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专利名称：一种用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测金纳米棒空间取向的方法，特别涉及一种用散焦图像判断单 个金纳米棒三维空间取向的方法。
背景技术：
金纳米棒是目前在生物学领域和医学领域中应用最广泛的方向探针之一。它的合 成方法简单，能在平行和垂直于长轴方向分别产生纵向和横向等离子体共振，具有良好的 吸收特性和散射特性，更拥有稳定性好、生物相融性强、无光致闪烁、无光致淬灭的理想荧 光特性。在癌细胞的检测和治疗领域，金纳米棒已经展现出了比量子点和有机荧光分子更 加广阔的应用潜力和发展空间。然而，要将单一金纳米棒作为方向探针来加以应用，必然要 能够快速、直观地得到其三维空间取向。
金纳米棒的尺寸在IOOnm以下，用光学显微镜无法分辨，传统的判断其取向的方 法是检测它的双光子荧光偏振性，画出偏振曲线，再进行拟合。这种方法不具直观性、效率 低、准确性差，整个检测过程需要耗费大量的时间，而任何一个细小的操作过失(如转动偏 振时的角度误差等)都有可能使实验数据不准确，更为关键的是，长时间接受双光子激发， 金纳米棒随时可能会熔化变形，失去应用价值。另外，现有技术中也有用金纳米棒的散射光 散焦图像来判断其三维空间取向，但这对检测系统要求极高，而且得到的效果也并不十分 精确。发明内容
本发明的任务是要克服上述现有技术的不足之处，提供一种新的判断金纳米棒空 间取向的方法。本发明提供的方法的特点是快速、准确、直观，可以在实验过程中直观定性 判断金纳米棒的取向，大大提高了实验效率，另外，还可以利用程序进行拟合，得到精确的 三维空间取向信息。
本发明通过下述技术方案来实现一种用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取 向的方法，其特征在于包括以下步骤步骤a、用连续激光激发单个金纳米棒，在荧光显微镜中获取其单光子荧光；步骤b、在激光光路中引入一个像差，获得单个金纳米棒的单光子荧光散焦图像，据此 定性判断单个金纳米棒的取向，当散焦图像表现为对称的瓣状结构、中央有一亮点时，金纳 米棒长轴方向与激发光偏振方向垂直，散焦图像两瓣之间的方向即为长轴方向；当散焦图 像高阶对称性被打破、低阶的亮点偏离中央位置时，金纳米棒的长轴方向与激发光偏振方 向有介于O到90度之间的空间角；当散焦图像呈现各向同性时，金纳米棒长轴方向与激发 光入射方向平行；步骤C、用计算机程序模拟显微镜成像光路，拟合步骤b的实验图像，得到模拟的荧光 散焦图像，判断单个金纳米棒的三维空间取向，当模拟图像与实验图像最相似时，可直接通 过模拟图像读取金纳米棒的准确的三维空间取向信息。
所述在激光光路中引入一个像差的方法是调节荧光显微镜的物镜的聚焦平面，使其远离金纳米棒所在平面O. 9-1. 3微米。
所述步骤c中计算机程序是用matlab软件编写的程序。
所述步骤c中判断单个金纳米棒的三维空间取向的方法如下在matlab编写的程序中，输入包括平面角和空间角的参数，生成模拟散焦图像，对比模拟散焦图像与实验散焦图像，如果相似，读取金纳米棒的三维空间取向角度，如果不相似，再改变平面角和空间角，对比模拟散焦图像与实验散焦图像，直到相似，判断出三维取向角度。
所述步骤c中判断单个金纳米棒的三维空间取向的方法如下在matlab编写的程序模拟过程中，输入包括不同平面角和空间角的参数，得到不同的取向角度时的模拟散焦图像，建立取向角度与模拟散焦图像一一对应的数据库，对比实验散焦图像与摸拟散焦图像，两者相似时，模拟散焦图像对应的取向角度，即为单个金纳米棒的三维空间取向角度。
本发明的有益效果是目前检测金纳米棒空间取向的方法基本都利用了光信号 (荧光，散射光或者光学吸收产生的光热图像)的偏振性，本发明成功地避免了偏振性的检测，提高了实验效率和准确性。同时，单光子荧光散焦图像可以在实验过程中作为图像信息保存下来，这在后续的应用中十分便捷，能够有效减少实验过程中数据的混淆。与其他技术相比，本发明公开的用于检测金纳米棒空间取向的方法对实验设备无特殊要求，在一般实验室中用普通荧光显微镜、C⑶和连续激光光源就可以实现。单光子荧光散焦图像不受激发光偏振性和金纳米棒自身长径比的影响，因而可以检测不同尺寸的样品而无需调整光源。对于尺寸只有20nm的金纳米棒，效果一样很明显。


