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专利名称：一种L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的HPLC测定方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域一种测定L-天冬氨酸α -脱羧酶活性的高效液相测定方法。
背景技术：
L-天冬氨酸α -脱羧酶是一类催化底物L-天冬氨酸脱去α羧基，转化为β -丙氨酸的脱羧酶。L-天冬氨酸α-脱羧酶催化的产物β_丙氨酸是一种多用途有机原料，可用于合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、巴柳氮等，在医药、饲料、食品等领域应用广泛，泛酸是B族维生素的一种，构成辅酶A的一部分，对于各种组织内的内源代谢能量交换有很重要的作用。微生物和植物能自行合成泛酸，而哺乳动物不能，需要从外界摄取泛酸作为营养囚子。由于L-天冬氨酸α-脱羧酶催化的底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸，住近紫外区(200-400nm)没有吸收光的能力，因此用高效液相的紫外检测器测定L-天冬氨酸α -脱 羧酶酶活成为实验的一大瓶颈。因此现有技术，需要一种对L-天冬氨酸和β -丙氨酸易于检测且检测灵敏，重现性好的高效液相检测方法。

发明内容
本发明的目的在于建立一种采用高效液相色谱法测定L-天冬氨酸α -脱羧酶酶活的方法，由于L-天冬氨酸α-脱羧酶催化的底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸，在近紫外区(200-400nm)没有吸收光的能力，本发明建立了一种苯基异硫氰酸酯(PITC)衍生氨基酸的高效液相色谱分析的方法。采用本方法，在紫外254nm处检测，分析速度快，灵敏度高。本发明的酶反应条件100ul 50mM底物L-天冬氨酸，加入900ul纯酶液(酶浓度为 18. 42ug/ml)，37°C温度下，反应 20min。本发明所述衍生方法酶反应液400ul于I. 5ml离心管中，加入O. IM PITC乙腈溶液200ul，IM 二乙胺乙腈溶液200ul，涡旋振荡器混匀，避光室温放置lh，加入500ul正己烷溶液，润旋振荡器振荡Imin,静置30min-60min,用注射器吸取下层溶液,经O. 45um有机滤膜过滤后进样。本发明所述的高效液相的色谱条件为色谱柱HITACHIC18 5um 4. 6*250mm ；流动相A液乙腈-水=4 IB液0. IM乙酸钠-乙腈=97 3 (PH = 6. 5)以体积分数计；检测波长254nm;柱温20-40V，优选为 40 V。具体的本发明的检测方法包括以下步骤I、取400ul 4mM浓度的产物β-丙氨酸标样和400ul 20mM浓度的底物L-天冬氨酸标样于I. 5ml离心管中
2、加入O. IM PITC乙腈溶液200ul，lM 二乙胺乙腈溶液200ul，涡旋振荡器混匀，避光室温放置lh，加入500ul正己烷溶液，涡旋振荡器振荡lmin，静置30min-60min，用注射器吸取下层溶液，经O. 45um有机滤膜过滤。3、酶反应的测定。4、取IOOul底物于I. 5ml离心管加入900ul纯酶液,37°C条件下,反应lOmin。5、取400ul酶反应液于I. 5ml离心管中，加入O. IM PITC乙腈溶液200ul，IM二乙胺乙腈溶液200ul，涡旋振荡器混匀，避光室温放置lh，加入500ul正己烷溶液，涡旋振荡器振荡lmin,静置30min-60min,用注射器吸取下层溶液,经O. 45um有机滤膜过滤。6、将以上步骤处理好的样品，注入高效液相色谱仪。
7、记录色谱图。其中色谱条件为色谱柱HITACHIC185um 4. 6*250mm ；流动相A液乙腈-水=4 IB液0. IM乙酸钠-乙腈=97 3 (PH = 6. 5)以体积分数计；梯度洗脱梯度洗脱的程序为0-15min，95%B梯度下降到65%B ;15-20min，65%B梯度上升到95% B :20-30min，95% B浓度不变；检测波长254nm；柱温20-40V，优选为 40 V ；本发明的方法中色谱图的记录时间为IOOmin以下，以30min为宜。采用本发明的方法，主成分的出峰时间为两主峰的保留时间为L_天冬氨酸(l-5min), β -丙氨酸(6_15min)。本发明采用高效液相反向色谱柱，并采用了苯基异硫氰酸酯衍生的方法，能有效的检测和分离底物L-天冬氨酸和产物β -丙氨酸，从而使得L-天冬氨酸α -脱羧酶活性测定成为可能。


图I :样品4πιΜβ -丙氨酸产物，流动相梯度洗脱的HPLC图谱，A液为乙腈-水=4 1，B 液为 O. IM 乙酸钠-乙腈=97 3(ΡΗ = 6·5)。图2 :样品20mML_天冬氨酸底物，流动相梯度洗脱的HPLC图谱，A液为乙腈-水=4 1，B 液为 O. IM 乙酸钠-乙腈=97 3(ΡΗ = 6·5)。图3 :样品酶反应液，流动相梯度洗脱的HPLC图谱，A液为乙腈-水=4 : 1，Β液为 O. IM 乙酸钠-乙腈=97 3 (PH = 6. 5)。
