谢尔曼等人，《蛋白质组学》(Sheoran etal.Proteomics5:3752 (2005))中描述的这些方法。以下是可以用来进行本发明的方法的消化流程的实例:1.凝胶内消化从染色的凝胶上切离对应于感兴趣的蛋白的点/带，脱色、用DTT还原、烷基化并且用蛋白酶如胰蛋白酶进行消化。可以使用本领域中已知的任何装置或系统切离该点/带，这些装置或系统包括但不限于，手持刀片，X-Acto 刀(埃尔默氏产品公司，俄亥俄州，哥伦布(Elmer，s Products, Inc., Columbus, OH))以及 Proteomefforks 2-D 点切割器(伯乐实验室公司，加利福尼亚州，赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA))。可以将该点/带(以及其中包含的这种或这些蛋白)脱色、还原、烷基化并且使用自动的MassPREP消化操作台(微质谱公司，英国，曼彻斯特(Micromass, Manchester, UK))进行消化。I1.溶液内消化在基于凝胶的分离科学试验计划不存在下，将提取的蛋白用一种酶进行消化。可以使用胰蛋白酶溶液对提取的蛋白进行消化。II1.DESI “消化”将一种带电荷的溶剂以一个角度电喷雾到样品的表面上，从而致使离子化的肽从该样品表面释放出。在某些实施例中，用带电荷的溶剂喷雾之前，该样品的表面被喷雾有蛋白酶溶液(例如，包含胰蛋白酶的溶液)。正如本领域普通技术人员将理解的，该带电荷的溶剂的组合物可以变化，取决于感兴趣的一种或多种目标蛋白。例如，该溶剂可能包含甲醇-水(1:1包含1%乙酸)或乙腈-水(1:1包含0.1%甲酸)。蛋白定量可以使用本领域中已知的、任何现有的或未来的方法进行蛋白定量，该方法包括但不限于，由沙夫等人，《色谱分析杂志》(Schaff et al.J.Chromatography886:89 (2007));维库柏等人，《实验生物学杂志》(ffienkoop et al.J.Exp.Biol.59:3307 (2008))以及组斯克，《实验生物学杂志》(Zieske J.Exp.Botany57:1501 (2006))中描述的方法。以下是可以用来实行本发明的方法的定量流程的实例:1.与同位素标记的肽标准品比较通过将与感兴趣的肽相关联的峰和与同位素标记的肽标准品相关联的峰的相对强度进行比较，以定量感兴趣的蛋白。稳定的同位素标记的肽标准品是合成的，所述标准品与感兴趣的肽是化学上相同的。可以使用本领域中已知的任何方法识别感兴趣的肽，该方法包括但不限于，由凯斯切等人，《分析化学和生物分析化学》(Kirsch et al.Anal.Bioanal.Chem.395 (11):57 (2009))以及麦克等人，《蛋白质组学临床应用》(McKay etal.Proteomics Clin.Appl.1:1570 (2007))中描述的方法。该同位素标记的肽标准品可以使用本领域中已知的任何方法合成，该方法包括但不限于，由戈伯等人，《美国科学院院刊》(Gerber et a 1.PNAS USAlOO: 6940 (2003))中描述的AQUA方法。其他适合的方法由赛伦与派克，《细胞》(Thelen and Peck Celll9:3339 (2007))所描述。在消化和/或离子化之前，将该同位素标记的肽标准品引入已知量的样品中。使用质谱分析检测感兴趣的肽以及该同位素标记的肽标准品。参见，例如，莱曼等人，《植物学杂志》(Lehmann et al.PlantJ.55:1039(2008))安德森与亨特，《分子和细胞蛋白质组学》(Anderson and Hunter, Mo 1.Cell.Proteomics5:573 (2006))。I1.与非肽标准品比较通过将与感兴趣的肽相关联的峰和与已知标准品(例如，皮质醇)相关联的峰的相对强度进行比较，以定量感兴趣的蛋白。可以使用本领域中已知的任何方法识别感兴趣的肽，该方法包括但不限于，由凯斯切等人，《分析化学和生物分析化学》(Kirsch et al.Anal.Bioanal.Chem.395 (11):57 (2009))以及麦克等人，《蛋白质组学临床应用》(McKay etal.Proteomics Clin.Appl.1:1570 (2007))中描述的方法。在消化/离子化/破碎之前或其过程中，将标准品如皮质醇引入已知量的样品中。II1.使用化学的肽标记定量通过将与化学标记的感兴趣的肽(衍生自第一种子的样品中)相关联的一个峰和与化学标记的感兴趣的肽(衍生自一个或多个其他种子的一个或多个样品中)相关联的一个或多个峰的相对强度进行比较，以定量感兴趣的蛋白，其中，在衍生自该一个或多个其他种子的这个或这些样品中的感兴趣的肽与该第一种子样品中的感兴趣的肽是化学上相同的。将每一个样品中的这些感兴趣的肽用不同的化学标记进行标记(即，在衍生自该第一种子的样品中的感兴趣的肽具有一个与衍生自该一个或多个其他种子的该一个或多个样品中的感兴趣的肽不同的标签)并且将这些样品混合并且使用质谱分析一起进行分析。可以使用本领域中已知的任何方法化学标记这些感兴趣的肽，该方法包括但不限于，由组斯克，《实验生物学杂志》(Zieske J.Exp.Botany57:1501 (2006))中描述的方法。例如，这些感兴趣的肽可以使用针对相对和绝对定量的等压标签(iTRAQ)、串联质量标签(TMT)或同位素亲和标签(iCAT)进行化学标记。IV.无标记定量通过将与衍生自第一种子的样品中的感兴趣的肽相关联的一个峰和与衍生自一个或多个其他种子(例如，第二种子、第三种子、第四种子等等)的多个样品中的感兴趣的肽相关联的多个峰的相对强度进行比较，以定量感兴趣的蛋白。