专利名称：测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法。
背景技术：
三聚氰胺(melamine)又称三氨三嗪，简称三胺，是一种重要的氮杂环有机化工原 料，白色无味结晶粉末。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂，在部分亚洲国家，它 也被用于制造化肥。三聚氰胺是一种禁止用于宠物食品及动物饲料的化学物质，动物食用 后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡。2007年3月美国FDA因为部分宠物生病甚至死亡而 下令回收近100个品牌的宠物食品后，人们才开始高度关注三聚氰胺进入食品供应链的问 题。2008年8月，国内上千名婴幼儿因长期饮用三鹿奶粉，而出现肾结石病症，经检测发现 奶粉中含有大量的三聚氰胺，调查发现奶户往不合格奶源中添加此化学物质。由于三聚氰 胺分子中含有大量氮元素，而普通的全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质含量时不能排除 这类伪蛋白氮的干扰，因而有向食品中添加这种化工原料的违法行为，以提高产品中蛋白 质含量。中国政府近期宣布禁止在食品中添加三聚氰胺。 关于食品尤其是奶粉、鲜奶、酸奶等奶制品中三聚氰胺含量的测定方法，目前没有 相关国家标准。 南昌高专学报2007年第6期"食品及饲料中三聚氰胺残留量液相色谱检测方法的 研究" 一文中，蛋白粉等食品用乙腈溶液提�。宋啬频仁称吩嫌眉状既芤禾崛�。乙腈 与甲醇均属易挥发、毒性大的有机试剂，对环境污染严重，对操作人员�：Υ�。奶粉等样品 基质复杂，会有干扰物也被萃取到乙腈或甲醇中，会干扰测定。由于三聚氰胺显弱碱性，易 发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。液相 色谱紫外检测器检测食品尤其奶制品时，该检测器对三聚氰胺的水解产物不易判定，这样 计算结果时，三聚氰胺的真实含量就会损失，甚至检不出。 新颁布的农业部标准NY/T1372-2007建立了饲料中三聚氰胺的高效液相色谱测 定法和气相色谱质谱联用测定法，以及北京艾杰尔科技有限公司的三聚氰胺的样品前处理 和检测方法中，除了液相色谱紫外检测器存在的缺点外，还存在以下不足样品前处理方法 针对的是饲料样品；奶粉等奶制品用该提取液1% (质量百分浓度，下同)三氯乙酸水溶液 提取后，以8000r/min离心得不到澄清的离心液，以至影响后续步骤的测定。现有方法中用 PCX小柱净化，三聚氰胺的水解产物不能富集到PCX小柱上，这就造成测定结果大量损失。 因而日常监测饲料中三聚氰胺时，常常会误认为不含有三聚氰胺。小柱的使用有活化、富 集、淋洗、脱附几步，需花费较长的提取时间。 另有液相色谱_质谱联用法(HPLC-MS)和液相色谱_串联质谱法(HPLC-MS/MS)。 质谱方法均存在仪器昂贵，操作人员需要专门培训，仪器检测时间长的缺点。例如一台液 相串极质谱(HPLC-MS/MS)需260万 280万人民币，一台液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS) 需150万 200万人民币，一台气相色谱质谱联用仪(GC-MS)需100万人民币左右，这些上 百万的昂贵仪器不易普及到县级市质量检测部门及中小型食品制造企业，仪器的维护和开
3机消耗的试剂器材均价格不菲。气相色谱_质谱检测方法还存在提取过程冗长，需要衍生 的缺点，衍生试剂不易买到，且该方法衍生结果不稳定。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色 谱法，它能克服现有技术的上述缺点。 —种测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法，其特征在于(1) 样品取样，(2)用提取液提取样品中的三聚氰胺，(3)用沉淀剂沉淀样品提取液中的蛋白 质，(4)离心分离提取液中的上清液，(5)净化过滤上清液，(6)设定二极管阵列检测器液相 色谱仪的仪器方法，(7)对三聚氰胺和它的水解产物的辨认，(8)制备标准曲线得出分析方 法的回归方程，(9)用液相色谱仪测定样品提取液中三聚氰胺，(10)计算出样品中的三聚 氰胺含量。 本发明使用0. 2-0. 3%三氯乙酸提取液，三聚氰胺不会大量水解，杂质少，测定干 扰�。怀恋淼鞍椎氖约帘阋耍沂褂昧可伲恋硇矢撸杉跎偈约炼圆僮魅嗽钡奈：投� 环境的污染，可省略或縮短去除样品中脂肪的过程，简化了净化过程，节省了耗材，縮短了 提取时间；三聚氰胺和它的水解产物均可检测到，检测过程操作简便快速，仪器试剂便宜易 于推广，适合大量样品的测定。
