含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法
技术领域：
本发明涉及含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法，所述判定方法使用了有效排除自身荧光导致的影响、能以高精度定量地进行分析的组织染色法。
背景技术：
癌症与心肌梗塞、脑梗塞代表的血管系统疾病一起，是成年人死亡原因两大类疾病。例如，虽然日本人的乳癌罹患率比欧美诸国低，但近年来有增加的倾向，1998年超过胃癌的罹患率，成为女性罹患率的第I位。根据作为最近的报告的2005年日本厚生劳动省统计，乳癌的年罹患数超过5万人。该数字在全世界也同样逐年增加，根据2008年WHO的报告，即使男女合计，乳癌也成为罹患率第I位的疾病，其年罹患数超过138万人，占女性癌症全部的约23%。关于癌症的诊断，除了 X射线CT、MRI等图像诊断之外，检测在特定的癌症中特异性表达的癌症标志物、渗出至血液、组织中的癌症标志物等的方法也是常用的。作为乳癌的一般性筛查检查，实施问诊、触诊、乳房X射线照相术(乳房造影术(mammography))、超声波检查等，如果产生临床怀疑，则实施细胞诊断、活组织检查，通过病理学诊断判别是否是癌症。为了判定癌症治疗、预后的发展，病理学诊断很重要，成为这种诊断的中心的是“用于进行形态观察的HE (苏木精.伊红)染色法”和“使用针对癌症标志物因子的抗体的免疫组织化学法”。特别地，由于近年来抗体药物的登�。庖咦橹У闹匾苑浅８�。作为人癌基因HER2/neu(c-erbB-2)的基因产物的HER2蛋白质是属于人上皮生长因子受体家族的生长因子受体，是在其细胞质侧具有酪氨酸激酶活性区域的分子量约185kDa的跨膜型蛋白质。在人乳癌细胞中，确认了 HER2的高表达。作为包含抗HER2抗体的抗体医药赫赛汀(Herceptin ;注册商标)市售的曲妥珠单抗(Trastuzumab,通用名)已知是乳癌的代表性抗癌剂，所述抗HER2抗体将人上皮生长因子受体2(humanepidermal growth factor receptor 2 ;HER2)作为祀标，所述人上皮生长因子受体2是与癌症增殖相关的因子。曲妥珠单抗在特异性结合至HER2之后，通过以NK细胞、单核细胞作为作用细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)发挥抗肿瘤效果。作为该药剂施用有效性的判定方法，分析HER2蛋白质等蛋白质的表达的免疫组织化学(Immunohistochemisty ；IHC)法和分析HER2基因等的基因拷贝数的增加的FISH (荧光原位杂交，Fluorescencein situ hybridization)法在临床中被广泛使用。通过IHC法,可用DAB(二氨基联苯胺；Diaminobenzidine)对与HER2抗原部位结合的HER2抗体进行染色,通过可视化检测HER2的表达量。但是，因为该判定基准是通过染色水平为分数O 3的仅4个级别进行的大致性的判定基准，所以欠缺定量性，此外，判定基准受病理医师的熟练度所左右，因而在临床上成为问题。另一方面，FISH法使用检测HER2基因的探针和检测第17号染色体着丝粒的探针来进行，其能基于通过该FISH法分析出的每条第17号染色的HER2基因的拷贝数，判定基因组上HER2基因拷贝数有无增加。FISH法虽然是定量性的检查方法，但并非直接评价HER2蛋白质的量和HER2蛋白质的细胞内定位的方法。在癌症治疗中，定量分析局部的“癌基因拷贝数”和“癌基因产物的量”、对相关关系加以研究被认为很重要，因此，人们认为需要开发能定量检测局部的癌基因产物的量、即HER2蛋白质等癌症关联蛋白质的量的判定方法。近年来，代替通过DAB的酶法，作为检测灵敏度.定量性优秀的检测方法，量子点等荧光性粒子受到关注。对量子点而言，因为粒子数与荧光亮度呈比例关系，因此通过在免疫组织化学法中使用使量子点与抗体结合而成的探针，有可能能高精度、定量地分析癌症标志物的表达量。另外，乳癌患者中曲妥珠单抗单种药剂施用的有效率为15 34%，作为抗体医药其效果较低也是问题。有报道称，尽管通过使用DAB法的免疫组织染色确认到HER2的过量表达，曲妥珠单抗治疗效果低的患者中，曲妥珠单抗识别的HER2的细胞外结构域缺失(Nahta R et al, Breast Cancer Res.2006；8:215-223, Scaltriti M et al, J.Natl.Cancer Inst.2007 ；99:628-638)，乳癌的诊断中用于检测HER2的抗HER2抗体识别的HER2的抗原部位和乳癌的治疗中曲妥珠单抗识别的HER2的抗原部位不同被认为是上述问题的原因之一。非专利文献I:Nahta R et al, Breast Cancer Res.2006 ；8:215-223非专利文献2:Scaltriti M et al, J.Natl.Cancer Inst.2007 ;99:628-638

发明内容
