专利名称：：内源性甲醛用于制备老年痴呆症的诊断剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及甲醛在制备老年痴呆症的诊断剂中的新用途，其中将内源性甲醛用作老年痴呆症的生物标志物。内源性甲醛作为老年痴呆症的生物标志物，可以用来确定受试者是否患有老年痴呆症或发展老年痴呆症的危险，还可以用来评价治疗老年痴呆症的药物的药效。在本发明中，我们通过对81例对照人群(非痴呆患者)和141例不同痴呆程度的老年痴呆病人进行匪SE(Folsteinetal.，1975)测试(国际上通用的简易精神智能检查量表)，按照分值不同分为正常，轻度痴呆，中度痴呆和重度痴呆。同时收集测试者的尿液进行荧光-HPLC分析(Luoetal.，2001)。通过实验结果分析，发现AD患者体液中的内源性甲醛浓度和对照比较呈现一定的规律性。这一发现有望将内源性甲醛作为临床普查的一个参考指标。在本发明的研究工作中，本发明人经分析发现AD患者尿甲醛浓度普遍高于对照(对照0.082mM，n=38，AD:0.303±0.032mM，n=141，对照与文献上报道健康人尿甲醛浓度为0.08mM相类似)，并随着痴呆程度加重尿甲醛浓度也呈现递增的趋势(见图3a)。本发明将内源性甲醛用作老年痴呆症的生物标志物，可以用来制备老年痴呆症的诊断剂。本发明的实施方案详细描述了内源性甲醛与老年痴呆症之间的关系，以及它用来制备老年痴呆症的诊断剂的用途。在本发明的一个优选实施方案中，通过检测受试者尿液中的甲醛浓度，将其与健康受试者尿液中的甲醛浓度进行比较，来判断所述受试者是否患有老年痴呆症，并且初步判断所述受试者的老年痴呆症的程度。在本发明的另一个优选实施方案中，通过纵向监测受试者在生命过程不同时间阶段尿液中的甲醛浓度变化，来判断所述受试者发展老年痴呆的危险。在本发明的另一个优选实施方案中，通过监测受试者在服用治疗老年痴呆症的药物之前和之后不同时间阶段的尿液中的甲醛浓度变化，来评价所述药物针对老年痴呆症的药效。在上文所述的应用中，尿液甲醛浓度可以通过高效液相荧光色谱(HPLC-荧光)进行测量，但是本领域的技术人员应该理解，检测方法并不限于此，还可以利用本领域公知的任何其他适当的方法进行检测。与现有技术相比，本发明优点在于1.提供了甲醛用于制备老年痴呆症的诊断剂的新用途。内源性甲醛作为老年痴呆症的生物标志物，不但可以用来判断受试者是否患有老年痴呆症，并且可以初步判断所述受试者的老年痴呆症的程度，从而为及时采用适当的治疗提供临床依据；2.内源性甲醛作为老年痴呆症的生物标志物，还可以通过纵向监测所述受试者在生命过程中的不同时间阶段尿液中甲醛浓度的变化，可以及时预测所述受试者发展老年痴呆症的危险，及时采取医学预防和干预，以免贻误治疗的最佳时机；3.内源性甲醛作为老年痴呆症的生物标志物，还可以用来评价治疗老年痴呆症的药物的药效，评价方法简单快速，成本低，经济实用；4.本发明的检测方法简单实用，对受试者不造成身体损害，因此，该方法具有非�：玫氖涤眯�。从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中图1显示荧光高效液相色谱测定的甲醛(FA)浓度的标准曲线，以及甲醛浓度与色谱峰面积之间的线性回归方程和线性相关系数R2。Y轴色谱峰面积；X轴甲醛浓度。线性回归方程:Y=15357X+364.34;R2=0.9997。图2显示5种不同代表性样品的荧光高效液相色谱图。2a.空白水；2b.对照标准甲醛溶液(lppm);2c.轻度痴呆症的尿液样品；2d.中度痴呆症的尿液样品；2e.重度痴呆症的尿液样品。甲醛的保留时间约为8分钟。图3a显示4种不同人群中尿甲醛的浓度测定结果，由图可见痴呆患者尿甲醛的浓度与患者痴呆程度呈正相关，并与对照有显著性差异，图中所用数据均采用平均值±标准误。所述4组不同人群为1组健康对照受试者(不患任何疾病，n=38)，和3组3种程度(轻度(n二50)、中度(n二39)、重度(n=52))的AD患者。3b.不同痴呆类别中尿甲醛的浓度测定结果，包括血管性痴呆，阿尔茨海默性痴呆，混合性痴呆和其它，由图可见，几种痴呆患者尿甲醛与对照相比均有显著性差异。