专利名称：一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法
技术领域：
本发明属于生命科学技术领域，涉及一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法，具体来说，涉及一种将同位素示踪、离心和超滤技术相结合用于测定多肽药物与血浆蛋白的结合的方法。
背景技术：
药物进入血液后，一部分呈非结合的游离状态存在，一部分与血浆蛋白形成结合型药物，如弱酸性药物与白蛋白结合，弱碱性药物与α -酸性糖蛋白结合等。药物与血浆蛋白的结合会明显影响药物分布与消除的动力学过程，并降低药物在靶部位的作用强度。 大多数药物与血浆蛋白的结合处于动态平衡，存在饱和及竞争性抑制现象，其与药物之间的相互作用及作用机制等密切相关。药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总量的百分率，是药代动力学的重要参数之一。研究药物血浆蛋白结合率对新药评价及指导临床安全合理用药，尤其是对毒性药物的临床合理应用具有重要意义。目前，药物血浆蛋白结合率的研究方法主要包括平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、微透析法、高效亲和色谱法等。其中，平衡透析法是一种传统的方法，但该法所需平衡时间较长，血浆和缓冲液的PH值以及离子强度要严格控制，药物血浆蛋白结合率会受到稀释作用、Gibbs-Donnan效应以及体积迁移效应的影响，并且存在非特异性透析设备表面的药物吸附效应。而超滤法设备简单、操作方便、不受稀释效应和体积迁移的影响，尤其能实现血浆中游离药物和结合药物的快速分离，已被广泛应用于高通量的生物样品测定中。现今，许多化学药物和中药的血浆蛋白结合率的测定方法已较完善，常将上述方法与高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC-MQ、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)等分析技术结合。多肽类生物技术药物因生理活性强、疗效高而日益受到重视。但此类药物在结构上不同于传统药物，生物活性强，给药剂量�。谔迥诙糠治鍪贝嬖谔迥谝┪锱ǘ鹊停谠葱晕镏矢扇徘浚非按砝眩诒瓴灰籽罢业饶训�。常见的测定方法主要包括同位素示踪法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法、生物检定法、色谱法和质谱法等。其中，同位素示踪法是生物技术药物代谢动力学研究的主要手段之一，具有灵敏度高， 简便直观，检测迅速等特点，特别是适用于组织分布及排泄研究中。通常所使用的同位素包括125I、99mTc、3H、14C、35S等，而125I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单而最为常用。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法，该方法将同位素示踪、离心和超滤技术集成于一体，成功地运用到多肽生物药物蛋白结合率的测定方法中。实验表明，这种以同位素示踪法为主要定量手段的多肽类等生物技术药物血浆蛋白结合率测定方法能够成功地应用于重组人胸腺肽(rh-Ta 1)及重组人甲状旁腺素类似物PTHa(l-34)等多种多肽类药物的血浆蛋白结合率测定和研究。本发明提供的用于测定多肽药物与血浆蛋白的结合的方法包括以下步骤
(1)采用放射性同位素标记多肽药物的一部分；(2)将步骤(1)制备的部分被标记的多肽药物配制成一系列已知浓度的多肽药物血浆溶液，分别定量检测各已知浓度的多肽药物血浆溶液的放射性，并分别对应于多肽药物的浓度绘制标准曲线；(3)将步骤(1)制备的部分被标记的多肽药物配制成已知浓度的待测多肽药物血浆溶液，将其离心超滤，定量检测滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性，其中待测的多肽药物血浆溶液的浓度为多肽药物在提供血浆的受试动物的血药浓度峰值的士 10%的范围。例如，所述待测的多肽药物血浆溶液浓度的设置可根据多肽药物在动物药代动力学研究中的低、中和高三个剂量组给药后的血药浓度峰值，设计三个浓度(如，基本与峰浓度一致或变化幅度< 10% )；(4)根据标准曲线分别由滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性得出两者的多肽药物浓度，滤过溶液的多肽药物浓度为游离型多肽药物浓度，未滤过溶液的多肽药物浓度为与血浆蛋白结合的多肽药物浓度。