虽然量子点等荧光粒子因为能发挥自身具有的稳定性和定量分析的威力、人们对其作为荧光免疫染色中的新工具期望较高，但目前作为定量分析却仅限于培养细胞。作为其理由，很大的原因在于，培养细胞由于细胞自身荧光较弱，量子点荧光粒子的荧光亮度能以足够高的S (信号)/N(噪声)比算出，与之相对，生物体组织由于具有与培养细胞相比为非常强的自身荧光，因此量子点荧光粒子的荧光亮度不能以足够高的S/N比算出。虽然生物体组织的长波长的自身荧光比短波长的自身荧光量少，但是也不能忽视自身荧光在观察中的影响，难于进行定量分析。进一步地，因为乳癌诊断中用于检测HER2蛋白质的抗体与将HER2蛋白质作为靶标的治疗药物(抗体)的抗原决定簇(表位)不同，所以现在使用抗HER2抗体的IHC法被认为不足以用作为用于选择包含曲妥珠单抗抗原决定簇的HER2过量表达的、适合施用曲妥珠单抗的患者的方法。本发明的课题是，提供通过生物体组织中定量的组织染色法对作为曲妥珠单抗等抗体医药的有效成分的抗体、有效成分的用于靶向靶标部位的抗体识别的蛋白质进行高精度定量，而进行的含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法。本发明的发明人认为，通过用经量子点荧光粒子直接标记的曲妥珠单抗进行生物体组织染色法，能更正确地选定适合施用曲妥珠单抗的患者。而且，对除去生物体组织染色法中自身荧光的影响的方法进行了深入研究，发现:用波长为488nm的激发光照射用经量子点荧光粒子(Qdot705)标记的作为曲妥珠单抗的有效成分的HER2抗体(曲妥珠单抗+QD705)进行了免疫染色的乳癌组织试样，通过荧光波长的获得区域为695 740nm的带通滤波器获得量子点荧光粒子的荧光图像(量子点荧光粒子的荧光+自身荧光)，之后通过荧光波长的获得区域为640 690nm的带通滤波器获得与上述荧光图像为完全相同焦平面及完全相同视野下的仅自身荧光的自身荧光图像，通过从荧光静止图像的各像素的荧光亮度减去自身荧光图像中相应的各像素的荧光亮度，能获得从荧光静止图像减去了自身荧光图像(自身荧光)的仅量子点荧光粒子的荧光的图像(校正荧光图像)。另外，为了确定上述校正荧光图像中含有的量子点荧光粒子的粒子数，利用了量子点特有的“闪烁(明灭)性”。即，确认了:对I粒子的量子点荧光粒子来说，因为在20秒的激发光照射时间中关闭状态(off-state，灭失状态)呈约4秒，所以算出具有约4秒的关闭状态(灭失状态)的粒子的平均亮度作为I粒子的量子点荧光粒子的荧光亮度，然后即可算出校正荧光图像中每I个细胞的量子点的荧光粒子的粒子数。另外确认到，通过算出乳癌患者的乳腺组织中用曲妥珠单抗+QD705检测的量子点荧光粒子数，能以比IHC-DAB法更广的范围定量HER2蛋白质的表达量。进一步地，认识到了用曲妥珠单抗+QD705检测的量子点荧光粒子数和通过曲妥珠单抗的治疗效果的相关性。本发明基于上述发现而完成。S卩，本发明涉及:(I)含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法，其特征在于使用包括下述工序(a) (d)的组织染色方法，工序(a)，用荧光物质标记含有抗体作为成分的医药品中的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触；工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像；工序(C)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像；工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像。(2)上述(I)所述的判定方法，特征在于含有抗体作为成分的医药品中的抗体是识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。(3)上述(2)所述的判定方法，特征在于癌症的增殖控制因子或转移控制因子是HER2 (人上皮生长因子受体2)。(4)上述(2)或(3)所述的判定方法，特征在于，癌症为乳癌。(5)上述(I) (4)中任一项所述的判定方法，特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差在IOOnm以内。(6)上述(I) (5)中任一项所述的判定方法，特征在于，荧光物质为荧光粒子。(7)上述(6)所述的判定方法，特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。(8)上述(6)或(7)所述的判定方法，特征在于，进一步包括以下工序(e) (g)，工序(e)，对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数；工序(f)，基于荧光图像，确定I粒子的荧光粒子，计算测量对应于该I粒子的荧光粒子的校正荧光图像内的I粒子的荧光粒子的平均荧光亮度；工序(g)，将校正荧光图像内的总荧光亮度除以所述I粒子的荧光粒子的平均荧光亮度，求出荧光粒子数，将该荧光粒子数除以通过工序(e)计数出的细胞数，算出每I个细胞的荧光粒子数。(9)上述(8)所述的判定方法，特征在于，利用荧光粒子具有的明灭性，来确定I粒子的荧光粒子。另外，本发明涉及:
(10)含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定系统，特征在于包括以下(A)
