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专利名称：胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种干细胞差异膜蛋白的检测方法，特别涉及胎盘和脐带来源的间充 质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCSs)表面差异膜蛋白的检测方法。
背景技术：
干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下， 它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(MSCSs)是干细胞家族的重要成员，最早来源 于骨髓，因其具有强大的增殖能力和多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控 等特点使其在组织工程、细胞治疗和基因治疗等方面具有广泛的临床应用前景。近年来，随 着人们对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，已成功地从骨髓、外周血、肌肉、脂 肪、脐血、脐带及胎盘等组织中分离并鉴定出MSCSs。其中，胎盘来源MSC^s易分离培养，增 殖迅速，可以分化为3个胚层来源的细胞系，并有向伤处迁移的能力；同时胎盘在临床上为 废弃物，取材几乎不受限制，且不涉及伦理问题；因此是很好的实验材料和细胞治疗载体。 而脐带来源的间充质干细胞，迄今的研究表明，它不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想 替代物，而且具有更大的应用潜能，它表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力 大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征， 因此也极具具临床应用前景。因此，本发明选择这两种细胞作为被检测对象。骨髓来源的MSCS 能够表达 CD^、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、基质细胞 抗原1 (Stro. 1)、干细胞抗原1 1)、CXC类趋化因子受体4 (CXCR-4)和CXCR. 6等表面 标志,但是不表达造血细胞表面标志⑶1 lb、CD14、CD31、CD33、CD34、CD133和CD45。胎 盘来源的MSCS表达⑶四、CD44和CD105，不表达CD;34、CD45、CD19。脐带来源的MSCS表达 CD13、CD29、CD44、CD105,不表达 CD34、CDlla、CD14、CD31、CD45。但胎盘和脐带 MSCS 表面 标志，不同文献报到不尽相同。换而言之，骨髓、胎盘和脐带MSCS都没有明确的细胞表面标 志。脐带作为连接胎儿和胎盘的管状结构，其分离出的MSCS和胎盘MSCS表面表达的差异 有何不同，目前还没有资料标明，但这种差异在发育生物学上有着重要意义，本专利就是采 用一种新的技术手段，来揭示胎盘和脐带中分离出的MSCS表面蛋白表达差异。

发明内容
本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种间充质干细胞表面差 异膜蛋白的检测方法，该方法可用于检测胎盘、脐带两种不同来源的间充质干细胞表面的 特殊的膜蛋白标志。双向凝胶电泳是蛋白质组研究中的主流技术，但该技术的重复性和敏感 性不佳，且缺乏对蛋白质点的精确定量，近年来出现的双向荧光差异显示凝胶技术 (two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)克月艮了传统的双向 疑胶 电泳技术的上述缺点，2D-DIGE在传统双向凝胶电泳技术的基础上，结合多重荧光分析的方 法，在同一块胶上分离多个由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念，软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的，极 大地提高了结果的准确性，可靠性和重复性，避免了使用不同凝胶时在操作上的偶然性和 不平行性。因此我们我们通过双向荧光差异凝胶电泳对不同来源的膜蛋白进行分析，来研究 胎盘和脐带MSCS表面差异蛋白，在此基础上一方面可制备单抗，进行MSCS的鉴定，另一方 面，揭示两者在发育生物学上的关系。为解决技术问题，本发明是通过如下的技术方案实现的
提供一种胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法，包括以下步骤
(1)间充质干细胞的分离和培养
如间充质干细胞为胎盘来源，则取新鲜胎盘组织剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的 细胞悬液，使用Ficoll分离液进行密度梯度离心，收集白膜层，洗两遍，收集细胞，常规培 养；
如间充质干细胞为脐带来源，则取新鲜脐带组织，剥离血管，剪碎，胶原酶消化，收集 消化得到的细胞悬液，离心，收集细胞，常规培养；
所有间充质干细胞均培养至对数生长期，用于移植；
(2)间充质干细胞膜蛋白的提取
反复冻融法使得细胞破碎，然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的组分；
(3)双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱
通过双向荧光差异凝胶电泳法(2D-DIGE)，得到Cy2、Cy3及Cy5荧光素标记的不同种类 的膜蛋白凝胶图谱，采用DeCyder 2D图像分析软件进行分析，识别两组间差异表达的蛋白 质点；
(4)质谱分析及验证
选取差异蛋白质点，胶内酶解后进行质谱分析，并对网上数据库查询，鉴定差异蛋白 质，寻找不同来源干细胞的特殊表面标志，然后采用Western-Blot验证。本发明的有益效果在于
本发明首次将2D-DIGE用来对干细胞膜表面特殊差异表面标志的检测，可以在同一块 凝胶上对不同样品中蛋白质进行定量比较分析，在每块凝胶中加入了内标，DIA和BVA软件 可以自动地根据每个蛋白质点的内标对其表达量进行校准，最大程度上降低了不同批次胶 与胶之间的误差，反应了蛋白质的真实改变程度，降低了假阳性率及假阴性率。
