专利名称：梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种梅毒特异性IgM抗体检测试剂，尤其是涉及一种采用胶体金 免疫层析技术(immunochromatography)进行的梅毒特异性IgM抗体快速检测试剂条。
背景技术：
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum, TP)引起的性传播 性疾�。洳≡迨敲范韭菪澹袈菪蹇�。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或 者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎 所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和 潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案， 梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒 依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患 #，胃中 60 力■^女gii#。 ( :He￡ilth Protection Agency Centre for Infections. International Encyclopediaof Public Health-Syphilis[M]. London, UK :Health Protection Agency Centre，2008，289-297)事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更 让人悲观。调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试 验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失 (参见:Luis J F, Felipe U S, Santa G C, et al. Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59 :123_126)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般 在受感染后5 7周产生(参见林月圆.TPPA和TRUST在梅毒诊断中的价值与临床相关 问题[J].放射免疫学杂志，2009，22 (3) :295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜 伏梅毒可能阴性。因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅 毒感染后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持
胃白勺TfC。 Martina H ^ ( #JAL :Martina H, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis [J]. DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61_66.)认为 TP-IgM 是 梅毒早期感染并活动的一项血清学标志，李步荣等(参见李步荣，贺军涛，张毅，等.梅 毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J],第四军医大学学报，2007,28(16) 1495-1497) 认为TP-IgM与TP-DNA —样，代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下， TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转 阳性，表明再次感染梅毒(参见Rawstron SA, Mehta S, Bromberg K, et al. Evaluation
3of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis [J], Sex Transm Dis，2004，31 (2) : 123-126)。尽管 TP-IgM 阴性不能完全排除传 染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染性。早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感 染兔睾丸获得，这种方法花费大、获得的TP量少、不纯(混有宿主蛋白)，与其他病原体存 在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相 继克�。刈榭乖τ糜诿范臼笛橐丫嚼丛蕉唷Ｄ壳把芯勘冉隙嗟腡P抗原有TPW7、 TPN47、TPNl5, TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重组 DNA 技术制备的重 组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。梅毒特异性抗体检测是梅毒确证试验，包括TPHA，TPPA, ELISA，FTA-ABS及 Western-blot等，其特异性均较高。然而，面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测 手段，还需要一种更简便快捷的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。
发明内容本实用新型的目的是提供一种梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条。本实用新型设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜(NC膜)、梅毒特异性IgM 抗体检测线、对照线和吸收垫。加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端 设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在 硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在 梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被 羊抗梅毒抗原TPNl7和ΤΡΝ47的IgG抗体。所述载体板可采用PVC板。 以下给出所述梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条的制备方法，包括 以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPm7、TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其 表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN472)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照 线处包被羊抗梅毒抗原TPW7和TPN47IgG抗体，晾干，所述抗人IgM特异性片段μ链单克 隆抗体的浓度为1 4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体由抗TPm7_IgG抗 体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL;三者点样量为IyL/ cm ；3)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4°C冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2% ；4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金IOm L，用0. lmol/L NaOH调至 pH5. 4，加 IOOyg 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 Im L 混勻，4°C、10000r/min 离心 lh， 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10m L，40C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至lmL，得胶体金标记的TPN17抗原。胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原； 将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标 记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的温 度可为37°C ；5)制备免疫层析检测条将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一 端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设 在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上； 在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包 被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM抗体胶 体金免疫层析检测试剂条。本实用新型提供了一种采用胶体金免疫层析技术建立梅毒特异性IgM抗体快速 检测试剂条，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM抗体的检测。检测 时所需的标本量极�。恍枰厥庖瞧鳎庋壑苯优卸两峁壹觳饧虮憧焖伲匾煨郧浚� 敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。
图1为本实用新型实施例的结构组成示意图。图2为实验结果模式示意图。在图2中，A为使用前的示意图，B为无效试验(产 品质量问题)，C为阴性结果，D为TP-IgM阳性结果；6为梅毒特异性IgM抗体检测线，7为 对照线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本实用新型作进一步的说明。参见图1，本实用新型实施例设有载体板1、加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜(NC 膜)4、梅毒特异性IgM抗体检测线6、对照线7和吸收垫8。加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜4和吸收垫8依次粘贴在载体板1上表面，加样 垫2的一端设在胶体金垫3的一端上，胶体金垫3的另一端设在硝酸纤维膜4的一端上，吸 收垫8的一端设在硝酸纤维膜4的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线6和对照线7依 次设在硝酸纤维膜4上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单 克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体。