(D),(A)含有经荧光物质标记的抗体作为成分的医药品中的抗体；(B)激发光照射装置；(C)获得荧光图像的装置；(D)用于获得荧光图像的带通滤波器。(11)上述(10)所述的判定系统，特征在于含有抗体作为成分的医药品中的抗体是识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。(12)上述(11)所述的判定系统，特征在于，癌症的增殖控制因子或转移控制因子为HER2 (人上皮生长因子受体2)。(13)上述(10) (12)中任一项所述的判定系统，特征在于，进一步包括(E)获得细胞核荧光图像的带通滤波器。(14)上述(10) (13)中任一项所述的判定系统，特征在于，荧光物质为荧光粒子。(15)上述(14)所述的判定系统，特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。通过本发明，例如，通过除去自身荧光的影响、使用经量子点荧光粒子标记的PARl抗体的本发明的组织染色法，能比作为现有的乳癌诊断方法之一而使用的组织染色法(IHC-DAB法)在更广的范围内定量HER2蛋白质的表达量，能进行代替IHC-DAB法的高灵敏度、定量的新的乳癌病理诊断。进一步地，因为认识到通过经量子点荧光粒子标记的作为曲妥珠单抗有效成分的HER2抗体检测的HER2蛋白质的水平与通过曲妥珠单抗的治疗效果的相关性，故而期待可通过本发明来预测曲妥珠单抗的治疗效果。由此通过本发明，并不限于曲妥珠单抗，也能判定所有含有抗体作为成分的医药品的有效性。另外，通过将本发明的含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法与现有技术的FISH法等组合，可对乳癌中HER2基因拷贝数和HER2蛋白质的量同时进行定量评价，有效促进乳癌中的癌症治疗。

图1(a)为表示进行了使用量子点荧光粒子的免疫染色(IHC-QDs)法的组织试样的制作方法的图。(b)为表示抗体(曲妥珠单抗)的硫醇基与量子点荧光粒子的马来亚酰胺基的偶联反应的图。图2为获得的荧光图像的代表性图。图3为说明除去自身荧光的影响的现有方法的图。(a)为表示通过激发光照射的自身突光褪色法(参见Hikage等人,Nanotechnology (2010))的结果的图，(b)为对比度调整法的示意图。(b)中表示的灰色区域表示人眼可见为黑色的范围。图4(a)为表示通过减法进行的图像处理中的图像转换的图。(b)为表示量子点荧光粒子的荧光波长特性与自身荧光的荧光波长特性的图。实线表示量子点荧光粒子(QD705)的荧光波长特性。另外，附有误差条的点图表示了分别用荧光波长的获得区域为505 545nm、565 595nm、585 630nm、640 690nm、695 740nm 及 760 800nm 的共计6种带通滤波器获得的组织试样切片上的自身荧光的荧光亮度的实测值。上述实测值的平均值的点以虚线连接，作为自身荧光的荧光波长特性表示。另外，带通滤波器的波长宽度以条(bar)表示。图5为表示除去了自身荧光的校正荧光图像的制作法的图。图6为表示在进行了通过IHC-DAB法的病理诊断的组织试样中IHC-DAB法的染色结果与IHC-QDs法的染色结果的图。图7为表示量子点荧光粒子具有的闪烁(明灭)性的图。纵轴表示量子点荧光粒子的荧光亮度，横轴表示量子点荧光粒子的激发光的照射时间(秒)。箭头头部表示将量子点荧光粒子的最大荧光亮度的10 %设定为荧光亮度的阈值。图8(a)为表示通过FISH法算出的HER2基因拷贝数与通过IHC-DAB法算出的HER2蛋白质的量的关系的图。图中FISH分数2.2表示用于病理判断的FISH分数的阈值。(b)为表示通过FISH法算出的HER2基因拷贝数与通过IHC-QDs法算出的HER2蛋白质的量的关系的图。图中FISH分数2.2及IHC-QDs分数5.5分别表示用于病理判断的FISH分数和IHC-QDs分数的阈值。图9为表示IHC-DAB法的操作步骤和IHC-QDs法的操作步骤的图。图10为表示通过IHC-QDs法算出的HER2蛋白质的量与通过IHC-DAB法算出的HER2蛋白质的量的关系的图。图11为表示通过FISH法算出的HER2基因拷贝数与通过曲妥珠单抗的治疗效果(TTP[疾病无进展的时间(time to progression);通过施用药剂肿瘤增殖被控制的时间])的关系的图。(b)为表示通过IHC-QDs法算出的HER2蛋白质的量与通过曲妥珠单抗的治疗效果(TTP[疾病无进展的时间(time to progression);通过施用药剂肿瘤增殖被控制的时间])的关系的图。
具体实施例方式作为本发明的含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法，只要是使用了包括下述工序的组织染色方法的方法(但通过医师进行的诊断行为除外)则没有特别限制，工序(a)，用荧光物质标记含有抗体作为成分的医药品中的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触；工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像；工序(C)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像；工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像；进一步地，优选包括如下工序:工序(e)，对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数；工序(f)，基于荧光图像，确定I粒子的荧光粒子，计算测量对应于该I粒子的荧光粒子的校正荧光图像内的I粒子的荧光粒子的平均荧光亮度；工序(g)，将校正荧光图像内的总荧光亮度除以所述I粒子的荧光粒子的平均荧光亮度，求出荧光粒子数，将该荧光粒子数除以通过工序(e)计数出的细胞数，算出每I个细胞的荧光粒子数，另外，作为本发明的含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定系统，只要是包括下述(A) (D)的系统则没有特别限制，(A)含有经荧光物质标记的抗体作为成分的医药品中的抗体；(B)激发光照射装置；(C)获得荧光图像的装置；(D)用于获得荧光图像的带通滤波器；进一步地，优选为包括下述(E)的系统:(E)获得细胞核荧光图像的带通滤波器；作为施用上述含有抗体作为成分的医药品的对象，可举出例如癌症患者、感染症患者、自身免疫疾病患者等，其中可优选举例癌症患者。