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专利名称：一种检测孔雀石绿的分子印迹聚合物微球的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分子印迹检测技术，具体地，涉及一种利用分子 印迹技术的快速检测水产品中孔雀石绿的方法，本发明还涉及用于该 检测方法的分子印迹聚合物微球。
背景技术：
众所周知，孔雀石绿在水产养殖中抗菌效果较好，价格低廉，目 前对其�：π缘男�传力度较弱，从而使得被不少水产养殖业户广泛使 用。基于此，我国制定了《无公害食品水产品中渔药残留限量(NY5070-2002 )》标准，其中规定水产品中不得检出孔雀石绿等危 害性物质。《2000年度中国出口动物源性食品中有毒有害物质残留监控计 划》首次将出口鳗鱼中孔雀石绿残留量的监控列入年度计划，并延续 至今。2002年5月欧盟曾向我国通报在2批浙江舟山向德国出口的鳗鱼 中检出孔雀石绿。2005年6月5日，英国食品标准局在英国一家知名 的超市连锁店出售的鲑鱼体内发现一种名为"孔雀石绿"的成分，有 关方面将此事迅速通报给欧洲国家所有的食品安全机构，发出了食品 安全警报。英国食品标准局发布消息说，任何鱼类都不允许含有孔雀 石绿，并且这种化学物质不应该出现在任何食品中。2005年7月7曰农 业部办公厅发布了《关于组织查处"孔雀石绿"等禁用兽药的紧急通 知》，要求各地尽快组织开展孔雀石绿等禁用药物的专项整治工作。 农业部渔业局马上组织调查组奔赴各地调查孔雀石绿问题，并组织专 家商讨对策。2005年以来欧盟、日本、韩国等国加大了对我国出口鳗 鱼中孔雀石绿的检验力度。日本从2005年7月1日起，开始对来自我国 的鳗鱼产品强制检测孔雀石绿。同时，香港、新加坡等地也加强了水 产品检验，检出多批大陆水产品中含有孔雀石绿残留。孔雀石绿别名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，其分子式为C23H25C1N2，分子量为364.92，属于三苯甲烷类染料，是一分子苯 甲醛与两分子二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下聚合而形 成的深绿色晶体，具有金属光泽。孔雀石绿极易溶于水，水溶液呈兰 绿色(4.0g/100ml)，也能溶于乙醇、甲醇或戌醇。孔雀石绿在细胞分 裂时，抑制细胞内的谷氨酸转变为肽类及相关产物，从而抑制细胞分 裂，达到抗菌效果(HECHTT等.JApplIchth， 1998, 14(3-4):213-221.)。孔雀石绿有强烈的致癌作用，由于其为脂溶性化合物，在鱼体内 和环境中残留时间长，且代谢缓慢，在人体残留时间长，对人体的危 害是积蓄式的(刘峰延等.中国水产，2006 (1): 58 - 59.)。有时虽然 摄入量不多，不会有很明显的中毒症状，但当体内的孔雀石绿堆积到 一定程度，就可能引发各种疾病。孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高残留性、高致癌性、 高致畸性、致突变性、高毒性等特性。研究发现孔雀石绿能导致大鼠 肝细胞空泡化，使甲状腺滤泡上皮大量凋亡，抑制雄鼠甲状腺激素的 释放；抑制血浆胆碱脂酶的作用，进而造成乙酰胆碱的蓄积有出现神 经症状的可能性(MUSASO等.JAquatSci， 1999,14:37-42.)。此外， 它还能通过溶解足够的锌(Srivastava S等.Aquat Toxicol, 2004, 66: 319-3291; SVOBODOVAZ等.Acta Vet Brno， 1997， 66(2):111-116 ),导 致水生动物急性锌中毒，引起水生生物消化道、鳃和皮肤轻度炎症， 从而影响其正常摄食和生长，还可阻碍肠道酶(如胰蛋白酶、oc-淀 粉酶)的活性，影响水生动物的消化吸收功能(SRIVASTAVAK等.Acta Hydrobiol， 1995,37(2):113-119; SRIVASTAVAS J等.J Adv Zool, 1998, 19(l):46-49 )。目前检测孔雀石绿方法包括同时检测孔雀石绿和无色孔雀石錄 残留《无公害食品水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法》(SC/T 3021—2004)标准。2005年9月5日中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会发布《水产品中孔雀石绿和结晶紫 残留量的测定》，规定将高效液相色谱和液相色谱-串联质谱作为孔雀 石绿检测的国标方法。国外还釆用气相色谱-质谱联用法、薄层色谱法和毛细管电泳法等进行孔雀石绿的检测(Tumipseed S B等.J AOAC Int， 1995，78(4):971-977; Matysik FM. 1998， 802(2): 349; Tarbin J A等.J the analyst Int, 1998,123(12): 2567-2571 )。但这些检测方法都要依赖复 杂精密仪器，对样品分离净化的步骤也相对繁瑣。分子印迹技术是为获得在空间结构和结合点位上与某一分子(通 常称为模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。