将每一个样品中的这些感兴趣的肽在不存在任何标准品或内标准下进行比较。在某些实施例中，使用选择性离子监控(SM)、选择性反应监控(SRM)或多个反应监控(MRM)分析该感兴趣的肽。SSM相对于感兴趣的等位基因，种子的配型可以通过分析衍生自胚乳(已经从该种子中去除)的一部分的样品中的感兴趣的蛋白的量进行确定。在某些实施例中，将衍生自该胚乳的部分的样品中的感兴趣的蛋白量与一个或多个参比值进行比较。这个或这些参比值可能与下列有关联:1.衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量，该参比种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的；2.衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量，该参比种子针对该感兴趣的等位基因是杂合的；3.衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量，该参比种子不包含该感兴趣的等位基因；4.衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量，该参比种子不包含该感兴趣的功能等位基因；5.衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量，这些参比种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的；6.衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量，这些参比种子针对该感兴趣的等位基因是杂合的；7.衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量，这些参比种子不包含该感兴趣的等位基因；和/或8.衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量，这些参比种子不包含该感兴趣的功能等位基因。在某些实施例中，将衍生自该种子(第一种子)胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的量与衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量和/或衍生自已经从一个第三种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量进行比较。在某些此类实施例中，这三种种子是相同亲本的子代。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因是纯合的，条件是衍生自已经从该种子(一个第一种子)中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量是:1.实质上与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值相等，该参比种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的；2.实质上与衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值相等，这些参比种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的；3.至少是与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值的大约两倍，该参比种子针对该感兴趣的等位基因是杂合的；4.至少是与衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值的大约两倍，这些参比种子针对该感兴趣的等位基因是杂合的；或者5.至少是衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量的大约两倍。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因是杂合的，条件是衍生自已经从该种子(一个第一种子)中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量是:1.与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值的大约一半，该参比种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的；2.与衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值的大约一半，这些参比种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的；3.实质上与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值相等，该参比种子针对该感兴趣的等位基因是杂合的；4.实质上与衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值相等，这些参比种子针对该感兴趣的等位基因是杂合的；或者5.衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量的大约一半。