作为施用给癌症患者的、含有抗体作为成分的医药品中的抗体，可举出如下抗体:以将癌症的增殖控制因子或转移控制因子等作为靶标抗原、与该靶标抗原结合的抗体作为有效成分，该抗体通过与癌细胞结合而抑制癌细胞的增殖或杀死癌细胞。另外，作为含有抗体作为成分的医药品，除了含有上述抗体作为有效成分之外，还可举出含有抗癌剂、抗病毒齐U、抗生素等作为有效成分且含有抗体作为递送至癌细胞的手段的医药品等。作为上述医药品，可以举出例如西那吉斯(Synagis)、类克(Remicade)、美罗华(rituxan)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)等，其中可优选举例曲妥珠单抗。作为癌症，可举出大肠癌、直肠癌、肾癌、乳癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、血癌、肝癌、胰癌、皮肤癌、肺癌、乳癌等。另外，癌症的增殖控制因子或转移控制因子中，作为癌症的增殖控制因子，可举出例如上皮生长因子(EGF:epidermal growth factor)、EGF受体(EGFR)、血小板来源的生长因子(F1DGF:p late let-derived growth factor)、PDGF 受体(F1DGFR)、膜岛素样生长因子(IGF:insulin-like growth factor)、IGF 受体(IGFR)、成纤维细胞生长因子(FGF:f ibroblastgrowth factor)、FGF 受体(FGFR)、血管内皮生长因子(VEGF: vascular endotherialgrowth factor)、VEGF 受体(VEGFR)、肝细胞生长因子(HGF:hepatocyte growth factor)、HGF受体(HGFR)、神经营养因子(NT:neurotropin)、转化生长因子 β (TGF β:transforminggrowth factor-β )家族、人上皮生长因子受体 1、2、3或4(HER1、2、3或4:human epidermalgrowth factor receptor 1,2,3 或 4)、巨卩遼细胞集落刺激因子(CSF1:macrophagecolony-stimulating factor I)、CSFl受体(CSFlR)等调节细胞增殖的因子，和细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(O)K:cyclin_dependent kinase)、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、pl6INK、pl5、p21、p27、RB(视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))等调节细胞周期的因子；作为癌症的转移控制因子，可举出例如基质金属激酶I (MMPl)、基质金属激酶2 (MMP2) ,PARl (蛋白酶活化受体 I，protease activated receptor I)、CXCR4(趋化因子[C-X-C 基序]受体 4,chemokine [C-X-C motif]receptor 4)、CCR7(趋化因子[C-C 基序]受体 7, chemokine [C-Cmotif]receptor 7)等,其中因为以HER2为祀标的曲妥珠单抗被广泛使用而可优选举例HER2。为了判定含有抗体作为成分的医药品的有效性，例如优选与基因诊断法联用，可与利用酶和底物的显色反应的免疫组织化学法等现有判定方法进行比较研究。作为基因诊断法，可举出例如PCR法、Southern杂交法、FISH法等，作为利用酶和底物的显色反应的免疫组织化学法，可举出例如辣根过氧化物酶(HRP)与作为HRP底物的DAB (3，3’ -二氨基联苯胺)、碱性磷酸酶(ALP)与作为ALP底物的BCIP/INBT (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/四唑硝基蓝)、β -半乳糖苷酶和作为β -半乳糖苷酶的底物的X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷)的方法。其中，判定乳癌中曲妥珠单抗有效性的情况下，可优选举例FISH法和/或使用了 HRP和DAB的免疫组织化学(IHC-DAB)法的联用。本发明的含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法和含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定系统中，作为判定有效性的对象的医药品，不限于含有抗体作为有效成分的医药品，可举出含有抗癌剂、抗病毒剂、抗生素等作为有效成分且含有识别癌细胞特异性的蛋白质的抗体作为递送至癌细胞的手段的医药品，含有将被有效成分作为靶标的因子(蛋白质)的关联信号传递途径中的因子作为靶标的抗体的医药品等。