3c.显示AD患者(同时患有高血压或糖尿病)与相应非AD患者(不患任何疾病的健康受试者和分别患有高血压或糖尿病的非AD患者)尿甲醛浓度比较，可以看出AD患者的尿甲醛浓度与非AD患者有极显著性差异；3d.患有高血压或糖尿病的非AD患者的尿甲醛浓度与健康人(不患任何疾病)的尿甲醛浓度比较。具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。1.材料与方法1.1材料和仪器氨苄青霉素，甲醛(37%，W/V)(优级纯，购自sigma公司)，三氯乙酸，氯化钠(分析纯，购自鼎国生物公司)，乙腈，乙醚(液相色谱纯，购自Tedia公司)，水均为Milli-Q超纯水。尿液采自广东汕头医学院，北京市顺义县居民社区，老年医院和老年公寓中的老年受试者。荧光-高效液相色谱仪(HP1100，agilent)，氮气吹干仪(上海过望化工有限公司)。1.2简易智能精神状态量表(匪SE)的测定在社区随机抽取112例健康人做调查，健康人的调查是在中关村医院老年病科和精神病科的医生指导下，在居民社区(社区没有任何与其他居民社区不同的居住环境)随机入户调查取样的，调查取样符合规范科学的方法，样本真实具有代表性和普遍性。临床调查人数不少于30人，具有统计意义。最后去掉了少数无统计意义且本身伴有除高血压和糖尿病之外病症的人群，剩下81人做痴呆调查的对照。痴呆患者的调查者是在老年公寓和老年医院住院或门诊病人，经专业医生诊断确诊后再进行的调查。痴呆患者共141人，在正规医院(北京老年医院)和几个敬老院取样调查，此过程完全是在老年病房主任的指导下完成的，按照科学规范的方法取样，样本具有代表性和普遍性。1.3尿液的采集和处理测试者当天禁酒和高脂肪饮食，第二天清晨空腹留尿，暂存于-7(TC，待测。1.4样品的衍生化反应标准曲线制作将甲醛用水配成lmM的母液，用水系列稀释成八个不同浓度的标准O，O.01，0.02，0.05，0.l，O.2，0.3，0.6mM，用水作空白对照。将不同浓度甲醛溶液O.8ml加到8个含有200ii1健康人尿液的2ml带盖的玻璃管中(加尿液是为了与后面测定样品时扣除本底的需要)，再分别加0.lml氨苄青霉素(2.5mg/ml的水溶液)和0.25ml三氯乙酸(20X的水溶液)，充分振荡30秒，随即置于9(TC水浴锅中l小时。然后，降至室温，并将管中溶液转移至10ml玻璃离心管中，将刚才的2ml管子用lml乙醚分别洗两次并合并到该10ml管中，并于每管中加入少量氯化钠(约0.5g)，激烈震荡1分钟，1000g离心5分钟，将上层有机相转移到5ml的玻璃管中，再用2ml乙醚萃取水相两次，与有机相一起合并。在4(TC用氮气吹干仪吹干有机相，用800ia乙腈-水溶液(体积比l:1)溶解，震荡30秒，用0.45iim有机滤器过滤于液相色谱专用样品瓶中，密封待测。样品衍生化样品衍生化同上操作，准备如下试剂空白lml水；尿液空白800ii1水+200ii1尿液；尿液+标准300iil水+500y1甲醛标准(l卯m)+200y1尿液；待测样本800iil水+200ii1待测尿液。处理过程同上述，最后用500yl乙腈-水溶液(体积比l:1)溶解。试剂空白，尿液空白，尿液+标准，待测样本，每次均做两个平行，再取均值用于计算。计算样本的甲醛浓度(单位ppm)=(每个样本的峰面积减去试剂空白的峰面积)+(尿液+标准的峰面积减去尿液空白的峰面积)X0.5(标准浓度)X5(200yl尿液)。最后换算成mM。1.5高效液相荧光色谱的条件荧光-HPLC柱HPZorbaxStableBondSB-C18，5m，250mmX4.6mm(德国)，柱温4(TC，进样量10iil，流动相乙腈水(体积比25:75)，流速lml/min，荧光检测器。2.结果与讨论2.1液相色谱测定甲醛(FA)的标准曲线从图1中看到甲醛浓度与色谱峰面积有良好的线性关系，回归方程已表明线性相关系数为0.9997。因此用此方法完全可以测定血液或尿液中微量甲醛的浓度。