具体实施例方式
本发明由下述步骤组成 1样品取样取固体样品奶粉5. 0g。该奶粉可改为蛋白粉、豆粉、米粉、淀粉或面 粉，也可以改用液体样品鲜奶，该鲜奶可改为酸奶、乳饮料或蛋白饮料。 2用提取液提取样品中的三聚氰胺所述的提取液为0. 2-0. 3%三氯乙酸水溶液， 提取时，将5.0g奶粉固体样品加入38ml 0.3X三氯乙酸水溶液；超声提取20min。使用 0.3%三氯乙酸提取液，对不同的样品，均可使提取液的酸度不会过高，这样三聚氰胺不会 大量水解，提取后的提取液还可以用气相色谱-质谱确认，扩大了提取后的提取液的适用 范围，使其适合有气相色谱-质谱仪的实验室检测；现有的检测方法使用1%三氯乙酸提取 液，会使其酸度过高，造成三聚氰胺大量水解；并且三聚氰胺与衍生剂衍生后才能被气相色 谱-质谱仪检测，三聚氰胺大量水解后就无法衍生，造成检测灵敏度下降，縮小了样品提取 液的适用范围。 3用沉淀剂沉淀样品提取液中的蛋白质所述的沉淀剂为乙酸锌和亚铁氰化钾， 两者的质量比例范围为2-3 : 1，沉淀时，将5.0g奶粉固体样品先加入5ml乙酸锌水溶液 (220g/L)，再加入5ml亚铁氰化钾水溶液(106g/L)，摇匀，放置片刻。用本沉淀剂沉淀样品 提取液中的蛋白，试剂使用量少，价格便宜，沉淀效率高，各用5ml沉淀剂就能将样品提取 液中的蛋白沉淀完全。现有方法中用乙腈或甲醇，挥发性大、毒性大，本方法减少了试剂对 操作人员的�：投曰肪车奈廴荆灰部朔思尤氪罅恳译婊蚣状际固崛∫禾寤龃螅辜� 测灵敏度下降的缺点。用样品加标回收率实验表明，用本沉淀剂不会造成三聚氰胺的损失， 沉淀蛋白完全，在3000r/min的离心机上离心可得到澄清溶液。 4离心分离沉淀蛋白后样品提取液中的上清液分离时，将样品提取液直接转入离心管，在离心机上以3000r/min离心10min。使用低速离心机，它的离心管装载液体不 要求质量完全相等，可以省略用天平称量的步骤，加快了分析速度，克服了现有方法中使用 10000r/min规格的离心机在8000r/min转速下离心，需要将装载液体的离心管在天平上称 重，使离心过程加长的缺点。 5净化过滤上清液取离心后的上清液，经0. 45 ii m水系滤膜过滤，使滤液直接进 液相色谱仪测定，简化了净化过程，现有方法使用PCX小柱或其他阳离子交换小柱净化，会 对提取液中三聚氰胺的提取造成损失，小柱的使用有活化、富集、淋洗、脱附几步，需花费较 长的提取时间；本方法由于用水相提取、沉淀效果好，净化过程不用小柱净化，直接取离心 的上清液经0. 45 m滤膜过滤，节省了耗材，縮短了提取时间。 6设定二极管阵列检测器液相色谱仪的仪器方法波长为233-235nm，开启波长扫 描功能，波长扫描范围为220nm 400nm ;色谱柱使用亲水性4. 6mmX 250mm， 5 y m ASB-C18 柱，柱温为38-40°C ;流动相为乙腈和缓冲溶液(1Ommol/L拧檬酸加10mmol/L庚烷磺酸钠 水溶液)，流动相乙腈和缓冲溶液的体积比是15 : 85或10 : 90，流速为0.9-1. lml/min， 进样量为10-20 iU。本方法使用带有二极管阵列检测器的液相色谱仪进行检测，仪器价格 便宜，易普及，克服了气相色谱-质谱联用仪及液相色谱-质谱联用仪价格昂贵、耗材昂贵、 不易普及、不好操作、人员需特殊培训的缺点。因三聚氰胺有水解产物，使用二极管阵列检 测器，可通过波长扫描获得三聚氰胺及其水解产物的最大吸收波长，再结合保留时间来找 到色谱图中水解产物峰，从而将三聚氰胺水解产物也计算入最终检测结果中，克服了用紫 外检测器只能用保留时间定性，会遗漏三聚氰胺水解产物，致使最终检测结果偏小或检测 不出的缺点。本方法将液相色谱仪二极管阵列检测器的检测波长设为233-235nm，这一波长 近似三聚氰胺的最大吸收波长，可以提高检测灵敏度。本方法进样量为10-20 iU，提高了对 样品的检测灵敏度；提取液在仪器上的测定时间短，每个样品上机测定仅用9-12分钟，适 于大量样品的测定。 7对三聚氰胺和它的水解产物的辨认为此先用标准品提取液作对照，取1. Oml浓 度为1. Omg/ml的三聚氰胺标准储备液，经提取、沉淀、离心、过膜净化操作后，取20. OiU上 述提取的标准溶液进入液相色谱仪测定，得到三聚氰胺及其两个或一个水解产物峰的保留 时间，用二极管阵列波长扫描得到三聚氰胺及其水解产物的最大吸收波长。