专利名称：：皮肤桥蛋白在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及皮肤桥蛋白(DPT)的新用途，具体地说是皮肤桥蛋白在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用。
背景技术：
：皮肤桥蛋白(dermatopontin，DPT)是广泛存在于细胞外基质中的一种小分子量蛋白质，可以和核心蛋白多糖(decorin)，转化生长因子P(TGF-P)，I型胶原蛋白等作用，具有细胞黏附、促进胶原纤维形成等功能，在多种和细胞外基质有关的生理和病理过程中发挥作用。(Dermatopontin，aNovelPlayerintheBiologyoftheExtracellularMatrix.Okamoto0，FujiwaraS.ConnectiveTissueResearch,47:177-189，2006.)皮肤桥蛋白的基因定位于人染色体lql2-lq23。它是由183个氨基酸残基构成的分泌性蛋白质，分子量为22kDa。不同哺乳动物皮肤桥蛋白亚型的等电点略有不同，均在4.14.4之间，因此它是一个酸性蛋白质。其分子结构中富含酪氨酸残基，且1/2被硫酸化，酪氨酸的硫酸化可能与皮肤桥蛋白对胶原纤维形成的影响和其与细胞表面受体的结合有关o(Tyrosinerichacidicmatrixprotein(TRAMP)isatyrosine-sulphatedandwidelydistributedproteinoftheextracellularmatrix.ForbesE，CronshawA，MacBeathJ，etal.FEBSLett,1994，351:433-436).皮肤桥蛋白的一级结构中有五个由分子内二硫键形成的环状结构。它的分子结构中有三个重要的序列1)分别存在于52-57，107-112，163-168位氨基酸残基间的D-R-E/Q-W-X-F/Y重复序列。这三个重复序列分别位于第一、三、四个环状结构区。虽然这三个重复序列在不同物种的DPT分子间相对保守，但尚未发现其具体的生物学作用；2)存在于145147位氨基酸残基之间的N-Y-D序列，这是氧化还原辅因子topaquinone的保守序列，故DPT可能具有氨基氧化酶作用；3)存在于151154位氨基酸残基间的R-G-A-T序列，这可會g是整合蛋白结合的一个位点。(Theisolationandprimarystructureofa22_kDaextracellularmatrixproteinfrombovineskin.JBiolChem，1989，264:5474-5479)基因芯片(genechip)是近年发展起来的一种新型实用的高新生物技术，已成为目前国际上生命科学研究的热点之一。其突出特点是具有高度的并行性、多样性、微型性和自动化，已成为高效、快速、大规模获取相关生物信息的重要手段。利用该技术可在数分钟至几小时内完成传统分子生物学方法要数月甚至数年才能完成的几万次至几十万次的基因分析实验。目前基因芯片技术已在疾病诊断、发病机制及疾病易感性研究、药物设计与筛选、基因表达分析、基因突变及多态性分析等许多领域日益显示出其重要的理论和实际应用价值及巨大的社会效益与经济效益基因芯片技术是利用核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的一种高新生物技术。其制作过程实际上就是将大量已知序列的DNA探针，采用特殊方法固定在厘米见方的硅芯片或玻片上，从而获得一高密度(目前探针密度可达6.5万60万/cm2)的DNA探针列阵。所有的基因芯片制作与检测技术包括4个基本要点DNA探针列阵的构建、待测样品的准备、杂交及杂交信号的检测分析。其中最关键的是DNA探针列阵的构建与杂交信号的检测分析。目前DNA探针列阵的构建方法主要有两种策略即直接在芯片上进行的寡核苷酸探针原位合成法(insitusynthseis)与芯片外(off-chip)的探针合成法。原位合成法又分为光蚀刻法(photolithograpgy)与压电打印法(piezoeletricprinting)。