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专利名称：镁(离子)诊断/测定试剂盒及镁(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子选择性电
极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。
镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分光光度法法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验室和自动分析。
比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(0CPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以及新近报道的2- (8，-羟基喹啉-5'-磺酸-7'-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)法。比色法操作简便，费用低，适合常规实验室应用。但存在试剂空白吸光度高，胆红素和其它阳离子的干扰，试剂稳定性差及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。
离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体(ETH7025)液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生理范围内)Ca2+最大干扰10%等不足。
离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括酸化稀释和过滤。Thie叩ont等使用该法对五种国际标准和技术学会用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35%,认为离子色谱法可作为总镁测定有价值的参考方法。
Mg2+的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。已应用于Mg"测定的酶学方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法;(D异柠檬酸脱氢酶法；⑦谷氨酰胺合成酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法检测镁结果准确，干扰影响�。�适合于自动化分析。由于酶试剂不断更新，使测定快速、灵敏，操作简便，因而具有较好的应用前景。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定镁(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的镁(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行镁(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明镁(离子)浓度测定方法原理如下-
葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶/1^^2+葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳二氧化碳+乙酰辅酶A十还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+
辅酶A+辅酶
其中，磷酸根可以用磷酸二氢盐取代。
这种方法应用需要镁离子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7丄1; EC2.7丄2)酶(偶)联丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)酶促反应连续监测/速率比色法。在镁离子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三磷酸反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算镁(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明镁(离子)诊断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
己糖激酶 6000 U/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
丙酮酸脱氢酶 10000 U/L
葡萄糖 20 mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
草酰乙酸 3mmol/L
磷酸根 3 mmol/L
乙酰辅酶A 3 mmol/L
本发明的镁(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢
酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂-试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A。试剂2
缓冲液、稳定剂、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶。还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A。试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、己糖激酶。还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定镁(离子)浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
己糖激酶 6000 U/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
丙酮酸脱氢酶 10000 U/L
葡萄糖 20 mmol/L腺苷三磷酸
3 mmol/L
草酰乙f 磷酸根
3 mmol/L 3 mmol/L
乙酰辅酶A 3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，
加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8
±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂的
体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，
检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
实施例二
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
腺苷三磷酸
草酰乙酸
磷酸根
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L乙酰辅酶A
3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
丙酮酸羧化 丙酮酸脱氢f
6000 U/L 8000 U/L 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8
±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2
分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
实施例三
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
腺苷三磷酸
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L草酰乙酸 磷酸根
乙酰辅酶A
3 mmol/L
3 mmol/L
3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸羧化f
丙酮酸脱氢
500 mmol/L
8000 U/L
10000U/L
试剂
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 己糖激酶
500 mmol/L
6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 观!J定镁(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8土 0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测镁(离子)样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器
12得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015;吸光度时 间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达 6.5mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6%;试剂测试的精密 度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.15 ± 0.04 AA/ mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的镁(离子)浓度测定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+腺苷二磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶 <u>丙酮酸脱氢酶</u> 丙酮酸+ 辅酶A+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出镁(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种镁(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括<formula>formula see original document page 2</formula>乙酰辅酶A 1——50 mmol/L其中，磷酸根可以用磷酸二氢盐取代。如果缓冲液使用磷酸缓冲液，则不需要加磷酸二氢钾。试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A组成双剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷 酸根、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、己糖激酶、丙酮酸羧 化酶、丙酮酸脱氢酶组成。还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸 脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A在试剂1 或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A组成多剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A组成；试剂2,由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙酮 酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、己糖激酶组成。还原型辅酶、 己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、 磷酸根、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂14000 mmol/L或0.1Q/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、乙酰辅酶A、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464367SQ200710192160
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司