其工作原理一 般分三个步骤使印迹分子与功能单体相互作用形成复合物；加交联 剂和聚合引发剂，发生聚合反应；除去聚合物中的印迹分子后即获得 分子印迹聚合物。分子印迹聚合物具有制作简单、成本低廉、功能可 设计、坚固耐用、适用范围广等优点，被誉为"万能的分子识别材料"。 其中分子印迹聚合物微球使用更方便、识别效率更高，应用前景也更 加广阔。主要应用于色谱分离、抗体和受体模拟物、固相萃取、生物 传感器敏感材料、催化作用等。孔雀石绿的分子结构属三苯甲烷类，其分子中含有三个苯环，一 个二甲基氨和一个次二甲基氨，分子结构本身具有足够的空间特征， 易与不同的功能单体形成有特异性的空间结构空穴。此外孔雀石绿的 亲水基团次二甲基氨，可与功能单体很好地作用，形成强烈的氢键， 这无论在制备印迹分子还是在吸附模板分子中都是强有力的因素。分 子中的两个疏水基团苯环和二甲基氨可互相作用，且与溶剂作用，形 成结合位点。鉴于对孔雀石绿分子式的研究和性质的考虑，釆用悬浮 聚合分子印迹法较适合制备以孔雀石绿为模板的印迹分子聚合物微 球。因为孔雀石绿是水溶性分子，而水会削弱功能单体与模板分子之 间或分子印迹聚合物微球与模板分子之间的非共价键作用，从而影响 复合物的形成或分子印迹聚合物微球的识别效果。如何在水溶性的环境中合成并识别模板分子，是一个新的挑战。所以本发明选用悬浮乳 液聚合法，利用分散剂使亲水性表面和亲脂性表面隔开，使得亲水基 团朝着同 一个方向，这样有利于孔雀石绿分子和功能单体的结合。目前国内外已经出现了 一些检测孔雀石绿的检测方法，有些已经 申请了专利，国内相关的专利有水产品中孔雀石绿间接竟争ELISA检测试剂盒(专利号申请为200510060995.1 )、孔雀石绿快速检测方法 及快速检测试剂盒(专利申请号为200710068348.4)和一种水及水产 品中孔雀石绿残留的快速检测试剂盒(专利申请号为 200620113227.8),美国有两项利用免疫学技术检测孔雀石绿的专利 (专利申请号为20070254323和20070072242 ),其检测原理均不是利 用分子印迹技术。迄今为止，我国还没有稳定可靠的快速检测水产品中孔雀石绿残 留的检测方法，所以目前迫切想找到一种新的、快速的检测方法，其 既能避免繁瑣的操作步骤和冗长的检测过程，又能做到灵敏度高，检 出限低。发明内容为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利用分子印迹技 术、操作简单，吸附、浓缩和分离效果好的快速检测孔雀石绿的方法。 该方法除可检测样品中的孔雀石绿外，还可以对其进行浓缩，降低了 检测的检出限，对低含量样品的检测尤为有效。本发明的另一个目的 在于提供一种用于该检测方法的分子印迹聚合物微球，该微球特别适 合对水产品中孔雀石绿残留的检测。本发明分子印迹聚合物微球是以孔雀石绿为模板制备获得。具体地说，通过如下步骤制备获得(1) 潜两种功能单体以一定比例混合；(2) .将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，然后依次加入交联 剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，乳化，热聚合；(3).微球洗涤、烘干，过筛。其中，所述两功能单体按物质的量比1~8: l-8混合；孔雀石绿 模板与混合单体的物质的量比为1:1~8。其中，所述交联剂优选为乙二醇二甲基丙稀酸酯，其物质的量是 总功能单体的2 10倍；引发剂偶优选为氮二异丁腈，其质量是单体 的1~8倍；乳化剂选可为十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、羟磺基甜菜碱、 谷氨酸钠或吐温80,按蒸馏水体积的1 10%;亲脂溶剂可为氯仿、 石油醚、三氯甲烷或甲醇，亲脂溶剂与水的体积比是1: 5~20;反应 体系的水油比是5 40: 1。在制备分子印迹微球的过程中，为使体系稳定，釆用超声波或分 散乳化机先对混合溶液进行乳化，为保持溶液稳定的乳化状态，对乳 化液进行搅拌，搅拌的速度为0~200rpm;搅拌时间为0 24h;引发 热聚合温度为50-7(TC。在对制备的微球进行洗涤的过程中可用超声波洗涤和索式提取 洗涤方法，洗涤液可为蒸馏水、酒精、20~80%的乙腈-乙酸胺溶液。 洗涤后利用分子筛对制备的微球进行均质筛�。琁OO目筛下，200目 筛上，得到直径为50 200^im微球。利用分子印迹微球进行水产品的检测时，按照孔雀石绿国标方法 先将样品研磨勾浆后浸泡、搅拌、过滤，将滤液通过由分子印迹微球 填满的过滤柱，再使用80~98%的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱， 利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。随 后对分子印迹微球的吸附效果进行作了评价，结果得出产量最高的单 体组等比例丙烯酰胺和甲基丙烯酸组成的功能单体对孔雀石绿再吸 附能力最强，静态分布系数达到3.96，证实了对最佳单体的选择。