具体实施例方式下面结合具体实施例子，对本发明的技术方案详细描述。(一)间充质干细胞细胞的分离培养 胎盘MSCSs的分离培养
无菌条件下将胎盘用预热的PBS充分洗涤去血渍后，剪碎，剪成尽可能小的组织块，置 于0. 1%四型胶原酶中消化，37°C消化，30min,过滤，用PBS冲洗，收集消化液和冲洗液，1200 rpm离心10 min，收集细胞沉淀，用5mlPBS重悬，加至5ml含有Ficoll-I^aqueTM PLUS人淋 巴细胞分离液(其相对密度为1.077g/L)上，进行梯度离心(20°C，2000rpm，25min)。离心 后，吸取管中白膜层，PBS洗涤两次，收集细胞。MSCS专用培养基重悬，接种于6孔培养板中，置于37°C、5%0)2饱和湿度培养箱中，行常规培养及传代。脐带MSCSs的分离培养
无菌条件下将脐带用预热的PBS充分洗涤去血渍后，剥离脐动静脉血管，剪成Icm3见 方的小块，置于0. 1%四型胶原酶中消化，37°C消化，lh，过滤，用PBS冲洗，收集消化液和冲 洗液，1200 rpm，离心10 min，弃上清，PBS洗涤细胞沉淀。MSCS专用培养基重悬，接种于6 孔培养板中，置于37°C、5%0)2饱和湿度培养箱中，行常规培养及传代。(二)分离细胞膜蛋白的方法
1、冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT, 0. 5 μ g/ml Leup印tin, 20 μ M pmsf (PH=7. 4))中，于室温与液 氮罐中反复冻融2次。2、5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。3、取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 B (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT,0.5 μ g/ml Leupeptin,20 μ M PMSF (ΡΗ=7· 4))中。4、12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C (0.5 μ g/ml Leupeptin, 20 μ M PMSF, 50mMTris-cl (ΡΗ=7. 0))中提取后测蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳，分装 后-20度保存备用。(三)膜蛋白浓度测定
采用GE公司专门针对蛋白质组学研究设计的蛋白质抽提2D Quant Kit定量试剂盒。 其基本原理是将蛋白质沉淀后，去除裂解液，再用含铜离子的溶液重溶蛋白质沉淀，未与蛋 白质结合的铜离子可与显色工作液反应而显色，显色的深浅与蛋白质的浓度成反比。(四)2D_DIGE
1、内标样品制备2个样品(N1、N2)各取50 μ g，体积10μ 1，加入到同一个印pendorf 管里，震荡混勻，离心。然后50 μ g每管分装成2管。2、储存液的制备把染料从-20°C的冰箱中取出，轻旋，室温静置5min，吸5μ 1 DMF至染料管中，震荡离心，配制成lnmol/μ 1储存液。3、工作液的制备首先取1.8μ 1 DMF到印pendorf管，然后吸取1.2μ 1储存液到 一个印pendorf管中，震荡离心即配成400 pmol/μ 的工作液。避光保存。4、样品标记将每1 μ 1工作液和50 μ g蛋白的比例进行荧光标记。整个操作中避 光进行。冰上避光放置30 min，每管蛋白中加入Ιμ 赖氨酸终止标记反应
5、样品准备将分别用Cy2、Cy3和Cy5标记的样品加入到同一印pendorf管中，震荡混 勻，短暂离心。避光操作。每块胶上加入等体积的2X上样缓冲液(7mol/L尿素，2mmol/L 硫脲，4%CHAPS，65mmol/L DTT)冰上静止10 min，准备上样。 表1标记成分
权利要求
1.胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法，包括以下步骤(1)间充质干细胞的分离和培养取新鲜胎盘组织剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，使用Ficoll分离液进 行密度梯度离心，收集白膜层，洗两遍，收集细胞，常规培养；取新鲜脐带组织，剥离血管，剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，离心，收集 细胞，常规培养；所有间充质干细胞均培养至对数生长期，用于移植；(2)间充质干细胞膜蛋白的提取反复冻融法使得细胞破碎，然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的组分；(3)双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱通过双向荧光差异凝胶电泳法，得到Cy2、Cy3及Cy5荧光素标记的不同种类的膜蛋白 凝胶图谱，采用DeCyder 2D图像分析软件进行分析，识别组间差异表达的蛋白质点；(4)质谱分析及验证选取差异蛋白质点，胶内酶解后进行质谱分析，并对MareixScience公司的Mascot 网上数据库查询，鉴定差异蛋白质，寻找不同来源干细胞的特殊表面标志，然后采用 Western-Blot 验证。
全文摘要
本发明涉及干细胞差异膜蛋白的检测方法，旨在提供一种胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法。该方法包括间充质干细胞的分离和培养、间充质干细胞膜蛋白的提取、双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱、质谱分析及验证。本发明首次将2D-DIGE用来对干细胞膜表面特殊差异表面标志的检测，可以在同一块凝胶上对不同样品中蛋白质进行定量比较分析，在每块凝胶中加入了内标，DIA和BVA软件可以自动地根据每个蛋白质点的内标对其表达量进行校准，最大程度上降低了不同批次胶与胶之间的误差，反应了蛋白质的真实改变程度，降低了假阳性率及假阴性率。
文档编号G01N27/64GK102095777SQ20111000189
公开日2011年6月15日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者俞炯, 曹红翠, 李兰娟 申请人:浙江大学