基因芯片的杂交与检测分析的一般步骤为将待测样品(DNA或RNA)用荧光或其它方法标记后作为靶分子，与基因芯片上的探针列阵杂交。由于在基因芯片列阵中某一特定位置上的核苷酸序列是已知的，所以对微列阵每一位点的荧光强度进行检测，即可对样品的遗传信息进行定性定量分析。杂交信号常用激光共聚焦扫描显微镜检测，并用专用软件记录分析后直接给出检测结果。传统的核酸杂交方法一次只能检测一个或几个样品，一般需要一天甚至更长，而基因芯片将数十万组探针集成在一块縮微芯片上，故一次可对大量生物样品信息进行杂交检测分析。目前杂交速度已可縮短至数分甚至几秒，极大地提高了实验效率。心力衰竭是世界范围内发病率和死亡率都较高的疾病。它是一个多因素引起的疾�。谠诘姆肿踊苹共皇呛芮宄赡芎颓痹诘幕蚝偷鞍字时泶锔谋溆泄�。利用传统的分子生物学的方法一次只能对一个或几个基因的表达进行分析，因此检测效率较低，也就是说用传统的方法进行检测很难获得心衰相关的所有的表达变化的基因。而利用基因芯片技术可以同时分析成千上万个基因，大大提高了研究效率。观察比较生理和病理状态下组织的基因表达谱的差异，对于探索心力衰竭的确切的分子机制、发现与心力衰竭相关的新的生物标志物以及在心衰的诊断和治疗等方面都具有重要的价值。(Globalgeneexpressioninthefailingmyocardium.Circulation,2009，73(9):1568-76.)
发明内容本发明的目的在于提出一种皮肤桥蛋白(DPT)的新用途，并且提出一种含有该蛋白的可以高效准确的检测心力衰竭疾病的试剂盒。本发明的发明思路为本发明发明人使用基因芯片的新方法找到新型心衰生物标记。皮肤桥蛋白的基因定位于人染色体lql2-lq23。它是由183个氨基酸残基构成的分泌性蛋白质，分子量为22kDa。不同哺乳动物皮肤桥蛋白亚型的等电点略有不同，均在4.14.4之间，因此它是一个酸性蛋白质。其分子结构中富含酪氨酸残基，且1/2被硫酸化，酪氨酸的硫酸化可能与皮肤桥蛋白对胶原纤维形成的影响和其与细胞表面受体的结合有关。皮肤桥蛋白广泛存在于细胞外基质中，可以和核心蛋白多糖(decorin)，转化生长因子13(TGF-P)，I型胶原蛋白等作用，具有细胞黏附、促进胶原纤维形成等功能，在多种和细胞外基质有关的生理和病理过程中发挥作用。本发明具体技术方案为皮肤桥蛋白在制备检测心力衰竭试剂盒中的新用途。其中DPT基因为本领域技术人员公知的基因，genbank编号NM_001937.本发明根据上述用途提出了一种用于检测心力衰竭的试剂盒，所述试剂盒包含有所述的皮肤桥蛋白特异性结合的抗体，抗体的制备为现有技术，本领域技术人员熟知，在此4不赘述。上述用于检测心力衰竭的试剂盒，还包含有抗原包被的微孔板，酶标抗人IgG及其它试剂组成，应用双抗体夹心法ELISA原理检测皮肤桥蛋白。试剂盒具体组分如下1.)酶联板12X8可拆分的微孔板包被有经过纯化的人DPT特异性抗体，密封在装有干燥剂的包装袋内；2.)标准品(冻干品)2瓶，冻干的标准品。含胎牛血清、重组DPT、10mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.4±0.1)、0.02%硫酸庆大霉素和0.1%kathonGC防腐剂;3.)样品稀释液lX20ml/瓶；4.)检测稀释液A:1X10ml/瓶，生物素标记抗体稀释液；5.)检测稀释液B:1X10ml/瓶，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液；6.)检测溶液A:lX120ul/瓶，生物素标记抗体(1:100);7.)检测溶液B:1X120ul/瓶，辣根过氧化物酶标记亲和素(1:100);8.)底物溶液lX10ml/瓶，含有50mmol/L枸橼酸盐.磷酸盐缓冲液(pH值3.53.8)、4%二甲基亚砜(DMS0)、0.03%3，3，，5，5，-四甲基联苯胺(TMB)和O.02%H202。注意对强光照射敏感，应避光保存；9.)浓洗涤液lX30ml/瓶，20X浓縮液。