上述含有抗体作为成分的医药品中的抗体是HER2的情况下，作为存在于HER2的信号传递途径下游的因子，可举出例如与细胞增殖相关的因子Ras、Raf等，抗凋亡因子ΡΙ3Κ、AKT等。作为上述工序(a)中含有抗体作为成分的医药品中的抗体，优选特异性识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子或癌细胞特异性蛋白质等的抗体，可以为单克隆抗体、多克隆抗体。另外，对上述抗体的类别或亚类没有特别限制，作为类别，可举出IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等，作为亚类，可举出IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2等。另外，此处的术语“抗体”以包含任意抗体片段或诱导体的含义而使用，例如，包含Fab、Fab’ 2、⑶R、人源化抗体、多功能抗体、单链抗体(ScFv)等。所述抗体可按照公知的方法制造(例如,参考HarlowE.&Lane D., Antibody, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988))。作为上述工序(a)中的荧光物质，只要是响应于选定波长的紫外光、可见光等放射线的照射而发出荧光的物质就没有特别限制，例如，作为有机荧光物质，可举出荧光素、罗丹明、Cy-5、Cy-3、Alexa等，作为无机荧光物质，可举出荧光二氧化硅纳米粒子、量子点荧光粒子等荧光粒子。而且，因为长波长侧自身荧光的影响较少，所以优选使用发出近红外区域侧、特别是近红外区域的荧光的荧光物质，该荧光物质发出的荧光波长的获得区域为近红外区域侧(570 800nm)，特别是近红外区域(700 800nm)。上述有机荧光物质通过激发光而急速发生褪色，不适合长时间激发光照射的分析，因此优选使用光稳定性高、即使长时间激发光照射也稳定的荧光粒子，其中优选量子点荧光粒子。作为荧光粒子，通过激发光的照射而发出荧光的粒子即可，对其材料等没有限制，可以为材料自身发出荧光的物质，也可以为含有荧光物质的粒子或通过涂布荧光物质而能发出荧光的粒子。另外，荧光粒子的形状、大小没有特别限制，可以举出方形、圆盘状、多面体、球状，但优选球状，其大小为直径0.0OOOlnm Imm,优选为直径0.0Olnm 100 μ m,更优选为直径0.0lnm 10 μ m,还可适当选择荧光粒子发出的荧光的波长。荧光粒子可按照日本特开平9-241634、日本特开2010-242059等公开的方法来制作，但也可购入在聚苯乙烯芯粒子存在下通过适当的荧光染料或苯乙烯的荧光染料的聚合对聚苯乙烯粒子染色而制备的SPHERO荧光粒子(BayBioscience公司制)、突光粒子Estapor (注册商标)标准微粒(Merck Chime公司制)等市售品。荧光粒子中，也被称为胶体状量子点(QD =Quantum Dot)的量子点荧光粒子由于荧光粒子兼具非常锐利的发光光谱和高度量子效率的特性而优选。量子点荧光粒子是发光性的半导体纳米粒子，直径范围为I 20nm，在生物学和医学诊断领域中被利用于荧光显像。就量子点荧光粒子而言，电子被量子性地封闭在轮廓明确、三维且为纳米大小的半导体结晶中，量子点荧光粒子的大小变小时，半导体的能隙(band gap)变大，因此，可通过大小在整个可见光谱的范围内来调节半导体光致发光的发光波长。作为本发明中的量子点荧光粒子，发光性的半导体纳米粒子即可，关于其大�。叛「菁し⒐饧坝獠ǔざ粤Ｗ哟笮〗惺实钡鹘�。作为所述量子点荧光粒子，例如，可利用以半导体壳(ZnS)被覆的半导体材料(CdSe)的纳米晶体、Qdot (注册商标)525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot625、Qdot655、Qdot705、Qdot800 (全部Invitrogen公司制)。获得的荧光波长超过800nm时，摄像装置的灵敏度降低，因此在发出近红外区域的荧光的量子点荧光粒子中，优选使用发出705nm的荧光的量子点荧光粒子(Qdot705)。上述工序(a)中，作为以荧光物质标记抗体的方法，可举出对该抗体具有特异的亲和性的抗体(二抗)介入的方法、生物素-亲和素法、硫醇基-马来酰亚胺基的偶联反应、使用既有化学接头的方法、交联剂(EDC等)的交联反应、离子键法等，其中，在上述抗体是人源化抗体或人抗体的情况下，可优选举出硫醇基-马来酰亚胺基的偶联反应法。作为上述工序(a)中的组织试样，可举例为福尔马林固定的石蜡切片、冻结切片等固定组织试样切片，可举出病理组织试样、外周血液组织试样、从组织分离的细胞、从体液分离的细胞的细胞封闭(cell block)试样、对外周血液白血球或细胞的悬浮试样进行沉降或离心制成的细胞封闭试样、组织擦拭试样、外周血液、体液、渗出液、含有细胞的液体的涂抹试样等。上述工序(a)中，作为所述经荧光标记的抗体与组织试样接触的方法，没有特别限制，因为通过所述接触发生抗原-抗体反应，所以接触时的温度优选O 40°C。另外，接触时间随着使用的组织试样的种类、抗体浓度、效价的高度、上述接触(反应)温度、靶因子(抗原)的量、局部部位的不同等而不同，对其没有特别限制，可进行适当选择，可举出10分钟 12小时，优选10分钟 2小时。另外，为防止抗体的非特异性结合，在使抗体与组织试样接触之前，可进行FBS、BSA、IgG等封闭处理。