专利名称：双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的液体双试剂试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种测定血清或尿液中免疫球蛋白游离轻链的试剂。
背景技术：
免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称Ig)是具有抗体活性或化学结构与抗体类似的球蛋白统称，大量存在于正常人血清中，尿液中也有微量存在。Ig分子结构由两条重链 (Heavy chain, H链)和两条轻链(Light chain, L链)以及二硫键构成的“Y”型球蛋白。 人的免疫球蛋白根据其重链不同分为IgM、IgG、IgA、IgD、IgE，对应的重链依次为μ、γ、 α、δ、ε ；轻链分κ (kappa)和λ (lambda) 2种类型，任何一种免疫球蛋白都含有两条相同类型的轻链即κ型或λ型，人类总的κ (kappa)和λ (lambda)的比例约为2 1。免疫球蛋白轻链(κ或λ )是由浆细胞产生的一种小分子量(2. 2kD或4. 4kD)的蛋白质。健康人血中有近40%的游离轻链(Free light chain,FLC), κ FLC和λ FLC的含量分别为3 19mg/l和6 26mg/l，κ FLC/ λ FLC BP κ /λ正常比值在0.洸 1. 65之间。此外λ FLC较κ FLC更易通过二硫键形成二聚体，而后者通常保持单体状态。正常情况下游离轻链和重链的分泌是平衡的，而当浆细胞发生单克隆恶性增殖时，会产生大量未和重链结合的FLC，改变了 κ/λ比值。若比值>1.65则表明κ轻链过量，患者产生单克隆κ轻链；若比值<0.沈则是λ轻链过量，患者产生单克隆λ轻链。 FLC可自由通过肾小球滤过膜，在肾小管被重吸收回到血循环中，所以正常人尿中只有少量 FLC存在。当代谢失调或发生多发性骨髓瘤时，血中出现大量FLC，并由尿中排出，即产生所谓的本周氏蛋白(Bence-Jones protein，BJP，亦称M蛋白)。本周氏蛋白是迄今为止发现的第一个特殊的肿瘤标记物，可用来鉴定和监控包括多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、淀粉样变性(amyloidosis，AL)等多种B细胞恶性增殖疾�。哂薪细叩牧俅布壑�。近年来，随着多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)、淀粉样变性(amyloidosis， AL)等多种B细胞恶性增殖疾病研究的不断深入，临床上的诊断指标逐步由对血中免疫球蛋白的监测，到血或尿中轻链(总轻链，包括游离型及免疫球蛋白的结合型)的监测，再到目前倡导的针对血中游离轻链的监测并计算κ/λ比值。研究之所以得出这样一个结论， 主要有以下几点依据一、对病人血清中游离轻链的监测比传统的免疫球蛋白测定可以更快更好的作出诊断，原因是游离轻链的半衰期很短，平均只有2 6时，而免疫球蛋白的半衰期一般较长，IgG的半衰期更长达20-25天，是前者的上百倍。理论上游离轻链水平可以实时反映患者的病情及治疗效果；二、单一的针对尿液中游离轻链的测定不能够准确的对病情作出判断，原因是正常情况下，FLC升高在尿液和血清中可同步检测到，如果B细胞恶性增殖疾病患者中伴随肾衰情况下，尿液中轻链检测不到变化造成误诊，而血清中FLC的测定不会受到干扰，在诊断上更加准确。而且用尿做样本时需收集病人的M小时尿，样本量较大、稳定性较差。
尽管研究表明血中游离轻链监测的临床意义很高，但受以下几个方面影响，血清中游离轻链的测定发展较为缓慢。一、传统方法灵敏度较低，不能准确定量，如电泳法、免疫固定电泳法等，本发明中使用的双胶乳法具备了足够高的灵敏度；二、特异性抗体制备技术，血清中免疫球蛋白的量是游离轻链的几千倍，要准确测定血清中FLC的含量就要克服血清中大量免疫球蛋白的干扰，特异性抗体的选择十分重要，如果选择的抗体特异性差就会与完整免疫球蛋白的轻链发生交联反应造成结果失真。早期制备的针对游离轻链隐蔽位点抗体可特异性识别结合相应的游离轻链，但单克隆抗体效价较低，一般不适用于免疫比浊法(胶乳增强法是免疫比浊法的一类，即单克隆抗体不适于胶乳增强免疫比浊法)，但现在可以自制或购买到针对游离轻链多个隐蔽位点的抗体，因此使胶乳增强免疫比浊法的应用成为可能；三、正常人体中血清中FLC的含量很低，但发生B细胞良性或恶性增殖病变时其含量会超出正常的几十倍，因此要求FLC的测定方法不仅要具备灵敏度高、特异性强还要线性范围宽。胶乳增强免疫比浊法是新近发展起来的一种应用较广的免疫比浊法，比普通免疫比浊法具有更高的灵敏度。本发明中所使用的胶乳增强免疫比浊法又做了部分改进，采用两种不同直径的胶乳颗粒(即双胶乳法)，能够满足特异性强、灵敏度高、线性范围宽的要求，可以应用于各种全自动生化分析仪，符合临床快速准确测定的要求。因此，本发明采用双胶乳法，开发出可检测血清和尿液中FLC的液体双试剂，在临床应用上有着巨大的应用价值，可为多发性骨髓瘤、多发性硬化症、淀粉样病变等多种B细胞良性或恶性增殖疾病的临床诊断提供强有力的指标。据研究报道，不久的将来血清游离轻链的测定很可能成为临床上的常规检验项目，可见血清游离轻链这一指标在临床上的重要地位。