在上述方法中，优选地，多肽药物为人胸腺肽和人甲状旁腺素。在上述方法中，步骤⑴中的放射性等同位素可以选自皿^“““！^^吨或3、，优选为125I。优选的标记方法为氯胺τ法或Iodogen法。优选地，加入0. 05g/ml海藻糖水溶液作为保护剂。在上述方法中，优选地，步骤( 和中的放射性以放射性计数来表示。在上述方法中，步骤(3)中的超滤膜为具有能够使游离型多肽药物滤过，而与血浆蛋白结合的多肽药物被截流的孔径的超滤膜，例如具有这样的孔径的纤维素膜或聚醚砜膜；优选地，所述离心超滤进行3次，前后两次离心超滤之间分别洗涤超滤膜，洗涤液分别进入滤过溶液和未滤过溶液。优选地，步骤(3)包括以下步骤A.测定不同剂量的多肽药物在提供血浆的受试动物的血药浓度峰值；B.依据各血药浓度峰值确定各个待测的多肽药物血浆溶液的浓度；C.分别将已知浓度的待测的多肽药物血浆溶液进行离心超滤，定量检测滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性。其中，更优选地，步骤A包括以下步骤a.给予提供血浆的受试动物不同剂量的多肽药物，所述多肽药物为经步骤(1)标记的多肽药物；b.定量检测对应于各剂量的受试动物血液的最大放射性，根据步骤( 绘制的标准曲线获得提供血浆的受试动物的血药浓度峰值。在上述方法中，步骤(4)还包括按照以下公式计算已知浓度的待测的多肽药物血浆溶液的血浆蛋白结合率，血浆蛋白结合率=未滤过溶液的浓度/(未滤过溶液的浓度+滤过溶液的浓度)X100%。具体来说，本发明提供的采用同位素示踪法结合超滤离心法测定药物血浆蛋白结合率的方法包括如下步骤1.采用125I等同位素标记多肽及其衍生物等生物技术药物，常用的标记方法包括氯胺T法和Iodogen法等。采用HPLC或凝胶过滤色谱等方法分离、纯化同位素标记物，收集所需样品峰，测定标记物的放化纯度和放射比活性。比较标记前后药物的生物活性的变化，以确保同位素标记后对药物活性无显著性影响。将收集到的标记物加入0. 05g/ml海藻糖水溶液作为保护剂。2.用血浆配制一定浓度的待测药物并掺入一定量放射强度的同位素标记待测药物示踪。根据给药后的血药浓度，将上述原液用血浆倍比稀释成系列标准溶液，用以制备标准曲线。各浓度经适当稀释处理后，在Y计数器上测定放射性计数(cpm)。以药物浓度为横坐标，cpm值为纵坐标进行线性拟合，用以计算待测样品浓度。3.根据血浆蛋白和药物的分子量选择合适截流的超滤膜，将被蛋白结合的药物截流在超滤膜前(未滤过溶液)，而未结合的游离药物则被离心穿过超滤膜进入到滤过溶液中。如超滤膜截流蛋白分子量过大，则同条件下易使部分小分子量蛋白及其结合的药物渗漏过膜，增大游离型药物的浓度，降低结合型药物浓度，使药物的血浆蛋白结合率偏低。4.根据不同剂量给药后的血药浓度峰值，设计多个不同浓度的待测药物进行蛋白结合试验。将一定放射强度的同位素标记待测药物掺入至待测药物中，此药物原液用血浆稀释至上述多个浓度，每个浓度至少重复测定3次。保温孵育。经用生理盐水适当稀释处理后，取一定量超滤离心得滤过溶液，并用等量生理盐水洗涤未滤过溶液数次，同条件离心， 将超滤膜反向离心得未滤过溶液。在Y计数器上分别对滤过溶液和未滤过溶液进行计数， 并根据标准曲线换算成浓度。按以下公式计算不同浓度的药物血浆蛋白结合率，并求算平均结合率。血浆蛋白结合率=滤过溶液中的药物量/(滤过溶液+未滤过溶液)中的药物量 X 100%目前，对多肽类生物技术药物的血浆蛋白结合的研究刚刚起步，国内外均未见文献报道，也无方法和技术借鉴。多肽类药物与传统化学药物相比，分子量相对较大、生物活性强、给药剂量小、血浆溶液黏度大、吸附性强，常规的分离方法如平衡透析及凝胶过滤等无法应用于多肽类药物。针对上述特点，我们改进了应用于化学药物分离的超滤法，优化了稀释倍数、洗涤次数和离心方法等条件。在本法建立时，我们发现如果血浆溶液稀释倍数过�。蝠ざ却螅芤褐械挠卫胍┪镂薹ǹ焖偻腹四ぃ环粗∈捅妒螅蛭薹ù锏酵凰乇昙欠ǖ募觳饬槊舳取６颐欠⑾郑紫炔舛ú煌亮康亩嚯囊┪镌谔峁┭氖苁远锏难┡ǘ确逯担僖谰莞餮┡ǘ确逯等范ǜ鞲龃獾亩嚯囊┪镅芤旱呐ǘ龋� 可以很好地解决这样的问题。此外，多肽类药物吸附性强，离心后易残留在超滤离心管管壁和超滤膜上，影响测定结果。