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因是纯合的，条件是衍生自已经从该种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量是:1.实质上与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值相等，该参比种子不包含该感兴趣的等位基因；2.实质上与衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值相等，这些参比种子不包含该感兴趣的等位基因；3.实质上与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值相等，该参比种子不包含该感兴趣的等位基因的功能形；或者4.实质上与衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值相等，这些参比种子不包含该感兴趣的等位基因的功能形。在某些此类实施例中，与该感兴趣的等位基因相关联的所希望性状的至少一个是该感兴趣的蛋白或者感兴趣的蛋白的可检出量的下降或消除。在某些实施例中，可以确定一个种子针对感兴趣的等位基因是纯合的是因为衍生自已经从该种子中去除的胚乳的一部分的一个样品包含可检出量的感兴趣的蛋白。在此类实施例中，与该感兴趣的等位基因相关联的所希望性状的至少一个是该感兴趣的蛋白或者可检出量的感兴趣的蛋白的存在。在某些此类实施例中，只有该种子针对该感兴趣的等位基因纯合，才产生该感兴趣的蛋白。在某些实施例中，确定一个种子针对感兴趣的等位基因是纯合的是因为衍生自已经从该种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中没有可检出量的感兴趣的蛋白。在此类实施例中，与该感兴趣的等位基因相关联的所希望性状的至少一个是该感兴趣的蛋白或者可检出量的感兴趣的蛋白的不存在。在某些此类实施例中，除非该种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的，该感兴趣的蛋白以可检出的量存在。预测具有所希望的性状一个种子是否可能生产具有所希望的性状的植物可以通过分析衍生自胚乳(已经从该种子中去除)的一部分的样品中的感兴趣的蛋白的量进行确定。在某些实施例中，将感兴趣的蛋白量与一个或多个参比值进行比较。这个或这些参比值可能与下列有关联:1.衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量，该参比种子生产具有所希望的性状的植物；2.衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量，该参比种子生产缺乏所希望的性状的植物；3.衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量，这些参比种子生产具有所希望的性状的植物；和/或4.衍生自从多个参比种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量，这些参比种子生产缺乏所希望的性状的植物。在某些此类实施例中，将衍生自从该种子(一个第一种子)的胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的量与衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的量进行比较。在某些此类实施例中，这两种种子是相同亲本的子代。在某些实施例中，可以确定一个种子可能生产具有所希望的性状(与感兴趣的蛋白的提高的产物相关联)的植物，条件是衍生自已经从该种子(一个第一种子)中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白的量是:1.实质上与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值相等，该参比种子生产具有所希望的性状的植物；2.实质上与衍生自从多个种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值相等，这些种子生产具有所希望的性状的植物；3.显著大于与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值，该参比种子生产缺乏所希望的性状的植物；4.显著大于与衍生自从多个种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值，这些种子生产缺乏所希望的性状的植物；5.至少是与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值的大约两倍，该参比种子生产缺乏所希望的性状的植物；6.至少是与衍生自从多个种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值的大约两倍，这些种子生产缺乏所希望的性状的植物；7.实质上等于或大于衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量；8.至少是衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量的大约两倍；和/或9.一个非零的量。在某些实施例中，可以确定一个种子可能生产具有所希望的性状(与感兴趣的蛋白的减少的产物相关联)的植物，条件是衍生自已经从该种子(一个第一种子)中去除的胚乳的一部分的样品中的感兴趣的蛋白的量是:1.实质上与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值相等，该参比种子生产具有所希望的性状的植物；
