专利名称：生物芯片时分复用多荧光同时检测方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明属于生物光学检测领域，特别是属于一种生物芯片的检测方法及装置。
背景技术：
现有生物芯片检测方法主要有CCD成像法和激光共聚焦扫描法两种。
CCD成像法是用激发光源同时照射生物芯片，在检测端用滤光片滤除激发光，只让荧光通过，并通过成像系统在CCD上成像，由CCD记录二维荧光信号。CCD成像法一次测量可以得到生物芯片上一块面积的信息，因此其特点是检测速度快。缺点是横向分辨率比较低；为提高横向分辨力，需要提高成像系统的放大倍数，因此视场很�。匆淮尾饬康男酒婊闲。毙枰饬康男酒婊洗笫保椭荒芏啻畏挚椴饬浚缓笃唇悠鹄�。分块扫描实际上是通过机械运动方式使芯片与成像系统做相对运动，但是由于机械定位误差，将形成扫描图象的拼接误差。所以这种方法不适用于高密度生物芯片检测。另一方面，CCD灵敏度远低于光电倍增管，因此检测灵敏度也是比较低的。如2003年8月13日公开，申请号为02112626.7的中国专利，生物芯片荧光检测扫描装置，其主要由激光激发光路、荧光接收光路和放置生物芯片的X-Y平台及支架所组成。激光激发光路中的两个激光束通过合光棱镜到达同光路，穿过中空全反镜中心的通孔后，经激光聚焦镜聚焦于生物芯片上的一个点，激光激发光路和荧光接收光路通过中空全反镜和荧光分色镜分离，通过X-Y平台的二维运动，获得多个生物芯片上的二维荧光图像。
在激光共聚焦扫描法中，使用激光作为激发光，通过光学系统将激光会聚，生物芯片放置在焦平面上；然后使生物芯片做二维扫描，激光照射到荧光物质时，将产生荧光，由光学系统搜集荧光，最后通过光电倍增管将荧光信号转换为电信号。在激光共聚焦扫描法中，对生物芯片是逐点扫描的，由于生物芯片放置在焦平面上，因此激发光的光斑尺寸是非常小的，所以横向分辨率比较高。而且通过在接收端设置一共轭针孔，可以消除焦平面以外的杂散光的干扰，检测灵敏度也比较高。激光共聚焦扫描法已成为高密度生物芯片主要的检测方法。
在实际应用中，对于不同的探针需要采用不同的荧光物质来标记，目前使用广泛的荧光物质主要有CY3、CY5荧光染料，它们的激发光波长以及产生的荧光波长是不同的，因此检测仪器应能对不同荧光物质进行激发，并检测相应的荧光信号。此外，为提高芯片检测的重复性和可靠性，一块生物芯片同时用多种荧光物质进行标记，这就要求检测仪器能同时检测多种荧光信号。目前的激光共聚焦生物芯片扫描仪，对多种荧光的检测有两种方法。一种是采用一套接收系统(包括共轭针孔、光电倍增管等)，但要进行多次扫描，每次扫描只能对一种荧光物质进行激发、检测相应的荧光信号，这种方法耗时较多。另一种方法是，仪器配制多套接收系统，可同时对多种荧光物质进行激发并检测相应的荧光信号，缺点是需要配制多套接收系统，仪器调试工作量大，成本高，维护困难。
发明内容
本发明就是要解决现有生物芯片激光共聚焦扫描仪同时检测多种荧光存在的技术问题，提供一种可同时对多种荧光物质进行激发并检测相应的荧光信号的方法及装置。它的特点在于，只需配制一套接收系统，仅需一次扫描即可实现对多种荧光物质的激发和对荧光信号的检测，检测耗时少，仪器成本低，仪器维护简单。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下一种生物芯片时分复用多荧光同时检测方法，基于包含有脉冲信号发生器、激光器、反射全息带阻滤光片、显微物镜、载波片、二维扫描平台、聚焦透镜、针孔、光电倍增管的生物芯片激光共聚焦扫描仪，其特点是，方法步骤为1、器内设置多个用于激发不同荧光物质的激光器及相应的反射全息带阻滤光片；2、对上述的多个激光器的所发出的光进行脉冲调制，使各激光器输出为具有相同重复频率、脉冲宽度和具有不同相位差的光脉冲；3、各个激光器所发出的经脉冲调制后的具有相同重复频率、脉冲宽度和具有不同相位差的光脉冲经准直后使用各自的反射全息滤光片进入同一测量光路，对标记有多种荧光物质的生物芯片进行轮流激发，产生荧光信号；4、不同相位的荧光信号由显微物镜收集并转换为平行光，经过滤除掉散射光的滤光片后，再经聚焦透镜聚焦，并通过位于焦点的针孔，消除非焦面上的杂散光，进入光电倍增管转换为一系列对应不同相位荧光信号脉冲电信号即复用的荧光信号；5、复用的荧光信号通过乘法器分别与相对应的各激光器的调制脉冲相乘，分别得到各自激发的荧光信号，实现复用的荧光信号的解复用；6、各荧光信号输入到多信道A/D转换器，采集数据读入到计算机；在时分复用多荧光同时检测整个过程中，生物芯片由计算机控制进行二维扫描。