作为上述工序(b)中的激发光的激发波长，其为比荧光物质发光的荧光波长短的波长，从对人体安全性的方面来说优选400 700nm，更优选450 650nm，特别地，可具体举出一般用作为激发波长的488nm、532nm或635nm。作为上述工序(b)中的荧光图像，可举出荧光静止图像、荧光静止图像及对应于该荧光静止图像的荧光动态图像。上述荧光静止图像能使用荧光显微镜来获得，所述荧光显微镜能使用一般的PC等计算机作为控制器，进行对CCD摄像装置的摄影条件的控制、获得的荧光静止图像的图像化表示、对光源的光亮度的控制等。为了荧光物质发光的荧光亮度不饱和，进行激发光侧的滤光器、二向色镜等的必要的设定，进一步地优选激发光的曝光时间设定为0.0003至30 60秒。作为荧光物质的荧光各像素亮度是否不饱和的确认方法，也可如下进行:设定预先指定的亮度值或针对亮度值的最大值预先指定的比例的亮度值(例如，8位图像的情况下255为最大值，由此设定220这样的数值或亮度值的最大值的90%)，超过该值时判断为饱和。另外，此时也可不仅用一个像素，而使用图像全体的预先指定的比例的多个像素来判断。在对荧光静止图像中荧光物质的荧光亮度是否来源于I个粒子进行确定的情况下，可根据需要获得荧光动态图像。作为上述荧光动态图像，优选以2 500msec的分辨能力获得50 200帧与上述荧光静止图像相同视野及相同焦点下的动态图像。作为获得上述荧光图像的带通滤波器，使用为了仅能让荧光物质发出的红色、蓝绿色、橙色、绿色、蓝色等特定波长的荧光透过而选择的带通滤波器，希望使用能获得上述荧光物质的总荧光亮度的25%以上、优选50%以上、更优选75%以上的带通滤波器。进一步地，关于获得上述荧光图像的带通滤波器，希望使用能在30nm以内、优选15nm以内、更优选5nm以内的波长区域中获得上述荧光物质的荧光亮度的30%的带通滤波器。例如，使用发出705nm的荧光的荧光物质的情况下，获得上述荧光图像的带通滤波器优选为荧光波长的获得区域为695 740nm的带通滤波器。上述工序(C)中，作为获得自身荧光图像的方法，可举出下述方法:将用于获得荧光物质发出的荧光波长的带通滤波器用能获得与该带通滤波器相比为短波长侧或长波长侧的附近区域、优选短波长侧的附近区域的波长的带通滤波器代替，在与上述荧光静止图像相同视野和相同焦点的条件下获得图像，获得不含荧光物质的荧光而仅含自身荧光的图像。由于长波长的荧光比短波长的荧光折射率小、比短波长的荧光在更远处汇聚焦点，因此上述荧光物质发出的荧光波长的获得区域与获得自身荧光图像的波长区域的波长差异大时，上述荧光静止图像中含有的自身荧光的焦点和自身荧光图像中自身荧光的焦点的间距就会变大。因此，上述荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差可优选举例为130nm以内、优选120nm以内、更优选IlOnm以内的区域,特别是IOOnm以内。作为用于获得本发明的荧光图像、自身荧光图像的带通滤波器，具体可举出荧光波长的获得领域为 505 545nm、565 595nm、585 630nm、640 690nm、695 740nm、760 800nm 等的带通滤波器，例如使用荧光波长的获得区域为695 740nm的带通滤波器获得上述荧光静止图像的情况下，获得自身荧光图像的带通滤波器优选为荧光波长的获得区域为640 690nm的带通滤波器。用于获得上述自身荧光图像的摄影条件设定为，比较上述荧光静止图像与该自身荧光图像的相同区域的自身荧光的亮度，自身荧光图像的任意的R01、例如25X 25像素的自身荧光的最大值，是荧光静止图像的1.1 1.3倍，优选1.2倍。S卩，较之荧光静止图像，自身荧光图像的自身荧光的亮度值优选高10 30 %，特别是20 %左右。上述工序(d)中，作为获得校正荧光图像的方法，可举出:在荧光静止图像及自身突光图像转换为 JPEG、TIF等图像文件之后,用 Image *J(http://rsb.1nf0.nih.gov/ij/)、Photoshop (Adobe 公司制)、After Effect (Adobe 公司制)、G-Count (G-Angstrom 公司制)的图像分析软件，基于自身荧光图像的亮度从荧光静止图像的亮度除去自身荧光的亮度的处理。需要说明的是，转换图像文件时，优选选择全部荧光分布均被包括进去的阈值。上述工序(e)中，作为对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数的方法，可举出在用DAP1、Hoechst、PI (碘化丙啶)等与DNA结合发出荧光的核酸染色剂对细胞核染色之后、对与荧光图像相同视野中的被染色的细胞核数的总数进行计数的方法，但在荧光物质发出的荧光波长的获得区域为近红外区域的情况下，较之发出荧光特性类似的红色荧光的PI而言，优选使用发出蓝色荧光的DAPI或Hoechst。上述工序(f)中，作为确定I粒子的荧光粒子的方法，可举出例如测定荧光图像中的荧光粒子的荧光亮度、基于荧光I粒子发出的荧光的亮度信息求出上述荧光粒子相当于何种粒子的方法，或利用荧光粒子具有的“闪烁(明灭)性”的方法等，但在荧光粒子是量子点荧光粒子的情况下，优选为利用闪烁(明灭)性的方法。此处，“闪烁(明灭)性”指下述情况反复进行的性质:相对于照射激发光时的照射时间或照射量，发光强度突然变为几乎为零(OFF)的消失时间(灭失时间)持续大约数毫秒 5秒、再得到原发光强度。另外，利用“闪烁(明灭)性”确定I粒子的荧光粒子的方法指下述方法:基于荧光静止图像或荧光动态图像，测定照射激发光任意时间、例如10 100秒的情况下荧光粒子的灭失时间、进行该荧光粒子是否为I粒子的评价、确定I粒子的荧光粒子。