具体实施例方式本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的技术方案，这些实施方式并不对本发明构成进一步限定。本领域技术人员根据现有知识对本发明进行等同替换或者相应的逻辑改进，均属于本发明的范围。以下实施例中，采用的高效液相色谱仪为日立高效液相色谱仪，色谱柱为HITACHI C18 5um 4. 6*250mm，进样体积为20ul。当然也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪，其他粒径和长度的氨基色谱柱、以及其他进样体积，都能达到本发明的目的。实施例I :色谱条件色谱柱HITACHIC18 5um 4. 6*250mm ；流动相A液乙腈-水=4 IB液0. IM乙酸钠-乙腈=97 3 (PH = 6. 5)以体积分数计；梯度洗脱梯度洗脱的程序为0-15min，95%B梯度下降到65%B ;15-20min，65%B梯度上升到95% B ;20-30min，95% B浓度不变； 检测波长254nm；柱温20-40V，优选为 40 V ；样品流速1.Oml/min。实验步骤供试验样品4mM浓度β -丙氨酸的衍生样品，置于I. 5ml棕色小量瓶中。精密吸取供实验样品溶液20ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图
1。由图可知，丙氨酸的出峰时间适中，基线稳定，且峰形可观。实施例2 色谱条件色谱柱HITACHIC18 5um 4. 6*250mm ；流动相A液乙腈-水=4 IB液0. IM乙酸钠-乙腈=97 3 (PH = 6. 5)以体积分数计；梯度洗脱梯度洗脱的程序为0-15min，95%B梯度下降到65%B ;15-20min，65%B梯度上升到95% B ;20-30min，95% B浓度不变；检测波长254nm；柱温20-40V，优选为 40 V ；样品流速1.Oml/min。实验步骤供试验样品20mM浓度L-天冬氨酸的衍生样品，置于I. 5ml棕色小量瓶中。精密吸取供实验样品溶液20ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图
2。由图可知，L-天冬氨酸的出峰时间适中，基线稳定，且峰形可观。实施例3 色谱条件色谱柱HITACHIC18 5um 4. 6*250mm ；流动相A液乙腈-水=4 IB液0. IM乙酸钠-乙腈=97 3 (PH = 6. 5)以体积分数计；梯度洗脱梯度洗脱的程序为0-15min，95%B梯度下降到65%B ;15-20min，65%B梯度上升到95% B ;20-30min，95% B浓度不变；检测波长254nm；柱温20-40°C，优选为40°C ；样品流速1.Oml/min。
实验步骤供试验样品酶反应液的衍生样品，置于I. 5ml棕色小量瓶中。精密吸取供实验样品溶液20ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图
3。由附图3可知，样品的主峰产物峰和底物峰与各杂质峰分离良好，峰I为底物峰，峰2为产物峰。
权利要求
1.一种采用高效液相色谱法测定L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活的方法，苯基异硫氰酸酯(PITC)衍生酶反应液。
2.根据权利要求I的方法，其特征在于，色谱条件为 色谱柱C18高效液相反相色谱柱； 流动相A液乙腈-水=4 IB液0. IM乙酸钠-乙腈=97 3 (PH = 6. 5)； 梯度洗脱程序； 检测波长254nm ； 柱温20-40°C，优选为40°C。
3.根据权利要求I和权利要求2的方法，其特征在于，其中梯度洗脱的程序为0-15min，95% B 梯度下降到 65% B ;15_20min，65% B 梯度上升到 95% B ；20-30min, 95% B浓度不变。
4.根据权利要求I的方法，其特征在于，步骤如下 1)样品400ul加入O.IM PITC乙腈溶液200ul，IM三乙胺乙腈溶液200ul，涡旋振荡器混匀，避光室温放置Ih; 2)加入500ul正己烷溶液，涡旋振荡器振荡lmin，静置30min_60min； 3)用注射器吸取下层溶液，经O.45um有机滤膜过滤后进样。
5.根据权利要求2和权利要求5的方法，其特征在于，所述溶液的配方 A液流动相的配方，乙腈-水=4 1，以体积分数计数；B液流动相的配方，13. 609g乙酸钠溶于IL水中，加入3%体积乙腈，pH值调到6. 5 ；0. IM苯基异硫酸酯乙腈溶液配方，135. 19g PITC溶于IL乙腈溶液中；1M三乙胺乙腈溶液配方，101. 19g三乙胺溶于IL乙腈溶液中。
6.根据权利要求2的方法，其特征在于，检测波长254nm，柱温20_40°C，优选为40°C。
全文摘要
本发明公开了一种L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的HPLC测定方法，生物工程技术领域。该方法简单有效，建立的苯基异硫氰酸酯(PITC)衍生氨基酸的高效液相色谱分析的方法，在紫外254nm处检测，分析速度快，灵敏度高。
文档编号G01N30/34GK102830189SQ201210347439
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者周哲敏, 石增秀, 崔文璟, 周丽, 荣瑶 申请人:江南大学