稀释后的洗涤液中含有10mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.4±0.2)、0.05%吐温20和0.1%kathonGC防腐剂；10.)终止液lX10ml/瓶，0.3mmol/L硫酸溶液。本发明的优点和有益效果本发明提出了一种皮肤桥蛋白的新用途。本发明经实验验证DPT可以用于检测心力衰竭，本发明的这种用血清快速准确检测DPT来评估终末期心脏病的方法具有极大的临床意义和推广意义。在ARVC所致心衰组DPT的表达上调了3.5倍。本发明DPT制备的检测心力衰竭的试剂盒优势有敏感度和特异性高，血清稀释比例高，与现有检测心衰的方法相比较，成本低、效率高、使用方便等。现有技术也有用血清学检测的，但是敏感性等不甚理术巨图1为苏木素伊红(HE)染色光镜所见(左上图及右上图)和使用多克隆抗体免疫组化DPT(左下图及右下图)；图2为基因芯片和实时RT-PCR检测心衰组织DPT相对于非心衰组织的表达变化；图3为ROC曲线分析DPT检测心衰的敏感性和特异性；图4为用试剂盒检测终末期心衰组和正常组的血清DPT的表达。具体实施例方式本发明所用实验样本和设备来源心脏标本来源5例患致心律失常型右室心脏病(ARVC)心衰终末期接受心脏移植的心脏标本和5例非心衰的对照心脏标本。所有终末期心衰的患者都达到心衰纽约分级(NYHA)的III-IV，平均射血分数(EF)25.4±7.9%，无合并其他重要脏器疾病。心衰和非心衰患者的临床和血流动力学资料见表1。非心衰对照组是5例由于意外事故死亡而捐献的心脏。根据病例记录，所有非心衰对照的心脏捐献个体在死亡前都是健康的，没有检测他们相应的临床和血流动力学指标。所有病人和对照组对这个研究均签有书面的知情同意书，并且经中国医学科学院阜外心血管病医院伦理学术委员会的同意，符合赫尔辛基宣言中的条约。表1心衰和非心衰患者的临床和血流动力学资料groupSexAge(years)NYHAClassCIPAPPVRCVPPAWPLVEl.ARVCM54m2.7630/13(18)125910242.ARVCM52IV1.9553/23(33)370416243.ARVCM50m2.3376/40(52)4631525374.ARVCM37IV1.4667/44(52)810928275.ARVCM16IV2.5024/15(8)641515156.NFM527.NFM488.NFM429.NFM3710.NFM23ARVC:致右室心律失常性型心肌�。琋F:正常心脏，NYHAClass:纽约心力衰竭分级，CI:心脏指数，PAP:肺动脉压力，PVR:肺血管阻力，CVP:中心静脉压，PAWP:肺毛细血管契压，LVEF:左室射血分数。2.主要仪器来源ScanArrayExpress扫描仪(ParckardBioscience公司)，GenePixPro4.0图像分析软件(AxonInstruments公司)，PCR扩增仪等。[OO38]实施例1DPT与心力衰竭关系实验致心律失常型右室心脏病(ARVC)目前病因尚不明确，主要特点是由于右心室心肌被纤维脂肪组织取代引起反复的室性心律失常。我们的5例ARVC的心衰患者主要表现为左心室功能不全，并且病理证实左室游离壁被纤维脂肪组织取代。每个标本取自心脏移植后心衰心脏的左室游离壁和非心衰捐献心脏。部分标本立即冷冻保存于液氮中，供基因芯片、实时PCR分析，其余标本固定于10%福尔马林供病理检查和免疫组织化学分析。1.具体步骤1)基因芯片使用基因芯片检测ARVC心衰患者和健康对照组的心肌组织差异表达的基因。使用C即italBio公司的70-mer寡核苷酸芯片，购自QIAGEN公司的35000个人类基因印于氨基硅烷玻片上。根据说明书，分别用5iig来自ARVC心衰心脏和非心衰心脏的RNA合成双链cDNA，并用PCR纯化试剂盒对cDNA进行纯化。荧光染料(Cy5和Cy3)标记cDNA，加入到芯片中，42t:过夜，然后用两个连续的洗涤溶液洗涤，根据说明书分析基因的表达情况。ScanArrayExpress扫描仪获取图片，使用GenePixPro4.0软件分析，把图像信号转化为数字信号。依据LOWESS程序，设计了时间和空间依赖性的阳性对照，阳性对照信号用来确认趋势和帮助标准化不同芯片的结果。