2.实质上与衍生自从多个种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值相等，这些种子生产具有所希望的性状的植物；3.显著小于与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值，该参比种子生产缺乏所希望的性状的植物；4.显著小于与衍生自从多个种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值，这些种子生产缺乏所希望的性状的植物；5.至少是与衍生自从一个参比种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量相关联的参比值的大约一半，该参比种子生产缺乏所希望的性状的植物；6.至少是与衍生自从多个种子中去除的胚乳的多个部分的多个样品中的感兴趣的蛋白的平均量相关联的参比值的大约一半，这些种子生产缺乏所希望的性状的植物；7.实质上等于或小于衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量；8.至少是衍生自已经从一个第二种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中的感兴趣的蛋白的量的大约一半；9.可忽略不计的；和/或10.不可检出的。在某些实施例中，确定一个种子可能生产具有所希望的性状的植物是因为衍生自已经从该种子中去除的胚乳的一部分的一个样品包含可检出量的感兴趣的蛋白。在此类实施例中，所希望的性状与感兴趣的蛋白的存在相关联。在某些此类实施例中，衍生自从多个种子(可能生产具有所希望的性状的植物)中去除的胚乳的多个部分的多个样品包含可检出量的该感兴趣的蛋白。在某些实施例中，可以确定一个种子可能生产具有所希望的性状的植物是因为衍生自已经从该种子中去除的胚乳的一部分的一个样品中无可检出量的感兴趣的蛋白。在此类实施例中，所希望的性状与感兴趣的蛋白的不存在相关联。在某些此类实施例中，衍生自从多个种子(可能生产具有所希望的性状的植物)中去除的胚乳的多个部分的多个样品中从未存在可检出量的该感兴趣的蛋白。提供了以下非限制性实例，从而进一步说明本发明。实例以下实例并非旨在成为可以实施本发明的所有的不同方法、或所有的可以加至本发明的特征的详细目录。本领域的普通技术人员将理解可以不脱离本发明而进行多种变体以及对不同实施例进行增添。因此，以下说明书旨在说明本发明的一些具体的实施例，并且不是穷尽性地限定所有的排列、组合以及其变体。实例I生产针对感兴趣的等位基因纯合的植物:使用同位素标记的标准品进行定暈从多个玉蜀黍种子的每一个中去除胚乳的一部分-这些玉蜀黍种子的某些针对感兴趣的等位基因是纯合的，某些针对感兴趣的等位基因是杂合的，某些不包含感兴趣的等位基因，并且某些不包含处于功能形的感兴趣的等位基因-以使得该胚乳的部分被去除之后，这些种子仍保持活力。在衍生自胚乳的每一个部分的样品中进行蛋白提取并且将提取的蛋白用胰蛋白酶进行消化。将已知量的与蛋白水解的肽化学上相同的、同位素标记的标准品添加到这些样品的每一个中，该蛋白水解的肽与感兴趣的蛋白相关联。使用三相四重液相色谱质谱联用仪对这些样品(包括同位素标记的标准品)进行分析。通过将与它的蛋白水解的肽相关联的峰和与同位素标记的标准品相关联的峰的相对强度进行比较，以定量每一个样品中的感兴趣的蛋白(如果存在的话)。基于感兴趣的蛋白的可检出量的存在或不存在以及感兴趣的蛋白(如果可检出的话)的量，将这些样品分为三类。在第一类中的这些样品不包含可检出量的感兴趣的蛋白。在第二类中的这些样品包含感兴趣的蛋白的可检出量，该量大约X ng。在第三类中的这些样品包含感兴趣的蛋白的可检出量，该量是至少大约2X ng。第一类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为缺乏该感兴趣的等位基因或者为缺乏处于功能形的该感兴趣的等位基因。第二类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为针对该感兴趣的等位基因是杂合的。第三类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为针对该感兴趣的等位基因是纯合的。使用第三类中的这些样品自其衍生的种子生长植物。实例2生产针对感兴趣的等位基因纯合的植物:无标记定暈从多个玉蜀黍种子的每一个中去除胚乳的一部分-这些玉蜀黍种子的某些针对感兴趣的等位基因是纯合的，某些针对感兴趣的等位基因是杂合的，某些不包含感兴趣的等位基因，并且某些不包含处于功能形的感兴趣的等位基因-以使得该胚乳的部分被去除之后，这些种子仍保持活力。在衍生自胚乳的每一个部分的样品中进行蛋白提取并且将提取的蛋白用胰蛋白酶进行消化。使用电喷雾离子化质谱仪对每一个样品进行分析。针对每一个样品，记录与属于该感兴趣的蛋白的一种或多种蛋白水解的肽相关联的这个或这些峰的强度。通过将一个样品中的与属于该感兴趣的蛋白的一种或多种蛋白水解的肽相关联的这个或这些峰的强度与一个或多个其他样品中的与属于该感兴趣的蛋白的一种或多种蛋白水解的肽相关联的这个或这些峰的强度进行比较，定量每一个样品中的感兴趣的蛋白(如果存在的话)。基于感兴趣的蛋白的可检出量的存在或不存在以及感兴趣的蛋白(如果存在的话)的量，将这些样品分为三类。在第一类中的这些样品不包含感兴趣的蛋白的可检出量。