我们采用了超滤膜“正向离心+洗涤”(指滤过溶液)和“反向离心+洗涤”(指未滤过溶液)相结合的技术，最大限度地减少了药物的吸附。同位素标记法以其高效、快速、直接、简便等特点广泛应用于多肽类药物药代动力学研究。但是，一般而言，药物血浆蛋白结合的研究包括分离游离型药物和结合型药物及药物浓度测定两个步骤。单纯采用同位素标记法不能实现游离型药物与结合型药物的分离；单纯采用离心/超滤法也无法实现多肽类药物的浓度测定。因此，本发明首次将所建立的同位素示踪、离心和超滤技术相结合的方法应用于多肽类生物技术药物血浆蛋白结合测定领域。对于以同位素示踪法为主要定量手段的药物而言，将同位素示踪与超滤离心两种方法有机结合，填补了该类药物血浆蛋白结合研究的空白，完善了药代动力学研究的试验技术和方法。具体而言，本发明公开的测定多肽类等生物技术药物血浆蛋白结合率的方法，是以掺入一定量同位素标记的待测药物配制系列标准曲线，以浓度为自变量对放射性计数cpm进行线性回归。根据不同剂量给药后的血药浓度峰值，设计多浓度血浆蛋白结合试验。以离心/超滤法分离血浆中的游离型药物和结合型药物，同位素示踪法测定滤过溶液和未滤过溶液中的cpm值，根据标准曲线计算药物的血浆蛋白结合率。本发明快速、灵敏、操作简便，尤适用于以同位素示踪法为主要定量手段的多肽类等生物技术药物血浆蛋白结合率的测定。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1为建立同位素示踪、离心和超滤技术相结合的方法用于测定多肽药物血浆蛋白结合流程图；图2为rh-T α 1的平均标准曲线(Z ± s , η = 3)。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例1本实施例利用本发明建立的同位素示踪、离心和超滤技术相结合的方法，测定了重组人胸腺肽α l(rh-Ta 1)在大鼠血浆中的药物蛋白结合率。具体分析方法如下1.采用氯胺T法(Ch-T)标记重组人胸腺肽α 1 (rh_T α 1)，制备125I-rh_T α 1冻干品。rh-Tal由深圳海王药业有限公司生产，批号为20050301，样品为白色冻干粉针，纯度为98. 51%，含量为1.5mg/瓶，试验前样品于4°C下保存。将5yg浊1(11加到2(^1
0.IM ρΗ7· 4的磷酸缓冲液中，终浓度为0. 25 μ g/ μ 1。然后加入2. 25mCi的Na125I和15 μ g 的Ch-T(0. 5 μ g/μ 1)，反应 Imin后，立即加入 30 μ g 的Na2S2O5(1 μ g/μ 1)终止反应。在C18 柱上分离纯化反应混合物得到125I-标记物，即用0. 三氟醋酸水溶液(TFA)-乙腈梯度洗脱(流速 lml/min)，程序如下0-10min 20% 乙腈，10_20min 30% 乙腈，20_25min 40% 乙腈，25-30min 50%乙腈。收集单碘标记的125I_rh_T α 1峰。测定其放射比活度为560mCi/ mgQ0720MBq/mg)，放化纯度为98. 4%。向收集到的标记物中加入0. 05g/ml海藻糖水溶液冻干，于-20°C保存备用。采用T细胞活性测定法考察同位素标记对生物活性的影响，结果显示125I标记的rh-T α 1与未标记的rh-T α 1相比，平均保留的生物活性为82. 3%. HPLC 分析显示rh-T α 1标记前后保留时间分别为22. 60和23. 33min，表明标记前后对色谱行为无明显影响。2.用血浆将rh-T α 1配制成浓度为1800ng/ml的原液，并掺入少量125I_rh_T α 1 示踪。然后将其再用血浆系列稀释为900、300、90、30、9. 0和3. Ong/ml。各浓度的rh_T α 1血浆溶液再用生理盐水分别稀释10倍后，取ΙΟΟμ 1在γ计数器(DPC GAMMA-C12, Berthold, Germany)上测定放射性计数值(cpm)，结果见表1。在此浓度范围内(3 1800ng/ml), 药物浓度(Y)的对数与cpm(X)的对数呈直线相关(见图2)，其标准曲线方程为lg Y =
1.597+1. 006 Ig X, r = 1. 000。
表Irh-T α 1的平均标准曲线(X ± s , η = 3)
权利要求