图1为本发明的检测流程框图；图2为步骤b中观测得到的三种不同类型的荧光散焦图像，(a)表明金纳米棒长轴方向与激发光偏振方向垂直，(b)表明金纳米棒长轴方向与激发光偏振方向有一定夹角，(C) 表明长轴方向与激发光偏振方向平行。
图3为matlab程序模拟出的不同取向性的荧光散焦图像，其中Ψ为三维空间角， 即金纳米棒长轴方向与水平面之间的夹角；Θ为二维平面角，即金纳米棒在水·平面的投影与X轴的夹角，激发光偏振方向与水平面平行。
具体实施方式
下面结合附图对本本发明一种用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法作进一步描述实施例1:一种用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法，包括以下步骤步骤a、用连续激光激发单个金纳米棒，在荧光显微镜中获取其单光子荧光。在步骤a 中得到的金纳米棒的单光子荧光呈现偶极特性，有沿长轴方向的偏振性，与双光子荧光的偏振性一致。双光子荧光偏振性是检测金纳米棒二维取向性的传统方法，这种方法所体现出的取向信息与散焦图像提供的取向信息有良好的一致性。
步骤b、调节荧光显微镜的物镜的聚焦平面，使其远离金纳米棒所在平面O. 9-1. 3微米，在激光光路中引入一个像差，获得单个金纳米棒的单光子荧光散焦图像，据此定性判 断单个金纳米棒的取向，图2为实验中观测得到的三种不同类型的荧光散焦图像；步骤b中 得到的散焦图像即为单光子荧光辐射场的空间分布。当散焦图像表现为对称的瓣状结构、 中央有一亮点时，金纳米棒长轴方向应与激发光入射方向垂直，散焦图像两瓣之间的方向 即为长轴方向，如图2(a)。由此图像可以比较准确的得到金纳米棒的二维取向信息。如图 2(b)，当散焦图像高阶对称性被打破、低阶的亮点偏离中央位置时，说明金纳米棒的长轴方 向与激发光入射方向有一定的夹角，此时依然可以用散焦图像定性判断取向信息。当散焦 图像呈现各向同性(环状)时，表明金纳米棒长轴方向与激发光入射方向平行，如图2(c)。
步骤C、用matlab编写的程序模拟显微镜系统成像光路，再现金纳米棒荧光辐射 场的取向分布，拟合步骤b的实验图像，得到模拟的荧光散焦图像，判断单个金纳米棒的三 维空间取向，当模拟图像与实验图像最相似时，可直接通过模拟图像读取金纳米棒的三维 空间取向信息。在matlab编写的程序中，输入包括平面角和空间角的参数，生成模拟散焦 图像，对比模拟散焦图像与实验散焦图像，如果相似，读取金纳米棒的三维空间取向角度， 如果不相似，再改变平面角和空间角，对比模拟散焦图像与散焦图像，直到相似，判断出三 维取向角度。
为使散焦图像更加清晰，在步骤a中，在显微镜入光口处放置两片透镜，调节透镜 间的距离，将进入显微镜的激光光斑缩小。
该方法在判断金纳米棒三维空间取向的同时可以对其荧光性质进行观测。
实施例2:一种用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法，包括以下步骤步骤a、用连续激光激发单个金纳米棒，在荧光显微镜中获取其单光子荧光。在步骤a 中得到的金纳米棒的单光子荧光呈现偶极特性，有沿长轴方向的偏振性，与双光子荧光的 偏振性一致。双光子荧光偏振性是检测金纳米棒二维取向性的传统方法，这种方法所体现 出的取向信息与散焦图像提供的取向信息有良好的一致性。
步骤b、调节荧光显微镜的物镜的聚焦平面，使其远离金纳米棒所在平面O. 9-1. 3 微米，在激光光路中引入一个像差，获得单个金纳米棒的单光子荧光散焦图像，据此定性判 断单个金纳米棒的取向，图2为实验中观测得到的三种不同类型的荧光散焦图像；步骤b中 得到的散焦图像即为单光子荧光辐射场的空间分布。当散焦图像表现为对称的瓣状结构、 中央有一亮点时，金纳米棒长轴方向应与激发光入射方向垂直，散焦图像两瓣之间的方向 即为长轴方向，如图2(a)。由此图像可以比较准确的得到金纳米棒的二维取向信息。如图 2(b)，当散焦图像高阶对称性被打破、低阶的亮点偏离中央位置时，说明金纳米棒的长轴方 向与激发光入射方向有一定的夹角，此时依然可以用散焦图像定性判断取向信息。当散焦 图像呈现各向同性(环状)时，表明金纳米棒长轴方向与激发光入射方向平行，如图2(c)。