所述的对多个激光器的所发出的光进行脉冲调制方法，用半导体激光器作为激发光源，激光的调制通过直接调制激光器驱动电流实现，激发光源采用包括He-Ne激光器的其它类型激光器，激光的调制通过斩波器来实现。
采用述方法的生物芯片时分复用多荧光同时检测装置，它包括脉冲信号发生器、激光器、反射全息带阻滤光片、显微物镜、载波片、二维扫描平台、聚焦透镜、针孔、光电倍增管，其特点是，所述的激光器为多个激光器，其中一个激光器直接和脉冲信号发生器连接，其余的是通过相应的延时器和脉冲信号发生器连接，所述的多个激光器的输出经相应配置的反射全息带阻滤光片后进入由显微物镜、载波片、二维扫描平台、聚焦透镜、针孔、光电倍增管组成的同一测量光路，光电倍增管输出端分别和根据荧光物质种数相应配置的乘法器相连接，其中一个乘法器的输入端直接和脉冲信号发生器连接，其余乘法器输入端和相应配置的延时器输出端连接，所述的多个乘法器的输出端连接A/D采集卡，A/D采集卡连接计算机，计算机和二维扫描平台相连接。
本发明针对现有生物芯片激光共聚焦扫描仪同时检测多种荧光存在的问题，给出一种可同时对多种荧光物质进行激发并检测相应的荧光信号的方法及装置，特点在于只需配制一套接收系统，仅需一次扫描即可实现对多种荧光物质的激发和对荧光信号的检测，检测耗时少，效率高，仪器成本低，仪器维护简单，符合实际需要，有利于生物芯片技术的普及应用。
图1是生物芯片时分复用多荧光同时检测装置结构图；图2是激发光光脉冲时序图；
图3是解复用示意图；图4工作流程图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。
本实施例是一个可对标记CY3和CY5两种荧光物质的生物芯片同时检测的方法及装置。CY3荧光物质的吸收峰值波长约为530nm，因此使用波长为532nm的半导体激光器泵浦倍频激光器作为激发光源，激发产生的荧光峰值波长为570nm。CY5荧光物质的吸收峰值波长约为630nm，因此使用波长为635nm的半导体激光器作为激发光源，激发产生的荧光峰值波长为670nm。半导体激光器具有极高的调制频率，可以满足实际调制需要。本实施例中用两种荧光物质的生物芯片，因此用两种相应的激光器。
如图1所示，脉冲信号发生器1输出脉冲电压信号，该脉冲电压信号一路输入到532nm激光器3的驱动电路作为调制信号，使532nm激光器3以脉冲方式工作。脉冲信号发生器1输出脉冲电压信号，同时输入到延时器2，将脉冲信号延时，然后输入到635nm激光器4的驱动电路作为调制信号，使635nm激光器4以脉冲方式工作。如图2所示，532nm激光器3输出光脉冲20和635nm激光器4输出光脉冲30序列在时序上是不同的，脉冲的重复频率f(f＝1/T)至少大于直流工作情况下荧光信号频率的二倍，以保证不丢失信息。脉冲的重复周期T、脉冲宽度τ、两脉冲序列时延td是可以根据芯片点样密度等具体情况进行调节。
532nm激光器3和635nm激光器4输出的准直光束，分别入射到532nm反射全息带阻滤光片5，635nm反射全息带阻滤光片6上，经532nm反射全息带阻滤光片5，635nm反射全息带阻滤光片6反射，进入到显微物镜7，激发光被会聚，焦点位于载波片8即生物芯片的前表面，激发出荧光。在测量过程中，生物芯片8由二维扫描平台9带动，进行二维扫描。
荧光及散射激发光由显微物镜7搜集并转换为平行光，峰值波长为570nm和670nm的两种荧光及部分散射激发光透过532nm反射全息带阻滤光片5，635nm反射全息带阻滤光片6后，散射激发光被532nm反射全息带阻滤光片10，635nm反射全息带阻滤光片11进一步滤光，而荧光通过532nm反射全息带阻滤光片10、635nm反射全息带阻滤光片11。荧光由聚焦透镜12会聚，通过放置于焦点处的针孔13，而杂散光则不能通过针孔13。通过针孔13的峰值波长为570nm和670nm的两种荧光照射在光电倍增管14上，转换为电信号。电信号为一系列脉冲，不同时隙对应不同的荧光信号，在此称为复用的荧光信号。
由光电倍增管14输出的复用的荧光信号脉冲序列输入到两个乘法器15、16，分别与各激光器的调制脉冲相乘，如图3所示，由于时序的对应关系，可分别得到各自激发的荧光信号，而不包含另外一种荧光信号，即实现了复用的荧光信号的解复用。
各荧光信号输入到多信道A/D采集卡17，采集数据读入到计算机18。在以上过程中，计算机18通过二维扫描平台控制器19控制二维扫描平台9工作，对生物芯片由进行二维扫描。二维扫描平台控制器19输出的x方向驱动脉冲输入到A/D采集卡17，作为数据采集触发信号。