1.一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法，该方法包括以下步骤(1)采用放射性同位素标记多肽药物的一部分；(2)将步骤(1)制备的部分被标记的多肽药物配制成一系列已知浓度的多肽药物血浆溶液，分别定量检测各已知浓度的多肽药物血浆溶液的放射性，并分别对应于多肽药物的浓度绘制标准曲线；(3)将步骤(1)制备的部分被标记的多肽药物配制成已知浓度的待测多肽药物血浆溶液，将其离心超滤，定量检测滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性，其中待测的多肽药物血浆溶液的浓度为多肽药物在提供血浆的受试动物的血药浓度峰值士 10%的范围内；(4)根据标准曲线分别由滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性得出两者的多肽药物浓度，滤过溶液的多肽药物浓度为游离型多肽药物浓度，未滤过溶液的多肽药物浓度为与血浆蛋白结合的多肽药物浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽药物为人胸腺肽和人甲状旁腺ο
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的放射性等同位素选自,、""^、礼叱或^^，优选为125L
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的标记方法为氯胺T法或Iodogen法。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入0.05g/ ml海藻糖水溶液作为保护剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤( 和(4)中的放射性以放射性计数来表示。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤C3)中的超滤膜为具有能够使游离型多肽药物滤过，而与血浆蛋白结合的多肽药物被截流的孔径的纤维素膜或聚醚砜膜；优选地，所述离心超滤进行3次，前后两次离心超滤之间分别洗涤超滤膜，洗涤液分别进入滤过溶液和未滤过溶液。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤C3)包括以下步骤A.测定不同剂量的多肽药物在提供血浆的受试动物的血药浓度峰值；B.依据各血药浓度峰值确定各个待测的多肽药物血浆溶液的浓度；C.分别将已知浓度的待测的多肽药物血浆溶液进行离心超滤，定量检测滤过溶液的放射性以及未滤过溶液的放射性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤A包括以下步骤a.给予提供血浆的受试动物不同剂量的多肽药物，所述多肽药物为经步骤(1)标记的多肽药物；b.定量检测对应于各剂量的受试动物血液的最大放射性，根据步骤( 绘制的标准曲线获得提供血浆的受试动物的血药浓度峰值。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)还包括按照以下公式计算已知浓度的待测的多肽药物血浆溶液的血浆蛋白结合率，血浆蛋白结合率=未滤过溶液的浓度/(未滤过溶液的浓度+滤过溶液的浓度)X100%。
全文摘要
本发明提供一种用于测定多肽药物与血浆蛋白结合的方法，该方法包括以下步骤采用放射性同位素标记多肽药物的一部分；将制备的部分被标记的多肽药物配制成一系列已知浓度的多肽药物血浆溶液，分别定量检测各已知浓度的多肽药物血浆溶液的放射性，并分别对应于多肽药物的浓度绘制标准曲线；将制备的部分被标记的多肽药物配制成已知浓度的待测多肽药物血浆溶液，将其离心超滤，定量检测滤过溶液以及未滤过溶液的放射性，其中待测的多肽药物血浆溶液的浓度的设置，可根据多肽药物动物药代动力学研究中的低、中和高三个剂量组给药后的血药浓度峰值，设计三个浓度(基本与峰浓度一致或变化幅度＜10％)。
文档编号G01N33/68GK102565414SQ20101059212
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者刘昌孝, 司端运, 姜凌, 宋紫辉, 张宗鹏, 张骏, 李春雨, 李铭, 王海荣, 申文晋, 蔡永明, 陈拯民 申请人:天津市新药安全评价研究中心, 天津药物研究院
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