2.2高压液相色荧光谱图，临床调查及尿甲醛测定结果从图2可看出，色谱图中甲醛出峰的保留时间是相当稳定的(约为8分钟)，此方法用于定性和定量都是可行的。标准品的回收率(>95%)，日内偏差和日间差(<5%)均达到要求。图2的结果表明，内源性甲醛的浓度随着痴呆程度加重而递增，表示内源性甲醛可以用作诊断和判断老年痴呆程度的生物标志物。2.3不同老年痴呆患者临床调查情况及尿甲醛浓度测定结果表1总结了随机选取的141名不同程度的老年痴呆症患者的临床流行病学调查结果和他们的尿液甲醛浓度的测定结果。表2总结了对照人群(包括81名个体)调查情况及它们的尿液甲醛浓度测定结果。所述对照人群包括没有患有任何疾病的健康个体和患有除AD外的一种或多种疾病的6个体，所述除AD外的疾病包括，但不限于，高血压、高血糖、糖尿病、中风、心脏病、血栓、脑血栓、半身不遂、和记忆力下降等。表l.不同老年痴呆患者临床调查情况一览表及尿甲醛浓度测定结果编号性别年龄既往病史匪SE尿中甲醛浓度(mM)1男82血管性痴呆，脑出血00.0333332男76老年性呆，脑梗塞，帕金森，高血压00.0666673男80血管性痴呆，脑梗塞，高血压00.14男74老年性痴呆，II型糖尿病00.1333335女78帕金森病，缺血缺氧醒脑病00.1666676男83混合性痴呆，多发性脑更00.27女80脑梗塞，高血脂200.2333338女77老年性痴呆，脑梗塞00.2666679男74混合性痴呆，帕金森病60.310女76老年性痴呆，脑梗塞00.33333311女83老年性痴呆，高血脂00.36666712男78混合性痴呆，脑梗，高血脂200.413女79高血脂，高血压，痛风00.43333314女81混合性痴呆，脑梗00.46666715女64混合性痴呆，脑梗，脑出血00.516男79老年性痴呆00.5333337<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2对照人群*调查情况一览表及尿甲醛浓度测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*对照人群包括没有患任何疾病的健康群体和患有一种或多种除AD以外的疾病的非AD患者群体。2.4讨论本发明人的研究结果表明，在AD病人的尿液中内源性甲醛浓度与健康人有着明显的不同，那么对临床诊断来讲，这无疑是一个很有实用意义和应用前景的参考指标。在本发明人的研究中，老年痴呆病理切片表明病变是在脑组织中的某些蛋白出现纤维缠结和老年斑等，体外实验结果证明了甲醛在体外可以引起神经系统中存在的一种tau蛋白变性形成类似老年痴呆患者中脑组织切片中tau蛋白的聚集并形成螺旋纤维缠结，所以，本发明人大胆推测在痴呆患者神经系统中内源性甲醛的浓度可能超出正常人，并且在以后的代谢过程中会有表现。本发明的研究结果证实了这一推测，并且在此基础上本发明人完成了本发明。关于老年痴呆患者尿液中甲醛浓度的异常，本发明人推测这可能是由于甲醛合成酶及降解酶在老年痴呆患者体内失衡造成的。AD病按发病原因分为很多类型血管性痴呆，单纯老年性痴呆，混合性痴呆及其它(魏红梅，2008)(见图3b)，由图3中看到各种类型的AD患者的尿甲醛水平与对照相比均有极显著的和显著性差异。为了排除其他疾病的干扰，将伴有高血压或糖尿病的AD患者和同时也有相对应疾病的非AD患者比较发现(见图3c)，AD患者的尿甲醛水平与分别患有这两种相对应疾病的非AD患者比较仍有显著性差异，而从图3d中看出，患有高血压或糖尿病的非AD患者尿甲醛浓度与健康对照相比并没有显著性差异，由此说明尿甲醛浓度的增高至少与老年人常见的高血压和糖尿病没有正相关，即表明尿甲醛浓度的升高将是AD患者尿液中一个特异性的标记物。这为在临床早期诊断老年痴呆上提供对患者无任何伤害的简便易行的参考指标，并为研究治疗痴呆的药物疗效上提供一个评价方法，本研究结果在该研究领域将是一个全新的发现。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在其中进行各种形式和细节的变化，而不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围。