第二类中的这些样品包含该感兴趣的蛋白的可检出的量，该量实质上与针对该感兴趣的等位基因杂合的种子相关联的参比值相等和/或至少是与针对该感兴趣的等位基因纯合的种子相关联的参比值的大约一半。第三类中的这些样品包含可检出的量的该感兴趣的蛋白，该量实质上与针对该感兴趣的等位基因纯合的种子相关联的参比值相等和/或至少是与针对该感兴趣的等位基因杂合的种子相关联的参比值的大约两倍。第一类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为缺乏该感兴趣的等位基因或者为缺乏处于功能形的该感兴趣的等位基因。第二类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为针对该感兴趣的等位基因是杂合的。第三类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为针对该感兴趣的等位基因是纯合的。使用第三类中的这些样品自其衍生的种子生长植物。实例3生产针对感兴趣的复等位基因纯合的植物:多个转基因事件从多个种子的每一个中去除胚乳的一部分，以使得该胚乳的部分被去除之后，这些种子仍保持活力；其中这些种子的每一个衍生自已经根据熟知的方法(例如，经由土壤杆菌素)被转化的植物，以使得其包含多个转基因，这些转基因的每一个包括一个感兴趣的等位基因。这些转基因可能已经被一起地(例如，经由单次转化，其中多个转基因是单个构建体的部分)或分别地(例如，经由多次转化，其中使用多个构建体将这些转基因引入该植物中)或以其任意组合地引入该植物中。使用质谱分析法对衍生自胚乳的每一个部分的样品、多个感兴趣的蛋白的每一个的量-它们每一个都与感兴趣的等位基因相关联-进行定量。基于每一个样品中的每一种感兴趣的蛋白的量，将这些样品分为不同类。例如，一类中的样品可能不包含任意感兴趣的蛋白的可检出量。另一类中的样品可能包含可检出量的每一种感兴趣的蛋白。又另一类中的样品中，以任意组合地，可能不包含可检出量的一种感兴趣的蛋白，但是可能包含可检出量的另一种感兴趣的蛋白。相对于每一个感兴趣的等位基因，基于与该等位基因相关联的感兴趣的蛋白的量，确定每一个种子的配型(如上所述)。使用被鉴定为针对某些或全部感兴趣的等位基因纯合的种子生长植物。实例4生产具有所希望的性状的植物:使用同位素标记的标准品进行定暈从多个玉蜀黍种子的每一个中去除胚乳的一部分-这些玉蜀黍种子的某些可能生产具有所希望的性状的植物并且某些可能生产缺乏所希望的性状的植物-以使得该胚乳的部分被去除之后，这些种子仍保持活力。所希望的性状与感兴趣的蛋白产物的提高相关联。在衍生自胚乳的每一个部分的样品中进行蛋白提取并且将提取的蛋白用胰蛋白酶进行消化。将已知量的与蛋白水解的肽化学上相同的、同位素标记的标准品添加到这些样品中，该蛋白水解的肽与感兴趣的蛋白相关联。使用三相四重液相色谱质谱联用仪对这些样品(包括同位素标记的标准品)进行分析。通过将与它的蛋白水解的肽相关联的峰和与同位素标记的标准品相关联的峰的相对强度进行比较，以定量每一个样品中的感兴趣的蛋白(如果存在的话)。基于每一个样品中的感兴趣的蛋白的量，将这些样品分为两类。第一类中的这些样品包含以下量的该感兴趣的蛋白，该量实质上与生产缺乏所希望的性状的植物的种子相关联的参比值相等和/或显著小于与生产具有所希望的性状的植物的种子相关联的参比值。第二类中的这些样品包含以下量的该感兴趣的蛋白，该量实质上与生产具有所希望的性状的植物的种子相关联的参比值相等和/或显著大于与生产缺乏所希望的性状的植物的种子相关联的参比值。第一类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为可能生产缺乏所希望的性状的植物。第二类中的这些样品自其衍生的种子被鉴定为可能生产具有所希望的性状的植物。
使用第二类中的这些样品自其衍生的种子生长植物。
权利要求
1.一种用于识别针对感兴趣的等位基因纯合的种子的方法，包括: (a)从该种子中去除胚乳的一部分； (b)使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳的部分的样品中的一种感兴趣的蛋白；并且 (C)确定该种子针对该感兴趣的等位基因是纯合的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在该胚乳的部分去除之后，该种子仍保持活力。
3.一种用于生产针对感兴趣的等位基因纯合的植物的方法，包括: (a)从一种种子中去除胚乳的一部分，以使得该胚乳的部分去除之后，该种子仍保持活力； (b)使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳的部分的样品中的一种感兴趣的蛋白； (C)确定该种子针对该感兴趣的等位基因纯合；并且 (d)从该种子生长一种植物，由此生产针对该感兴趣的等位基因纯合的植物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括将与该感兴趣的肽相关联的峰和与已知量的一种标准品相关联的峰的相对强度进行比较。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述标准品可以是一种同位素标记的、与该感兴趣的肽化学上相同的肽。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括将衍生自一个第一种子的该种子的胚乳部分的样品中的感兴趣的 蛋白的量与衍生自一个第二种子的胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的量进行比较。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括确定来自一个第一种子的该种子的胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的量是至少来自一个第二种子样品的量的大约两倍。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(c)进一步包括确定来自一个第三种子的样品不包含可检出量的该感兴趣的蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该第一种子、第二种子以及第三种子是相同亲本的子代。