2)免疫组织化学左心室组织用10%福尔马林固定。使用酒精和二甲苯脱水，石蜡包埋，5m的切片用苏木素和伊红染色，来评估心衰和非心衰组织的形态学特点。切片用4%多聚甲醛固定，0.2X三重氢核X-100透化处理5min，用5%BSA阻断。切片用DPT兔抗人多克隆抗体(产品目录编号10537-1-AP，ProteinTechGroup)室温孵化1小时，用PBS缓冲液洗10min。然后切片用IgG过氧化物酶结合的第二抗体(Sigma，St.Louis，MO，USA)室温孵化1小时，用PBS缓冲液洗lOmin，O.5mg/mlDAB和0.05%H202孵化，阴性对照组只和第二抗体孵化。所有切片用苏木素染色、脱水、封片，然后光镜下阅片。3)实时RT-PCR:为了证实基因芯片检测的结果，用提取的RNA对DPT进行了实时RT-PCR检测。用QIAGEN公司生产的RNeasy试剂盒对RNA进行纯化。将RNA反转录为cDNA，用于实时RT-PCR的DPT特异上游引物序列为CAGCAAGAAGGAAGGTTCTGACA，下游引物序列为GGTTCCCCGAGGCTCTGT。依据说明书，用SYBRgreenI试剂盒和LighteCycler进行实时PCT。3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参与目的基因同时扩增。结果的分析用3.5版本的LightCycler软件。分别利用溶解曲线和1.2%的琼脂糖凝胶电泳对实时PCR的产物进行分析，比较心衰组和非心衰组产物量的变化。2.实验结果本发明第一次涉及DPT在终末期心衰中的表达情况，我们发明的这种用血清快速准确检测DPT来评估终末期心脏病的方法具有极大的临床意义和推广意义。1)相比于非心衰组，在ARVC所致心衰组有77个基因普遍和持续的表达改变至少1.5倍，其中有35个基因表达上调、42个基因表达下调。DPT表达上调3.5倍，见表2。表2.ARVC所致心衰组表达上调的基因-Functionalcategories:功能分类；AccessionNo.:人类基因组编号；GeneSymbol:基因縮写；FoldIncrease:增加倍数<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2)免疫组织化学和光镜检查可见ARVC心肌组织不同程度的被纤维脂肪组织取代，这是诊断ARVC的特异性表现之一。在免疫组织化学中可见ARVC心衰组有大量的DPT免疫反应，表现为残余心肌组织中细小颗粒样物，如图1所示。图1苏木素伊红(HE)染色光镜所见(上面两图)和使用多克隆抗体免疫组化DPT(下面两图)。ARVC-HF:致心律失常性右室心肌病所致心衰组；NF:正常非心衰对照组。3)通过实时RT-PCR证实，DPT的mRNA在ARVC所致的心衰患者心肌中的含量是非心衰心肌中含量的1.59倍，基因芯片的结果则显示心衰心肌组织中的含量是非心衰心肌中的3.5倍，如图2所示，图2为基因芯片和实时RT-PCR检测心衰组织DPT相对于非心衰组织DPT的表达变化。基因芯片检测的结果显示心衰组织中DPT的含量是非心衰组织中含量的3.5倍，RT-PCR的结果显示心衰组织中DPT的含量是非心衰组织中的1.59倍。这两种方式检测的结果是一致的，都说明心衰组织比非心衰组织中DPT的含量升高。实施例2用本发明试剂盒检测终末期心衰组和正常组血清DPT的表达终末期心衰96例，健康对照100例，用试剂盒检测终末期心衰组和正常组血清DPT的表达，并用SPSS17.0软件ROC曲线分析DPT检测心力衰竭的敏感性和特异性。1.具体步骤DPT用酶联免疫吸附试验评估。根据商用DPT的ELISA试剂盒(产品目录)说明书进行。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100iU，余孔分别加标准品或待测样品100ia，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37t:反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验使用新的标准品溶液。