参考文献1FemkeH.Bouwmana(CSFbiomarkerlevelsinearlyandlateonsetAlzheimer'sdisease.NeurobiologyofAging7.2008).2FolsteinMF，FolsteinSE，McHughPR(〃Mini-mentalstate〃.Apracticalmethodforgradingthecognitivestateofpatientsfortheclinician.JPsychiatrRes12:189-198.1975).3FrancisPT，PalmerAM，SnapeM，WilcockGK(ThecholinergichypothesisofAlzheimer'sdisease:areviewofprogress.JournalofNeurology，Neurosurgery&Psychiatry66:137-147.1999).4LuoW，LiH，ZhangY，AngCYW(Determinationofformaldehydeinbloodplasmabyhigh—performanceliquidchromatographywithfluorescencedetection.JournalofChromatographyB:BiomedicalSciencesandApplications753:253-257.2001).5McKh靈G，DrachmanD，FolsteinM，KatzmanR，PriceD，StadlanEM(ClinicaldiagnosisofAlzheimer'sdisease:r印ortoftheNINCDS-ADRDAworkgroup.Neurology34:939-944.1984).6SimonsenAH，McGuireJ，PodustVN，DaviesH，MinthonL，SkoogI，AndreasenN，WallinA，WaldemarG，Ble皿owK(IdentificationofanovelpanelofcerebrospinalfluidbiomarkersforAlzheimer'sdisease.NeurobiolAging29:961-968.2008).7施安国费秋艳(老年痴呆症药物治疗进展.药学进展24:338-341.2000).8倪琦炜，陆基宗(老年痴呆症(阿尔兹海默病)及其药物治疗.中国保健15:59-60.2007).9魏红梅(老年痴呆发病机理的研究.实用预防医学15:621-623.2008).20权利要求甲醛在制备老年痴呆症的诊断剂中的应用，其中将内源性甲醛用作老年痴呆症的生物标志物，通过检测受试者尿液样品中的甲醛浓度，将其与健康受试者尿液中的甲醛浓度进行比较，来确定所述受试者是否患有老年痴呆症，并且初步判断所述受试者的老年痴呆症的程度。2.按照权利要求l的应用，其中使用高效液相荧光色谱(HPLC-荧光)检测所述受试者尿液样品中的甲醛浓度。3.按照权利要求1或2的应用，其还通过纵向监测所述受试者在生命过程中不同时间阶段的尿液甲醛浓度，用来判断所述受试者发展老年痴呆症的危险。4.按照权利要求1或2的应用，其还通过监测所述受试者在服用抑制老年痴呆症的药物之前和之后不同时间阶段尿液甲醛浓度，用来评价所述药物的药效。全文摘要本发明涉及内源性甲醛在制备老年痴呆症的诊断剂中的应用，其中将内源性甲醛用作老年痴呆症的生物标志物，通过检测受试者尿液样品中的甲醛浓度，将其与健康受试者尿液中的甲醛浓度进行比较，来确定所述受试者是否患有老年痴呆症，并且初步判断所述受试者的老年痴呆症的程度。文档编号G01N33/48GK101726580SQ200810223978公开日2010年6月9日申请日期2008年10月13日优先权日2008年10月13日发明者卢静,张金玲,李芳序,童志前,赫荣乔申请人:中国科学院生物物理研究所
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