10.根据权利要求8所述的方法，进一步包括确定该第二种子针对该感兴趣的等位基因是杂合的，确定该第三种子不包含该感兴趣的等位基因，和/或确定该第三种子不包含处于功能形的该感兴趣的等位基因。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(C)包括确定衍生自该种子的胚乳部分的样品包含一个可检出量的该感兴趣的蛋白。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括确定衍生自该种子的胚乳部分的样品不包含可检出量的该感兴趣的蛋白。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括将衍生自该种子的胚乳部分的样品中的该感兴趣的蛋白的量与参比值进行比较。
14.一种用于识别针对感兴趣的等位基因纯合的种子的系统，包括: (a)用于从该种子中去除胚乳的一部分的装置；以及 (b)用于使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的装置。
15.根据权利要求14所述的系统，其中在该胚乳的部分去除之后，该种子仍保持活力。
16.根据权利要求15所述的系统，进一步包括用于从该种子生长一种植物，由此生长一种针对该感兴趣的等位基因纯合的植物的装置。
17.一种用于识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的方法，包括: (a)从该种子中去除胚乳的一部分； (b)使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳的部分的样品中的一种感兴趣的蛋白；并且 (C)确定该种子可能生产具有一种所希望性状的植物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在该胚乳的部分去除之后，该种子仍保持活力。
19.一种用于生产具有所希望性状的植物的方法，包括: (a)从种子中去除胚乳的一部分，以使得该胚乳的部分去除之后，该种子仍保持活力； (b)使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳的部分的样品中的一种感兴趣的蛋白； (C)确定该种子可能生产一种具有所希望性状的植物；并且 (d)从该种子生长一种植物，由此生产一种具有所希望性状的植物。
20.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(b)包括将与该感兴趣的肽相关联的峰和与已知量的一种标准品相关联的峰的相对强度进行比较。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述标准品可以是一种同位素标记的、与感兴趣的肽化学上相同的肽。
22.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(b)包括将衍生自一个第一种子的该种子的胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的量与衍生自一个第二种子的胚乳部分的样品中的感兴趣的蛋白的量进行比较。
23.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(c)包括确定衍生自该种子的胚乳部分的样品包含一个可检出量的该感兴趣的蛋白。
24.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(c)包括确定衍生自该种子的胚乳部分的样品不包含可检出量的该感兴趣的蛋白。
25.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(c)包括将衍生自该种子的胚乳部分的样品中的该感兴趣的蛋白的量与一个参比值进行比较。
26.一种用于识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的系统，包括: (a)用于从该种子中去除胚乳的一部分的装置；以及 (b)用于使用质谱分析法来定量衍生自该胚乳部分的样品中的一种感兴趣的蛋白的装置。
27.根据权利要求26所述的系统，其中在该胚乳的部分去除之后，该种子仍保持活力。
28.根据权利要求27所述的系统，进一步包括用于从该种子生长一种植物，由此生长一种可能具有所希望性状的植物的装置。
全文摘要
本发明涉及识别针对感兴趣的等位基因纯合的种子，和/或用于识别可能生产具有所希望性状的植物的种子的方法与系统。还提供了生产针对感兴趣的等位基因纯合和/或具有所希望性状的植物的方法。
文档编号G01N30/72GK103154733SQ201180048549
公开日2013年6月12日 申请日期2011年10月3日 优先权日2010年10月4日
发明者S.S.巴苏 申请人:先正达参股股份有限公司