本发明的工作流程，如图4所示，检测之前，首先设置扫描行数N、扫描步距、扫描范围、扫描速度；然后开始X方向行扫描，该行扫描结束时，由二维扫描平台控制器发送扫描结束信息；计算机读取到该结束信息后，在Y方向移动一个扫描步距，然后开始另一行扫描；待全部扫描完成后，将暂存在计算机内存中的数据保存到计算机硬盘中。在扫描过程中，X方向的正程扫描和逆程扫描均是有效的行扫描。将数据文件转换为图象文件时，需将逆程扫描数据反转，以保证芯片位置与数据的对应关系。
本发明的方法还可实现2种以上荧光的时分复用同时检测。此外，激光器增加直流工作方式，通过切换激光器，可以只对一种荧光进行检测。当激发光源为其它类型激光器时，可采用斩波器来实现脉冲调制，只要保证各激光器光脉冲的时序关系即可。
权利要求
1.一种生物芯片时分复用多荧光同时检测方法，基于包含有脉冲信号发生器、激光器、反射全息带阻滤光片、显微物镜、载波片、二维扫描平台、聚焦透镜、针孔、光电倍增管的生物芯片激光共聚焦扫描仪，其特征在于，方法步骤为(1)在仪器内设置多个用于激发不同荧光物质的激光器及相应的反射全息带阻滤光片；(2)对上述的多个激光器的所发出的光进行脉冲调制，使各激光器输出为具有相同重复频率、脉冲宽度和具有不同相位差的光脉冲；(3)各个激光器所发出的经脉冲调制后的具有相同重复频率、脉冲宽度和具有不同相位差的光脉冲经准直后使用各自的反射全息滤光片进入同一测量光路，对标记有多种荧光物质的生物芯片进行轮流激发，产生荧光信号；(4)不同相位的荧光信号由显微物镜收集并转换为平行光，经过滤除掉散射光的滤光片后，再经聚焦透镜聚焦，并通过位于焦点的针孔，消除非焦面上的杂散光，进入光电倍增管转换为一系列对应不同相位荧光信号的脉冲电信号即复用的荧光信号；(5)复用的荧光信号通过乘法器分别与相对应的各激光器的调制脉冲相乘，分别得到各自激发的荧光信号，实现复用的荧光信号的解复用；(6)各荧光信号输入到多信道A/D转换器，采集数据读入到计算机；在时分复用多荧光同时检测整个过程中，生物芯片由计算机控制进行二维扫描。
2.根据权利要求1所述的生物芯片时分复用多荧光同时检测方法，其特征在于，所述的对多个激光器的所发出的光进行脉冲调制方法，用半导体激光器作为激发光源，激光的调制通过直接调制激光器驱动电流实现，激发光源采用包括He-Ne激光器的其它类型激光器，激光的调制通过斩波器来实现。
3.一种实施权利要求1所述方法的生物芯片时分复用多荧光同时检测装置，它包括脉冲信号发生器、激光器、反射全息带阻滤光片、显微物镜、载波片、二维扫描平台、聚焦透镜、针孔、光电倍增管，其特征在于，所述的激光器为多个激光器，其中一个激光器直接和脉冲信号发生器连接，其余的激光器通过相应配置的延时器和脉冲信号发生器连接，所述的多个激光器的输出经相应配置的反射全息带阻滤光片后进入由显微物镜、载波片、二维扫描平台、聚焦透镜、针孔、光电倍增管组成的同一测量光路，光电倍增管输出端分别和根据荧光物质种数相应配置的乘法器相连接，其中一个乘法器的输入端直接和脉冲信号发生器连接，其余乘法器输入端和相应配置的延时器输出端连接，所述的多个乘法器的输出端连接A/D采集卡，A/D采集卡连接计算机，计算机和二维扫描平台相连接。
全文摘要
本发明公开了一种生物芯片时分复用多荧光同时检测方法及装置，方法步骤为在扫描仪内设置多个激发不同荧光物质的激光器及相应的反射全息带阻滤光片；对激光器脉冲调制，调制后的光脉冲准直后经各自的滤光片进入同一测量光路，对多种荧光物质的生物芯片进行轮流激发，产生不同相位的荧光信号；荧光信号经收集、聚焦、通过针孔后进入光电倍增管，转换为对应不同相位荧光信号的脉冲电信号即复用的荧光信号；该信号通过乘法器得到各自激发的荧光信号，实现其解复用；各荧光信号经A/D转换，输入到计算机，由计算机对生物芯片二维扫描。本发明采用生物芯片激光共聚焦扫描仪和时分复用方法，系统只需配制一套接收系统，一次扫描即可实现对多种荧光物质的激发和对荧光信号的检测。
文档编号G01N21/64GK1588005SQ20041006625
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月10日 优先权日2004年9月10日
发明者马军山, 袁武, 付东翔, 侯琳琳, 陈家璧 申请人:上海理工大学
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