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种FLC检测试剂的改进，具有样本(血清或尿液)无需稀释、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、适用于各种类型的全自动生化分析仪的FLC检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的 FLC校准品。一方面，本发明提供一种双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，试剂盒包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的轻链抗原校准品，其中，a.本发明所述试剂盒的试剂Rl是一种使样本中FLC特异的抗原位点充分暴露并可加快抗原抗体反应使其迅速达到反应终点，包含物质占其质量百分比为2% 8%高分子加速剂、0.01% 1.0%防腐剂、0. 1.0%表面活性剂、0. 0.5%反应促进剂、 0. 05 5. 0%稳定剂、0. 5. 0%电解质，及pH6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的缓冲液；b.本发明所述试剂盒的R2包含两种不同直径的胶乳颗粒，其胶乳颗粒直径范围分别在40 80nm和100 200nm之间，两种胶乳颗粒上都交联有特异性很强的κ型或λ 型抗FLC多克隆抗体，可识别并结合血清或尿液中FLC的单体和多聚体，但不与完整免疫球蛋白的结合型轻链结合。包括占其质量百分比为40 SOnm的胶乳颗粒1. 0% 5. 0%、 100 200nm的胶乳颗粒3. 0%~ 8. 0%,0. 01% 1. 0%防腐剂、0. 1. 0%表面活性齐[J、0. 1% 0. 5%反应促进剂、0. 5. 0%电解质、0. 05 5. 0%稳定剂，及pH6. 5 8. 0 的10 IOOmmol/L的缓冲液；
c.本发明所述的已知浓度的FLC校准品，用来与样本比较进行结果计算，包括占其质量百分比为0. 01% 1.0%防腐剂、0. 5.0%电解质、0. 05 5.0%稳定剂、 3. 0% FLC(k型或λ型)抗原，及ρΗ6. 5 8. 0的10 1 (Ktoimol/L的缓冲液。本发明中κ型或λ型抗FLC多克隆抗体来自马、羊、兔、鼠等哺乳动物。此多克隆抗体可特异的识别完整免疫球蛋白上结合型轻链所隐蔽了的多个抗原位点，因此能特异结合FLC单体和聚合体，而不结合完整免疫球蛋白上的结合型轻链。因此，该多克隆抗体既可以保障抗原抗体的高效亲和力，也保障了试剂盒的特异性，提高了抗干扰能力。本发明使用的高分子加速剂可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇 6000、聚乙二醇8000，优选聚乙二醇6000。本发明使用的反应促进剂可以是聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000、
溴化己二甲胺、聚凝胺的一种或多种。本发明优选羊抗人FLC(K型或λ型)抗体，可以自制或购买。本发明所使用的胶乳是包含两种不同直径的胶乳颗粒，分别为40 SOnm的胶乳颗粒1. 0% 5. 0%、100 200nm的胶乳颗粒3. 0% 8. 0%，通过调配两种不同直径胶乳颗粒的配比，达到提高灵敏度的同时也拓宽了试剂的线性范围。本发明所述的胶乳为苯乙烯胶乳，有些地方将“苯乙烯胶乳”简称为胶乳，在本领域的人员中已达成共识，不再作进一步阐述。本发明中所使用的防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、 乙基汞硫代硫酸钠。 本发明中所使用的防腐剂为叠氮钠。本发明中所使用的电解质可以是阳离子或阳离子。本发明中所使用的电解质优选氯化钠。本发明中的稳定剂可以由乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛血清白蛋白、甘露糖醇中的一种或多种构成。本发明中所使用的稳定剂优选牛血清白蛋白。本发明所使用的表面活性剂选自非离子表面活性剂中的聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、Tween系列、Theist中的一种或几种。本发明中所使用的非离子表面活性剂为Tween。本发明中所使用的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、HEPES 缓冲液、PIPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液等。本发明中说使用的缓冲液优选三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH为6. 5 8. 0，优选 7. 8 8. O0本发明采用胶乳增强免疫比浊法，开发出可检测血清和尿液中FLC的液体双试剂。其反应原理是包被了高特异性抗体的胶乳颗粒，与样本中相应的抗原发生特异性结合，形成抗原-抗体-胶乳颗粒的复合物，在特定的缓冲液中这种复合物形成一定的浊度， 浊度的增加程度与样本中的抗原浓度成正比关系，在一定的波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检抗原的含量。