利用分子印迹技术快速检测水产品中孔雀石绿的技术方案，优选 为，以等比例的丙烯酰胺和甲基丙烯酸作为功能单体，混合单体与模 板分子摩尔比为8 : 1，以石油醚为溶剂，体积比为3%的吐温-80为乳化剂，加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯和引发剂偶氮丁异二腈，分散乳化机对混合溶液分散乳化3min, 65'C水洛热聚合24h，索式提 取洗脱过夜，收集100~200目筛之间的微粒，即可得到分散性好、 颗粒均匀且产量高的孔雀石绿分子印迹微球，回收率在60%以上。将样品滤液通过由微球填满的过滤柱，再使用80%的乙腈缓冲 溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液 中孔雀石绿的含量。检出限为0.63 ±0.07 jug/kg,回收率为102±1.4。本发明工艺简单易行，有良好的重现性，可反复使用，并能进行 工业化生产，成本低廉， 一般实验室均可进行，不需要复杂昂贵的设 备。检测效果基本达到GB水平，同时具有可再生、操作方法简便快 速、易于推广等优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例1孔雀石绿分子印迹聚合物微球的制备在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、8 mmol丙烯酰胺和 8mmo1甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸馏水150mL，加 入4.5mL吐温-80 (按蒸馏水体积的3 %添加)，加热使完全溶解， 冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙 稀酸酯(40mmo1, 7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200mg)。超声 脱气5min，分散乳化机乳化3min, 65。C水洛聚合24h。所得聚合物 用蒸馏水洗涤至澄清后，以80%的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行 索氏提取。最后在固相萃取装置中用80%的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗， 直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘 干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗 粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为63%。 实施例2孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备'在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4mmol丙烯酰胺和4mmol4-乙烯基吡P定，再加入15mL氯仿，量取蒸馏水150mL，加 入7.5mL吐温-80 (按蒸馏水体积的3 %添加)，加热使完全溶解， 冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙 稀酸酯(40mmo1， 7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200 mg )。超声 脱气10min,分散乳化机乳化5min， 70。C水浴聚合4h。所得聚合物 用蒸馏水洗涤至澄清后，以80%的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗涤液进行 索氏提取。最后在固相萃取装置中用60%的乙腈-乙酸胺缓冲液冲洗， 直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所得微球烘 干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散性好、颗 粒均勾的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为57%。 实施例3孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4 irnnol甲基丙烯酸 和4 mmol 4-乙烯基吡嗖，再加入15mL三氯甲烷。量取蒸馏水150 mL，加入6.0mL十二烷基硫酸钠(按蒸馏水体积的4%添加)，加热 使完全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙 二醇二甲基丙稀酸酯(40mmo1, 7.56 mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200 mg)。超声脱气2min，分散乳化机乳化5 min, 6CTC水浴聚合12h。 所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以50%的乙腈-乙酸胺缓冲液为 洗脱液进行超声波洗脱。