专利名称:一种胱抑素c检测试剂盒及其制备方法
技术领域:
本发明属于生物医药技术领域,具体地说涉及一种检测人胱抑素C的检测试剂盒。
背景技术:
1983年首次在鸡蛋清中分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,后被命名为胱抑素C。是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,也被称为Y-微量蛋白及Y-后球蛋白,广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中,是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质,分子量为13.3KD,由122个氨基酸残基组成,可由机体所有有核细胞产生,产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除,是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物,并在近曲小管重吸收,但重吸收后被完全代谢分解,不返回血液,因此,其血中浓度同肾小球滤过决定,而不依赖任何外来因素,如性别、年龄、饮食的影响,是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。目前已知的测定胱抑素C的方法有放射免疫测定法、荧光免疫测定法、时间分辨荧光免疫测定法、酶联免疫测定法。这些方法具有操作繁琐、耗时长、过度浪费资源的缺点,不适于常规检验。
发明内容
本发明的目的是提供一种胱抑素C的检测试剂盒。该试剂盒可直接应用于全自动生化分析仪上,结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。本发明的另一目的是提供上述检测试剂盒的生产制备及使用方法。为实现上述目的,本发明提供的试剂盒组成为
试剂Rl :缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白;
试剂R2 :缓冲液、结合有胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四 乙酸钠、牛血清白蛋白。本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下
(a)按下列比例配制好试剂
试剂Rl
Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I,
叠氮钠1-5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200-220mmol/L
结合有胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子 3. 5-5% (v/v)吐温-20l-5mmol/L
叠氮钠0. 5-3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L
(b)将试剂与待测样本按一定比例混合,使其完全反应;
(c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值;
Cd)根据吸光度变化值计算出样本中胱抑素C的浓度。
具体实施方式
下述实施例是为了更详细的解释本发明,但不应理解为本发明局限于此。实施例I :
本发明的试剂盒举例是双试剂,其中
试剂Rl
Tris 缓冲液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
叠氮钠5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L
结合有胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v)
吐温 _20Smmol /I,
叠氮钠3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。实施例2 :试剂盒使用方法。I.试剂准备,试剂为液体双试剂,开瓶即用,其中
试剂Rl
Tris 缓冲液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
叠氮钠5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L
结合有胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v)
吐温 _20Smmol /I,
叠氮钠3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自动生化仪参数设置
(a)检测温度37°C
(b)检测波长主波长为550nm;副波长为700 nm ;
(c)反应时间8分钟,其中,温育时间5分钟,反应时间I分钟,检测时间2分钟。3.检测步骤(全部在全自动生化分析仪中完成)
(a)取240ii L试剂I和3 ii L血清样本混匀; (b)将混匀后的溶液在37°C温育5分钟;
(c)添加60ii L试剂2,反应I分钟后,在550nm条件下检测2分钟的吸光度变化。4.通过吸光度变化的计算出胱抑素C的浓度。本发明具有的优点
该试剂盒结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。所需检测仪器(生化分析仪)在各大医院和检测中心普遍使用。
权利要求
1.一种胱抑素C检测试剂盒,其组成为试剂R1、试剂R2,其中 a、试剂Rl 包括200-220mmol/L Tris 缓冲液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 叠氮钠、l-5mmol/L乙二胺四乙酸钠、l_5mmol/L牛血清白蛋白; b、试剂R2200-220mmol/L Tris缓冲液、结合有胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子、l_5mmol/L 吐温 _20、0. 5-3 mmol/L 叠氣纳、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸纳、l-5mmol/L 牛血清白蛋白。
2.权利要求I的试剂盒,其特征在于试剂R2中的胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子的制备方法为10. 5mg/ml的胱抑素C单克隆抗体与10%的乳胶颗粒(直径50_100nm),加入到200-220mmol/L Tris缓冲液中,震荡反应4小时,离心去上清,再用200-220mmol/L Tris缓冲液稀释至0. 5%,并加入0. 1-0. 3 mmol/L叠氮钠。
3.上述试剂盒的制备和操作方法,主要步骤为 (a)按下列比例配制好试剂 试剂Rl Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 叠氮钠1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ; 试剂R2 Tris 缓冲液 200-220mmol/L 结合有胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子 3. 5-5% (v/v) 吐温-20l-5mmol/L 叠氮钠0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L (b)将试剂与待测样本按一定比例混合,使其完全反应; (c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值; Cd)根据吸光度变化值计算出样本中胱抑素C的浓度。
4.权利要求3的方法,其特征在于,被测样品与试剂比例应控制在I:60到I :80之间。
5.权利要求3的方法,其特征在于,反应温度为37(±1) °C。
6.权利要求3的方法,其特征在于,反应时间为8-10分钟。
7.权利要求3的方法,其特征在于,用半/全自动生化分析仪检测的主波长为550nm,副波长为700 nm。
全文摘要
一种胱抑素C的检测试剂盒。试剂盒盒体内包括试剂R1缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白;试剂R2缓冲液、结合有胱抑素C单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白。通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列反应,再将反应物置于半/全自动生化分析仪下,检测主波长550nm处吸光度变化的速度,从而测算出胱抑素C的浓度大小。本试剂盒具有准确、稳定、方便的优点。
文档编号G01N21/31GK102749458SQ20121026191
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者张雷 申请人:北京恩济和生物科技有限公司