在本发明中，血清或尿液中的FLC(K型或λ型)抗原与结合在胶乳颗粒表面的高特异性羊抗人FLC (κ型或λ型)多克隆抗体结合，发生抗原抗体反应，在缓冲液中产生的抗原-抗体-胶乳颗粒的复合物形成一定浊度，测定此浊度在570nm波长处的吸光度，对照标准曲线即可求出样本中FLC的含量。采用本发明所述的胶乳增强法测定血清或尿液中FLC的试剂盒进行测定时，先将样本与试剂Rl混勻，读取吸光度Al，之后加入R2，读取吸光度A2，计算反应吸光度，最后得样本中FLC的含量。更进一步的，本发明采用5点定标法，以样条函数作为计算模式，根据吸光度与校准品所作的剂量/响应曲线，根据吸光度在剂量/响应曲线上计算出样本中FLC含量。本发明的技术核心在于两点一是，只针对游离型轻链而不结合完整免疫球蛋白结合型轻链的高特异性多克隆抗体的使用，使得在血清或尿液中远高于自身浓度的免疫球蛋白存在下特异的识别FLC ；二是，高特异性抗体与两种不同直径的胶乳颗粒包被，通过调节两种胶乳的配比，达到提高测试灵敏度的同时也拓宽了测试的线性范围。进一步的，本发明所述的胶乳增强法测定血清或尿液中FLC试剂盒的突出优点在于特异性强、灵敏度高、线性范围宽、操作简便，适用于各种全自动生化分析仪，极大的满足了临床检测的要求。
具体实施例方式实施例一双胶乳法测定血清或尿液中游离kappa轻链试剂盒试剂盒的主要成分及配比如下试剂Rl 三羟甲基氨基甲烷缓冲液20mmol/L叠氮钠(防腐剂)0.1%氯化钠(电解质)154mmol/LPEG-6000 (高分子加速剂)3%Tween-20 (表面活性剂)0.2%牛血清白蛋白(稳定剂)0.5%试剂R2 三羟甲基氨基甲烷缓冲液20mmol/L叠氮钠(防腐剂)0.1%氯化钠(电解质)154mmol/L Tween-20 (表面活性剂)
0. 2%牛血清白蛋白(稳定剂)0.5%羊抗人kappa轻链多克隆抗体5 8%40 80nm的胶乳颗粒1. 0% 5. 0%、100 200nm的胶乳颗粒3. 0%. 抗体包被时，两种胶乳分开单独包被，保证抗体包被均勻。Kappa轻链校准品三羟甲基氨基甲烷缓冲液20mmol/L叠氮钠(防腐剂)0.1%氯化钠(电解质)154mmol/L
8. 0%,
牛血清白蛋白(稳定剂)0.5%纯化的人血清kappa轻链0 3%试剂Rl为无色透明溶液，R2为均一的乳白色溶液，校准品也为无色透明溶液。使用本发明试剂盒时，基本参数设置为样本量5. 0μ L ；试剂R1240y L ；试剂 R280yL;2点终点法，主波长570nm，副波长800nm;校准方式样条函数Spline ；反应方向 上升反应；测定温度37°C。定标方法为5点定标。定标第1点为仪器设置的水点，2、3、4 点为原始校准品稀释8倍、4倍、2倍所得，第5点为校准品原液，所用的稀释液为生理盐水。Lambda轻链校准品三羟甲基氨基甲烷缓冲液20mmol/L叠氮钠(防腐剂)0.1%氯化钠(电解质)154mmol/L牛血清白蛋白(稳定剂)0.5%纯化的人血清Lambda轻链0 3%试剂Rl为无色透明溶液，R2为均一的乳白色溶液，校准品也为无色透明溶液。使用本发明试剂盒时，基本参数设置为样本量5. 0μ L ；试剂R1240y L ；试剂 R280yL;2点终点法，主波长570nm，副波长800nm;校准方式样条函数Spline ；反应方向 上升反应；测定温度37°C。定标方法为5点定标。定标第1点为仪器设置的水点，2、3、4 点为校准品原液稀释8倍、4倍、2倍所得，第5点为校准品原液，所用的稀释液为生理盐水。实施例三本发明kappa游离轻链试剂盒的相关性、灵敏度及线性范围
为更好比较本发明试剂的优越性，所选的临床样本均为医院收集的病人血清，因为相对而言尿样本的测定比血清容易。对照试剂采用“游离Kappa/Lambda轻链测定试剂盒”(见“武建国，王毓三.血清游离轻链测定中应考虑的问题[J]，临床检验杂志，2004，(22)3 :165-167. ”)。该对照试剂的原理为单克隆抗体与均一的胶乳颗粒包被，在波长570nm处测定反应吸光度，根据校准曲线计算样本中相应物质含量。其Rl为无色透明缓冲液；R2为乳白色单克隆抗体敏感的胶乳溶液。1相关性实验分别使用本发明试剂和对照试剂采用日立7180全自动生化分析仪对50份人血清 (包含正�：鸵斐１瓯�)按各自参数同时进行测定，本发明试剂参数见实施例一。对测定值进行线性回归，得回归方程式为y = 1. 025x+2. 3421，相关系数为R2 = 0. 9935 (y为本发明试剂，χ为对照试剂)，结果表明本发明试剂与对照试剂相关性很好，进而说明本发明试剂具有很好的特异性和准确度。此外本试剂不仅适用于日立7180全自动生化分析仪，还可用于日立、奥林巴斯等其他系列的全自动和半自动生化分析仪，具体参数可据主要参数做适当调整。2灵敏度实验表1、表2分别表示本发明试剂和对照试剂的灵敏度。计算95%置信区间的灵敏度分别为本发明的kappa游离轻链试剂0. 40mg/L，优于对照试剂0. 84mg/L0表1 本发明试剂灵敏度
权利要求