例如，使用发出705nm的荧光的量子点荧光粒子作为荧光粒子的情况下，照射激发光20秒的情况下量子点荧光I粒子的灭失时间为约4秒，即，能将灭失时间为约4秒的荧光粒子确定为来源于I粒子的量子点荧光粒子。此处，为了判断量子点荧光粒子是否灭失，可合适地设定量子点荧光粒子的荧光亮度的阈值，例如将量子点荧光粒子的最大荧光亮度的O 30%、优选5 15%、更优选10%设定为阈值。使用Image.J、Photoshop、After Effect、G-Count等图像分析软件,测定与已确定的I粒子对应的校正荧光图像内的荧光亮度。就通过上述测定进行的对I粒子的平均荧光亮度的计算而言，从精力和准确性方面考虑，使用2 200个荧光粒子、优选5 10个荧光粒子来进行。上述工序(g)中，算出每I个细胞的荧光粒子数。每I个细胞的荧光粒子数能通过下述方法算出:将从上述校正荧光图像得到的量子点荧光粒子的总荧光亮度值(画面内的总荧光亮度)、从上述细胞核染色图像得到的细胞数、及每I个粒子的量子点荧光粒子的平均荧光亮度的值(I粒子荧光亮度)代入下式中算出:(画面内的总荧光亮度/I粒子荧光亮度)/细胞数=画面内的总荧光粒子数/细胞数=突光粒子数/细胞。通过包括上述工序(a) (d)的本发明的判定方法，分别获得判定对象组织试样与正常组织试样的校正荧光图像，比较两种校正荧光图像内的荧光亮度，在判定对象组织试样的校正荧光图像中的荧光亮度更高的情况下，由于这暗示了医药品中含有的抗体识别的蛋白质的量较多，因此可判定为判定对象可预见通过所述医药品有治疗效果，所述判定对象是适合施用所述医药品的患者。另外，通过包括上述工序(a) (g)的本发明的判定方法，分别算出判定对象组织试样与正常组织试样的每I个细胞的荧光粒子数，对两者加以比较，当判定对象组织试样中每I个细胞的荧光粒子数较多的情况下，因为暗示了医药品中含有的抗体识别的蛋白质的量较多，可判定为判定对象可预见通过所述医药品有治疗效果，所述判定对象是适合施用所述医药品的患者。例如，可以用量子点荧光粒子标记是作为乳癌的抗体医疗品的曲妥珠单抗的有效成分的抗HER2抗体，使用所述量子点荧光粒子标记抗体，算出每I个细胞的通过曲妥珠单抗检测出的荧光粒子数，以该数作为指标，能选定适合施用曲妥珠单抗的患者、预测曲妥珠单抗的治疗效果。作为前述本发明的判定系统中的激发光照射装置，可举出水银灯(100V)、水银灯(200V)、氙气灯(75V)、氙气灯(150V)、卤素灯(12V 100W)、钨灯(6V 30W)、氙气灯(波长250 IOOOnm)、钨灯(波长250 IOOOnm)、Cr: LiSAF灯(波长430nm)、氦-镉激光器(波长325、442nm)、UV氩激光器(波长351、364nm)、氩离子激光器(波长488、514nm)、氦氖激光器(波长543、594、633nm)、氪离子激光器(波长568、647nm)、LD激发CW/Q_CW(连续振荡 / 准连续振荡)固体激光器(波长 375nm、405、440、473、488、505、515、532、561、594、635、785、1064nm)等,其中从对人体的安全性方面考虑,可合适地举例为400 700nm的激发波长、优选为LD激发CW/Q-CW固体激光器(波长488、532、635nm)。另外，作为本发明的判定系统中的荧光图像获得装置，可举出荧光显微镜、共聚焦激光扫描型荧光显微镜等。作为通过所述荧光图像获得装置能获得的荧光图像，可举出荧光静止图像与自身荧光图像，必要时还有荧光动态图像。
另外，作为本发明的判定系统中用于获得荧光图像的带通滤波器，可举出用于获得荧光静止图像(荧光动态图像)及自身荧光图像的带通滤波器，另外，作为获得细胞核荧光图像的带通滤波器，根据使用的核酸染色剂的荧光特性而有所不同，例如因为DAPI的最大突光波长为461nm, Hoechst 33342及Hoechst 33258的最大突光波长为465nm、PI (碘化丙啶)的最大荧光波长为617nm，优选使用能充分覆盖这些波长的带通滤波器。通过以下实施例具体地说明本发明，但本发明的技术范围不受这些实施例限制。实施例1
使用IHC-QDs法进行了免疫染色的组织试样的制作方法作为人乳癌病理组织，选择了基于IHC-DAB法的评价分数为O的6例，分数为I的6例，分数为2的11例，分数为3的14例，共计37例。另外，关于病例的背景，如表I所示，考虑为没有偏向性的情况。针对上述37例的组织，按照通常的病理组织诊断中使用的方法来制备组织试样。即，用福尔马林固定癌症患者的乳房组织检测样品，用乙醇进行脱水处理，之后进行二甲苯处理，浸于高温的石蜡中进行石蜡包埋，制作组织试样(图1(a))。接下来将上述组织试样进行2 4 μ m的切片，用二甲苯进行脱石蜡处理，进行乙醇处理，之后用去离子水洗净。为了使抗体能高效接近固定组织内的抗原部位，在IOmM柠檬酸(pH 6.0)中于121°C、15分钟的条件下进行对上述试样的活化，实施缓和固定组织结构的处理。接下来，用去离子水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)依序洗净上述试样，然后，于25°C，在含有用发出705nm的荧光的量子点荧光粒子(Qdot705)标记的作为曲妥珠单抗的有效成分的HER2抗体(曲妥珠单抗+QD705) 15nM的PBS溶液中，将上述试样进行3小时的抗体反应。此处，作为向曲妥珠单抗标记Qdot705的方法，使用被还原的曲妥珠单抗的硫醇基与量子点荧光粒子的马来酰亚胺基之间的偶联反应(图1(b))。需要说明的是，使用经Qdot705标记的人IgG(人IgG+QD705)作为对照。用PBS溶液进行4次洗净，之后为了对细胞数计数，通过于25°C进行10分钟的DAPI染色(2 μ g/mlPBS)来对细胞核染色。用PBS进行3次洗净，之后封入，制作了进行了免疫染色(IHC-QDs)的组织试样(图1(a))。表I