步骤C、用matlab编写的程序模拟显微镜系统成像光路，再现金纳米棒荧光辐射 场的取向分布，拟合步骤b的实验图像，得到模拟的荧光散焦图像，判断单个金纳米棒的三 维空间取向，当模拟图像与实验图像最相似时，可直接通过模拟图像读取金纳米棒的三维 空间取向信息。在matlab编写的程序模拟过程中，输入包括不同平面角和空间角的参数， 得到不同的取向角度时的模拟散焦图像，建立取向角度与模拟散焦图像一一对应的数据 库，对比散焦图像与摸拟散焦图像，两者相似时，模拟散焦图像对应的取向角度，即为单个金纳米棒的三维空间取向角度。图3为对金纳米棒不同空间角度散焦图像的模拟，可以看到几乎任意角度的散焦图像都可以由此程序模拟出来，精确度大概在2度左右。
为使散焦图像更加清晰，在步骤a中，在显微镜入光口处放置两片透镜，调节透镜间的距离，将进入显微镜的激光光斑缩小。
该方法在判断金纳米棒 三维空间取向的同时可以对其荧光性质进行观测。
权利要求
1.一种用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法，其特征在于包括以下步骤步骤a、用连续激光激发单个金纳米棒，在荧光显微镜中获取其单光子荧光；步骤b、在激光光路中引入一个像差，获得单个金纳米棒的单光子荧光散焦图像，据此定性判断单个金纳米棒的取向，当散焦图像表现为对称的瓣状结构、中央有一亮点时，金纳米棒长轴方向与激发光偏振方向垂直，散焦图像两瓣之间的方向即为长轴方向；当散焦图像高阶对称性被打破、低阶的亮点偏离中央位置时，金纳米棒的长轴方向与激发光偏振方向有介于O到90度之间的空间角；当散焦图像呈现各向同性时，金纳米棒长轴方向与激发光入射方向平行；步骤C、用计算机程序模拟显微镜成像光路，拟合步骤b的实验图像，得到模拟的荧光散焦图像，判断单个金纳米棒的三维空间取向，当模拟图像与实验图像最相似时，可直接通过模拟图像读取金纳米棒的准确的三维空间取向信息。
2.根据权利要求1所述的用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法，其特征在于所述在激光光路中引入一个像差的方法是调节荧光显微镜的物镜的聚焦平面，使其远离金纳米棒所在平面O. 9 —1. 3微米。
3.根据权利要求1或2所述的用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法，其特征在于所述的计算机程序是用matlab软件编写的程序，所述步骤c中判断单个金纳米棒的三维空间取向的方法如下在matlab软件编写的程序中，输入包括平面角和空间角的参数，生成模拟散焦图像，对比模拟散焦图像与实验散焦图像，如果相似，读取金纳米棒的三维空间取向角度，如果不相似，再改变平面角和空间角，对比模拟散焦图像与实验散焦图像，直到相似，判断出三维取向角度。
4.根据权利要求1或2所述的用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法， 其特征在于所述的计算机程序是用matlab软件编写的程序，所述步骤c中判断单个金纳米棒的三维空间取向的方法如下在matlab编写的程序模拟过程中，输入包括不同平面角和空间角的参数，得到不同的取向角度时的模拟散焦图像，建立取向角度与模拟散焦图像一一对应的数据库，对比实验散焦图像与摸拟散焦图像，两者相似时，模拟散焦图像对应的取向角度，即为单个金纳米棒的三维空间取向角度。
全文摘要
本发明公开了一种用散焦图像判断单个金纳米棒三维空间取向的方法，其特征在于包括以下步骤步骤a、用连续激光激发单个金纳米棒，在荧光显微镜中获取其单光子荧光；步骤b、在激光光路中引入一个像差，获得单个金纳米棒的单光子荧光散焦图像，据此定性判断单个金纳米棒的取向；步骤c、用计算机程序模拟显微镜成像光路，拟合步骤b的实验图像，得到模拟的荧光散焦图像，判断单个金纳米棒的三维空间取向。本发明设备简单，实验无需调整光源，提高实验效率和准确性的同时，可以将单光子荧光散焦图像作为图像信息保存，这在后续的应用中十分便捷，能够有效减少实验过程中数据的混淆。
文档编号G01N21/64GK103063637SQ20121057930
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者吴立军, 李涛, 李强, 徐毅, 陈小军, 戴峭峰, 兰胜 申请人:华南师范大学