1.一种双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，试剂盒包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的轻链抗原校准品，其中，a.试剂Rl包含占其质量百分比为2% 8%高分子加速剂、0.01% 1.0%防腐剂、 0. 05 5.0%稳定剂、0. 1.0%表面活性剂、0. 0. 5%反应促进剂、0. 5.0% 电解质，及PH6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的缓冲液；b.试剂R2包含两种不同直径的胶乳颗粒，其胶乳颗粒直径范围分别在40 SOnm和 100 200nm之间，两种胶乳颗粒上都交联有κ型或λ型抗FLC多克隆抗体，还包含占其质量百分比为0. 01% 1.0%防腐剂、0. 1.0%表面活性剂、0. 0.5%反应促进剂、0. 5. 0%电解质、0. 05 5. 0%稳定剂，及pH6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的缓冲液；c.已知浓度的轻链抗原校准品包含占其质量百分比为0.01% 1.0%防腐剂、 0. 1 % 5.0%电解质、0.05 5.0%稳定剂、0 3.0% κ型或λ型FLC抗原，及ρΗ6. 5 8. 0的10 IOOmmol/L的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，其中κ型或 λ型抗FLC多克隆抗体来自于哺乳动物，优选的哺乳动物包括马、羊、兔、鼠，更优选为羊。
3.根据权利要求1所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，其中胶乳包含两种不同直径的胶乳颗粒，分别为占试剂R2质量百分比为1. 0% 5. 0%的40 SOnm 的胶乳颗�：驼际约罵2质量百分比为3. 0% 8. 0%的100 200nm的胶乳颗粒。
4.根据权利要求1-4任一项所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，其中所述的高分子加速剂选自聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000。
5.根据权利要求1-4任一项所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒， 其中所述的防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯或乙基汞硫代硫酸钠。
6.根据权利要求1-4任一项所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，其中所述的电解质为阳离子或阳离子，优选为氯化钠。
7.根据权利要求1-4任一项所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒， 其中所述的稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛血清白蛋白、甘露糖醇中的一种或多种，优选为牛血清白蛋白。
8.根据权利要求1-4任一项所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，其中所述的表面活性剂选自非离子表面活性剂中的聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、 聚氧乙烯烷基苯基醚、Tween系列、Theist中的一种或几种，优选为Tween。
9.根据权利要求1-4任一项所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒，其中所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液等，优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
10.根据权利要求1-4任一项所述的双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的试剂盒， 其中所述的反应促进剂选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000、溴化己二甲胺、聚凝胺的一种或多种。
全文摘要
本发明涉及双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的液体双试剂试剂盒。本发明提供的试剂盒包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的轻链抗原校准品，其中试剂R1包含高分子加速剂、防腐剂、表面活性剂、反应促进剂、稳定剂、电解质及缓冲液；R2包含两种不同直径的胶乳颗粒，其胶乳颗粒直径范围分别在40～80nm和100～200nm之间，两种胶乳颗粒上都交联有κ型或λ型抗FLC多克隆抗体，还包含防腐剂、表面活性剂、反应促进剂、电解质、稳定剂及缓冲液；已知浓度的轻链抗原校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、κ型或λ型FLC抗原及缓冲液。本发明的试剂盒特异性强、灵敏度高、线性范围宽、操作简便，适用于各种全自动生化分析仪。
文档编号G01N33/68GK102175871SQ201010615018
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者刘希, 徐丽, 高爱民 申请人:北京九强生物技术股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