权利要求
1.一种含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法，其特征在于，使用包括下述工序(a) (d)的组织染色方法，工序(a)，用荧光物质标记含有抗体作为成分的医药品中的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触；工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像；工序(c)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像；工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像。
2.如权利要求1所述的判定方法，其特征在于，含有抗体作为成分的医药品中的抗体是识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。
3.如权利要求2所述的判定方法，其特征在于，癌症的增殖控制因子或转移控制因子是HER2，所述HER2是人上皮生长因子受体2。
4.如权利要求2或3所述的判定方法，其特征在于，癌症为乳癌。
5.如权利要求1 4中任一项所述的判定方法，其特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差在IOOnm以内。
6.如权利要求1 5中任一项所述的判定方法,其特征在于,突光物质为突光粒子。
7.如权利要求6所述的判定方法，其特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。
8.如权利要求6或7所述的判定方法，其特征在于，进一步包括下述工序(e) (g)，工序(e)，对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数；工序(f)，基于荧光图像，确定I粒子的荧光粒子，计算测量对应于该I粒子的荧光粒子的校正荧光图像内的I粒子的荧光粒子的平均荧光亮度；工序(g)，将校正荧光图像内的总荧光亮度除以所述I粒子的荧光粒子的平均荧光亮度，求出荧光粒子数，将该荧光粒子数除以通过工序(e)计数出的细胞数，算出每I个细胞的荧光粒子数。
9.如权利要求8所述的判定方法，其特征在于，利用荧光粒子具有的明灭性，来确定I粒子的突光粒子。
10.一种含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定系统，其特征在于，包括以下(A) ⑶， (A)含有经荧光物质标记的抗体作为成分的医药品中的抗体； (B)激发光照射装置； (C)获得荧光图像的装置； (D)用于获得荧光图像的带通滤波器。
11.如权利要求10所述的判定系统，其特征在于，含有抗体作为成分的医药品中的抗体是识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。
12.如权利要求11所述的判定系统，其特征在于，癌症的增殖控制因子或转移控制因子是HER2，所述HER2是人上皮生长因子受体2。
13.如权利要求10 12中任一项所述的判定系统，其特征在于，进一步包括(E)获得细胞核荧光图像的带通滤波器。
14.如权利要求10 13中任一项所述的判定系统,其特征在于,突光物质为突光粒子。
15.如权利要求14所述的判定系统，其特征在于，荧光粒子为量子点荧光粒子。
全文摘要
本发明提供了通过生物体组织中定量的组织染色法对作为曲妥珠单抗等抗体医药的有效成分的抗体、有效成分的用于靶向靶标部位的抗体识别的蛋白质进行高精度定量，而进行的含有所述抗体作为成分的医药品的治疗有效性的判定方法。本发明使用下述组织染色方法，判定含有抗体作为成分的医药品的有效性，所述组织染色方法包括如下工序用荧光物质标记含有抗体作为成分的医药品中的抗体、使该经荧光标记的抗体与组织试样接触的工序；向所述抗体接触的组织部位照射激发光、获得荧光图像的工序；获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像的工序；进行图像处理、从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度、获得校正荧光图像的工序；对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数的工序；计算测量1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度的工序；算出每1个细胞的荧光粒子数的工序。
文档编号G01N33/536GK103154741SQ20118004223
公开日2013年6月12日申请日期2011年8月26日优先权日2010年9月17日
发明者宫下穰, 权田幸祐, 大内宪明, 武田元博申请人:国立大学法人东北大学

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含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法