本实施例中二 者最大吸收波长相同，均为233. 6nm，根据标准物质保留时间及最大吸收波长，在样品谱图 中找出待测物三聚氰胺及其水解产物峰。 8制备标准曲线得出分析方法的回归方程先配制三聚氰胺标准溶液，称取 100mg(精确到0. lmg)三聚氰胺标准品，用20% (体积百分数，下同)甲醇水溶液溶解，并 定容于100ml容量瓶中，该溶液浓度为lmg/ml，于4t:冰箱内储存，有效期3个月，此溶液 为标准储备液；用20%甲醇水溶液稀释标准储备液，配置浓度为0、1. 0、5. 0、10. 0、25. 0、 50. 0 ii g/ml的标准系列，分别取20. 0 iU各标准溶液进样，以标准溶液浓度对峰面积计算 回归方程，回归方程为A = 1. 119X 104+3 . 021X 10t，式中A是峰面积，C是样品提取液中三 聚氰胺的浓度，单位为g/ml。 9用液相色谱仪测定样品提取液中三聚氰胺在测定标准系列的条件下测定样品 提取液，以保留时间和最大吸收波长定性，多点校正外标法定量，将测得的三聚氰胺及其 水解产物的峰面积之和23000，代入上述回归方程，计算样品提取液中三聚氰胺的浓度是0. 391 g/ml。本方法将三聚氰胺水解产物也计算入检测结果中，克服了用紫外检测器只能用保留时间定性，会遗漏三聚氰胺水解产物，致使最终检测结果偏小或检测不出的缺点。
IO计算样品中三聚氰胺含量计算公式是X二CX50/m，式中X是样品中三聚氰胺的含量，单位为mg/kg， C是样品提取液中三聚氰胺的浓度，单位为P g/ml， m是称取样品质量，单位为g。计算得出该奶粉样品中三聚氰胺的含量为3.91mg/kg。该计算公式简便，易于理解，直接将稀释体积数代入公式中，使之更加直观，易于广大低层检验人员使用。
本发明对含脂肪很高的样品，需在提取样品中的三聚氰胺之前先去除脂肪，操作时，向该样品中加入乙醚，振荡，弃去乙醚，再另加入乙醚，振荡，再弃去乙醚。由于使用的乙醚效果好，节省了实验时间，且不影响结果测定。
权利要求
一种测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法，其特征在于(1)样品取样，(2)用提取液提取样品中的三聚氰胺，(3)用沉淀剂沉淀样品提取液中的蛋白质，(4)离心分离提取液中的上清液，(5)净化过滤上清液，(6)设定二极管阵列检测器液相色谱仪的仪器方法，(7)对三聚氰胺和它的水解产物的辨认，(8)制备标准曲线得出分析方法的回归方程，(9)用液相色谱仪测定样品提取液中三聚氰胺，(10)计算出样品中的三聚氰胺含量。
2. 如权利要求1所述的测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法，其 特征在于所述的提取液为0. 2-0. 3%三氯乙酸水溶液。
3. 如权利要求1所述的测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法，其 特征在于所述的沉淀剂为乙酸锌和亚铁氰化钾，两者的质量比为2-3 : 1。
4. 如权利要求1所述的测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法，其 特征在于所述的回归方程为A = 1. 119X 104+3. 021X 104C。
5. 如权利要求1所述的测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法，其 特征在于所述的用提取液提取样品中的三聚氰胺之前去除样品中的脂肪。
全文摘要
一种测定食品中三聚氰胺的二极管阵列检测器高压液相色谱法，其特征在于取样后用0.2-0.3％三氯乙酸提取三聚氰胺，用沉淀剂沉淀提取液中的蛋白质，离心分离提取液中的上清液，净化过滤，设定二极管阵列检测器液相色谱仪器方法，对三聚氰胺及其水解产物辨认，制备标准曲线得出分析方法的回归方程，用液相色谱仪测定三聚氰胺，计算三聚氰胺含量。本发明使用的0.2-0.3％三氯乙酸提取液提取效果好，测定干扰�。挥靡宜嵝亢脱翘杌爻恋淼鞍祝恋硇矢撸廴旧伲蝗矍璋芳捌渌獠锞杉觳獾剑峁既罚靡瞧魇约帘阋艘子谕乒悖屎洗罅垦返牟舛�。
文档编号G01N1/34GK101713767SQ20081014032
公开日2010年5月26日 申请日期2008年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者郝文 申请人:郝文
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