弃去液体，甩干，每孔加检测溶液A工作液100ia(在使用前一小时内配制)，酶标板加上覆膜，37。C反应60分钟。弃去孔内液体，甩干，PBS洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350iU/每孔，甩干，每孔加检测溶液B工作液100ii1，酶标板加上覆膜37t:反应60分钟后弃去孔内液体，甩干，PBS洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350iU/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90iU，酶标板加上覆膜37t:避光显色，30分钟后每孔加终止溶液50ia，终止反应，此时蓝色立转黄色。用酶联仪在450nm处，以空白对照孔调零后测各孔光密度(OD)值。2.实验结果SPSS软件中ROC曲线分析可对不同的检验方法进行科学评价，把方法的敏感性与特异性结合起来分析，而不仅侧重于其敏感性或特异性，又能表示为该法"曲线下的面积越大其诊断试验效果越好"，既全面又直观。通过改变诊断界点，获得多对TPR与FPR值，以1-特异性为横坐标，敏感性为纵坐标，绘制ROC曲线，计算与比较ROC曲线下面积，以此反映诊断试验的诊断价值。SPSS17.0分析DPT检测心力衰竭的ROC曲线下面积为0.709。如图3所示。另如图4所示，用试剂盒检测终末期心衰组和正常组血清DPT的表达，结果在终末期心衰组中血清DPT的表达比正常对照组高，p<0.Ol，具有统计学意义。综上所述，由以上实例可清楚的得知，本发明所述DPT在制备诊断心力衰竭试剂盒的应用具有很好的效果，组织和血清学检测均具有良好的敏感性、特异性和准确性。具有很好的应用价值和市场前景。9权利要求皮肤桥蛋白在制备检测心力衰竭试剂盒中的用途。2.—种检测心力衰竭的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有皮肤桥蛋白特异性结合的抗体。3.根据权利要求2所述的一种用于检测心力衰竭的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括纯化抗体包被的微孔板，酶标抗人IgG及其它试剂。4.根据权利要求2或3所述的用于检测心力衰竭的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成为1)酶联板包被有经过纯化的人DPT特异性抗体；2)标准品胎牛血清、重组DPT、10mmol/L磷酸缓冲液、0.02%硫酸庆大霉素和0.11%kathonGC防腐剂；3)生物素标记抗体稀释液；4)辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液；5)生物素标记抗体；6)含有50mmol/L枸橼酸盐、磷酸盐缓冲液、4X二甲基亚砜、0.03%3，3'，5，5'-四甲基联苯胺和0.02%H202;7)洗涤液:10,1/L磷酸缓冲液、0.05%吐温20和0.1%kathonGC防腐剂;8)终止液0.3mmol/L硫酸溶液。全文摘要本发明公开了皮肤桥蛋白在制备检测心力衰竭试剂盒中的新用途及检测试剂盒。本发明经实验验证DPT可以用于检测心力衰竭，本发明的这种用血清快速准确检测DPT来评估终末期心脏病的方法具有极大的临床意义和推广意义。在ARVC所致心衰组DPT的表达上调了3.5倍。本发明DPT制备的检测心力衰竭的试剂盒优势有敏感度和特异性高，血清稀释比例高，与现有检测心衰的方法相比较，成本低、效率高、使用方便等。文档编号G01N33/68GK101782583SQ201010110940公开日2010年7月21日申请日期2010年2月10日优先权日2010年2月10日发明者刘晓艳,张晓玲,张浩,张芃,胡盛寿,郑哲,魏英杰,黄洁申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院
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