最后在固相萃取装置中用60%的乙腈-乙酸 胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为 止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得 到分散性好、颗粒均匀的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为44%。 实施例4孔雀石绿印迹分子聚合物微球的制备在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石绿、4 mmol甲基丙烯酸 和4mmol丙烯酰胺，再加入15mL谷氨酸钠。量取蒸馏水150mL， 加入3.0mL十二烷基硫酸钠(按蒸馏水体积的2%添加)，加热使完 全溶解，冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙稀酸酯(40 mmol， 7.56 mL ),引发剂偶氮丁异二腈(200 mg )。 超声脱气5min,分散乳化机乳化3min， 65'C水洛聚合24h。所得聚 合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以60%的乙腈-乙酸胺缓冲液为洗脱液 进行超声波洗脱。最后在固相萃取装置中用50%的乙腈-乙酸胺缓冲 液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿检出为止。所 得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛上)。得到分散 性好、颗粒均勻的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为51%。 实施例5孔雀石绿分子印迹聚合物微球的制备在250mL三角瓶中加入2mmo1孔雀石绿、8 mmol丙烯酰胺和 8mmo1甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸僧水150mL，加 入4.5 mL吐温-80 (按蒸僧水体积的3 %添加)，加热使完全溶解， 冷却至常温。将蒸馏水倒入三角瓶中，并加入交联剂乙二醇二甲基丙 稀酸酯(40mmo1， 7.56mL)，引发剂偶氮丁异二腈(200 mg )。超声 脱气5min，分散乳化机乳化3min, 65。C水浴、搅拌速度为200rpm、 聚合24h。所得聚合物用蒸馏水洗涤至澄清后，以80%的乙腈-乙酸 胺缓冲液为洗涤液进行索氏提取。最后在固相萃取装置中用80%的乙 腈-乙酸胺缓冲液冲洗，直至流出液在紫外-可见光谱检测无孔雀石绿 检出为止。所得微球烘干，用筛子筛选微球(100目筛下，200目筛 上)。得到分散性好、颗粒均勻的孔雀石绿分子印迹微球，回收率为 530/0。实施例6水产样品中孔雀石绿的快速检测取2.00g孔雀石绿分子印迹微球(实施例l)装入的固相萃取小 柱内，轻击柱壁填实。用80%乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在 紫外-可见分光光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g巿售鲜鳗 鱼置于50mL离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，将样品研 磨匀浆后浸泡、搅拌、过滤，将滤液通过由微球填满的过滤柱，再使 用80%的乙腈缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的浓度，从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为0.29ppm。实施例7水产样品中孔雀石绿的快速检测取2.00g孔雀石绿分子印迹微球装入的固相萃取小柱内，轻击柱 壁填实。用90%乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光 光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g巿售鲜八宝鱼置于50 mL 离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，称取5.00g已捣碎样品 于50mL离心管中，加入200|xL混合内标标准溶液，加入llmL乙腈， 超声波振荡提取2min，8000r/min匀浆提取30s,4000r/min离心5min, 上清液转移至25mL比色管中；另取一50mL离心管加入llmL乙腈， 洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用坡棒捣碎离心管中 的沉淀，漩涡混匀器上振荡30s，超声波振荡5min， 4 000r/min离心 5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL,摇匀 备用，将样品处理液通过由微球填满的过滤柱，再使用60%的乙腈 缓冲溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗 脱液中孔雀石绿的含量。