5[0031]所述载体板采用PVC板。以下给出所述梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条的制备方法，包括 以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPm7、TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其 表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47 ；2)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照 线处包被羊抗梅毒抗原TPW7和TPN47IgG抗体，晾干；所述抗人IgM特异性片段μ链单克 隆抗体的浓度为1 4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体由抗TPm7_IgG抗 体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL;三者点样量为IyL/ cm03)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存备用；所述柠檬酸三钠的浓度为2%。4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金IOm L，用0. lmol/L NaOH调至 ρΗ5· 4，加 100 μ g 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 ImL 混勻，4°C、10000r/min 离心 lh, 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10m L，40C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至lmL，得胶体金标记的TPN17抗原。胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原。将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47 抗原混合，是胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5) 混合；所述烘干的温度为37°C。5)制备免疫层析检测条将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一 端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设 在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上； 在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包 被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM抗体胶 体金免疫层析检测试剂条。以下给出采用梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检测患者的临床 标本取待检标本(全血、血清、血浆、脑脊液)5 40 μ L，加样于梅毒特异性IgM抗体胶 体金免疫层析检测试剂条样品处，滴加100 μ L生理盐水，静置20min观察结果。只在检测条 对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区(T)及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果(见图2)。以下给出梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条的性能检定1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切 斜现象。2)阳性标本符合率用TP-IgM阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用梅毒 特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定 采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定的临床标本。3)阴性标本符合率用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清 的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。4)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征 性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。5)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征 性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。6)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。血清(或血浆)来自本申请人临床标本。7)交叉反应采用本梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，进行系统 性红斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系统疾病的检 测，未发现交叉反应。自身免疫系统疾病的血清来自本申请人临床确诊患者。8)稳定性检测应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检 测试剂条放置37°C 20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保 存，有效期为18个月。本实用新型的检测在一条梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条上进 行，通过以下两种方式实现梅毒特异性IgM抗体的检测方式一利用胶体金免疫层析技术，在硝酸纤维素膜上IgM检测线和对照线处分 别包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体和羊抗梅毒抗原TPW7和TPN47IgG抗体。将 已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPW7和TPN47以一定的比例混合后预包被在玻璃纤维 纸上，干燥处理，制备成金胶体垫，再辅以恰当的加样垫，组合梅毒特异性IgM抗体胶体金 免疫层析检测试剂条(组装方式见图1)。检测阳性样本时，样本中梅毒特异性IgM抗体与 胶体金标记的重组抗原TPN17和/或TPN47结合形成免疫复合物。由于层析作用，复合物 沿吸收垫的吸水纸方向向前移动。经过检测线时，①TP-IgM类免疫复合物与预包被的抗人 IgM单克隆抗体结合形成“AU-TPN17 (和/或TPN47)-特异性抗梅毒IgM抗体-抗人IgM单 克隆抗体-固相材料”夹心物而凝聚显色；②游离金标抗原则在对照线处与羊抗梅毒抗原 (TPN17和TPN47)抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。方式二，将方式一的包被抗原、抗体对调在硝酸纤维素膜上IgM检测线和对照线 处分别包被梅毒重组抗原(TPm7/TPN47组合)和羊抗鼠IgG抗体，将金标记的抗人IgM特 异性片段μ链单克隆抗体预包被在玻璃纤维纸上。以下给出具体实施例。实施例1在硝酸纤维素膜(NC膜)IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，
7在对照线处包被羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)抗体，室温晾干，密封室温保存备用。其中， 抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为lmg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47) IgG抗体由抗TPm7-IgG抗体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1 1混合，其终浓度为Img/ mL ；二者点样量为1 μ L/cm。将已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPN17和TPN47以体积比1 1混合后，均勻 地涂于玻璃纤维纸上，在37°C烘干，制备成金胶体垫，密封备用。将固相化的纤维膜与胶体 金结合的玻璃纤维、吸水纸等按一定顺序，通过PVC不干胶底板组合在一起，用切条机切成 一定宽度检测条。把梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条与干燥剂一起装入铝 箔袋中，机器封口，密封保存。取待检标本血清10 μ L，加样于梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条 加样区，同时滴加100 μ L生理盐水，静置20min观察结果。只在梅毒特异性IgM抗体胶体 金免疫层析检测试剂条对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有 一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无 效结果。(见图2)实施例2与实施例1相似，区别在于金胶体垫仅由TPW7组成，不含有TPN47。结果判断与 实施例1相同。实施例3与实施例1相似，区别在于金胶体垫仅由TPN47组成，不含有TPW7。结果判断与 实施例1相同。实施例4与实施例1相似，区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。实施例4性能验证试验按实施例1的方案制备梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测 试剂条，然后进行性能验证。1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，梅毒 特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条宽度在3士0. 1mm，无切斜现象。2)阳性标本符合率50份经FTA-ABS (德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgM阳性参 比血清，采用发明的梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检出TP-IgM阳性50 份，阳性标本符合率100%。3)阴性标本符合率50份梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本富士 株式会社)阴性参比血清，采用梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检测未检 出阳性标本，阴性标本符合率100%。4)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征 性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性TP-IgM参比高、中、低血 清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。5)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征 性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性TP-IgM参比高、中、低血 清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。[0077]6)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。7)交叉反应采用本梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，进行系统 性红斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 38)、免疫性肝炎(η = 40)等自身免疫系统疾病的检 测，未发现交叉反应。8)稳定性检测将梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条放置37°C 20 天后检测，以上各项指标无显著变化。
权利要求梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，其特征在于设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫；加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。
2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，其特征在于 所述载体板为PVC板。
专利摘要梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，涉及一种梅毒特异性IgM抗体检测试剂。提供一种梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条。试剂条设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫。加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。
文档编号G01N33/571GK201673156SQ20102019882
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者张忠英, 张长弓, 杨天赐, 林丽蓉 申请人:厦门大学附属中山医院
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