从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为 0.14ppm。实施例8水产样品中孔雀石绿的快速检测取2.00 g孔雀石绿分子印迹微球装入的固相萃取小柱内，轻击柱 壁填实。用80%乙腈-乙酸胺溶液反复冲洗至洗出液在紫外-可见分光 光度计下检测620nm处无读数。称取5.00g巿售鲜鲑鱼置于50 mL 离心管内，按照孔雀石绿国家标准处理样品，称取5.00g已捣碎样品 于50mL离心管中，加入200pL混合内标标准溶液，加入llmL乙腈， 超声波振荡提取2min, 8000r/min勻浆提取30s,4000 r/min离心5min, 上清液转移至25mL比色管中；另取一50mL离心管加入llmL乙腈， 洗涤匀浆刀头10s,洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中 的沉淀，漩涡混勾器上振荡30s，超声波振荡5min， 4 000r/min离心5min，上清液合并至25rnL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀 备用，将样品液通过由微球填满的过滤柱，再使用98%的乙腈缓冲 溶液对微球进行洗脱，利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液 中孔雀石绿的含量。从而得到受检水产品中孔雀石绿的含量为 0.17ppm。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1、一种分子印迹聚合物微球，其特征在于，它是通过如下方法制备(1).将两种功能单体以一定比例混合；(2).将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，然后加入交联剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，乳化，热聚合；(3).微球洗涤、烘干，过筛。
2、 根据权利要求l所述的分子印迹聚合物微球，其特征在于，所 釆用的功能单体选自丙烯酰胺、甲基丙烯酸和4-乙烯基吡啶。
3、 根据权利要求1或2所述的分子印迹聚合物微球，其特征在于， 所釆用的功能单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸。
4、 根据权利要求1或2所述的分子印迹聚合物微球，其特征在于， 两功能单体按物质的量比1 8 : 1~8混合；孔雀石绿模板与混合单体 的物质的量比为l : 1 ~8。
5、 根据权利要求1或2所述的分子印迹聚合物微球，其特征在于， 两功能单'体按物质的量比i : 1混合。
6、 根据权利要求l-5任一项所述的分子印迹聚合物微球，其特征 在于，交联剂为乙二醇二甲基丙稀酸酯，其物质的量是总功能单体的 2~10倍；引发剂偶为氮二异丁腈，其质量是单体的1 8倍；乳化剂选 自十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、羟磺基甜菜碱、谷氨酸钠和吐温80， 按蒸馏水体积的i~io %添加。
7、 根据权利要求6所述的分子印迹聚合物微球，其特征在于，所 述亲脂溶剂选自氯仿、石油醚、三氯甲烷和甲醇，亲脂溶剂与水的体 积比是l: 5~20;反应体系的水油体积比是5 ~ 40 : 1。
8、 根据权利要求7所述的分子印迹聚合物微球，其特征在于，热 聚合温度为50 70。C。
9、 根据权利要求7或8所述的分子印迹聚合物微球，其特征在于,使用超声波洗脱和索式提取洗脱对微球进行洗涤，洗涤液为蒸馏水、 酒精或20~ 80%的乙腈-乙酸胺溶液。
10、 根据权利要求l-9任一项所述的分子印迹聚合物微球，其特 征在于，微球直径为50-200pm。
11、 一种快速检测水产品中孔雀石绿的方法，其包括如下步骤(1) .将样品研磨勻浆后浸泡、搅拌、过滤；(2) .将滤液通过由权利要求1-10任一项所述的分子印迹微球填满 的过滤柱，再使用缓冲溶液对微球进行洗脱；(3) .利用分光光度计在620nm条件下检测洗脱液中孔雀石绿的含量。
12、 根据权利要求ll所述的方法，其特征在于，缓冲溶液为80-98%的乙腈溶液。
全文摘要
本发明提供了一种用于快速检测水产品中孔雀石绿的分子印迹聚合物微球，其是通过下述方法制备将两种功能单体以一定比例混合，再将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，按一定顺序加入交联剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，制备分子印迹聚合物微球。本发明还进一步提供了检测样品中的孔雀石绿的方法，该方法包括对处理的水产样品进行识别、吸附和浓缩，并利用分光光度法检测其中孔雀石绿的浓度。还可以对其进行浓缩，降低了检测的检出限，对低含量样品的检测尤为有效。
文档编号G01N30/50GK101216464SQ20071030475
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者何计国, 曹冬冬, 茅文玺, 袁长梅, 车会莲 申请人:中国农业大学