专利名称：一对部分同序引物减少其二聚体的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术及核酸扩增PCR技术领域，具体涉及一种减少引物二 聚体形成的引物设计方法。
背景技术：
核酸研究从确立遗传物质基础为核糖核酸DNA起，历经半个多世纪的探索，到 1953年Watson和Crick建立了 DNA双螺旋结构模型及阐明了其中心法则，从而开启了核 酸研究的分子生物学时代。由于各种核酸DNA都是由四种碱基排列组成的仅编码遗传信 息不同的线性结构，其物理化学性能基本一样，难以通过一般理化技术分离纯化微量目的 基因或特异性检测微量靶基因。二十世纪70、80年代美国冷泉港(Cold Spring Harber) 实验室开发出了完整系统的基于细菌单克隆筛选基因文库及转化基因的分子克隆技术，然 而要得到目的基因仍是费时、繁琐的工作。检测靶基因只能通过合成探针经印迹杂交(Dot Blotting)才能检测纳克(ng)级的分子，且定量不准确，操作繁琐。早在1971年，Korana就提出了核酸体外扩增的设想“经过DNA变性，与合适的 引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983年美国 PF-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis偶然的产生了核酸扩增的灵感于试管中模 拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件一模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合 酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端 序列的一段DNA分子。核酸扩增PCR反应由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的 变性拟扩增的模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形 成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至左右，引物与模板DNA单 链的互补序列配对结合；③引物的延伸升温至72°C左右，DNA模板一引物结合物在耐热 DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，不断重复循环变性一退火一延伸三过 程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2 3分钟，2 3小时就能将待扩目的基因呈指数扩增放大百万倍以上。反应 最终的DNA扩增量可用Y= (1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平⑴ 均每次的扩增效率，η代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中 平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的 逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞 效应” 一平台期。Mullis经过一系列研究证实了这一技术，申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。随着ABI-PE等公司开发出各种热循环PCR仪，包括最初的水浴锅式，以及压缩 机制冷式和目前广泛应用的半导体制冷式PCR仪。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到Taq耐热DNA聚合酶以及pfu、Vent、 Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便 而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。在以后的二十年里，多达数十种 PCR新改进，新方法不断涌现，被发明，包括反转录PCR(RT-PCR)，原位PCR，连接酶链反应 (Ligase chain reaction, LCR),标记 PCR(Labeled primers, LP-PCR), Jx.( PCR(reverse PCR,扩增两引物外侧未知序列)，不对称PCR(asymmetric PCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重组 PCR(recombinant PCR)，巢式 PCR(nest PCR)，多重 PCR(multiplex PCR)，免 疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA 差异 PCR，链替换扩增(Strand displacement amplification, SDA)，依赖核酸序列的扩增(Nucleic acidsequence-based amplif ication，NASBA)，转录 依赖的扩增系统(Transcript-based amplificationsystem, TAS)，Q^ 复制酶 ^hbeta r印licase)催化 RNA 扩增，滚环扩增(Rolling circleamplification, RCA)，环介导的等 温扩增(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)等，尤其是近年来各种实时 荧光PCR(Real-time PCR)技术的发展实现了从定性测定到精确定量的飞跃，如荧光染料 SYBR Green I 实时荧光 PCR和各种荧光探针 jTaqman(Hydrolysisprobe) ,FRETHybridition probes, and Molecular Beacons PCR,详见综述(Maisa L.Wong and Juan F. Medrano, BioTechniques 39 :75-85, July 2005)。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物 量(荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物荧光信号达到对数期的循环数 Ct值(Cycle threshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀 释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。核酸扩增技术极大提高了基因克隆效率及核酸检测灵敏度、效率，PCR应用已拓 展到生物学的许多领域。PCR技术已不是单一技术方法，而是包括一系列理论、方法学及应 用的新学科。详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业 出版社2005年)，PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究， 及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，成为现代分子生物学最核心的基础技 术。截至目前全世界与PCR相关的专利已多达数千个以上。所有这些核酸扩增PCR技术的质量控制及实验条件优化的核心、关键主要在于 其扩增引物的质控及设计。引物对的特异性(尤其3’端)长度、GC含量、退火及融解温 度、稳定性、同源互补性及二级结构等等就决定了 PCR产物扩增的特异性、产物的有无、本 底背景大小、检测灵敏度、是否可定量以及可重复性等等。关于引物的设计工作，现有许多 商业引物设计软件如 PRIDE、PRIME+、D0PRIMER、PRIM0、MEDUSA 和 Primer Master 等，也有 更多的在线引物设计网址可供应用选择，如I^rimerf……等等，详见综述(F.John Burpo, Biochemistry218 :1-11, Aug 2001 禾口 Vinay K. Singh&Anil Kumar, Molecular Biology Today2(2) :27_32，2001)。然而这些生物信息软件只解决了以上这些一般性优化条件，采用 这些原则应用软件设计的没有连续互补序列的引物对，在特异性、长度、GC含量、退火温度 Tm值及二级结构上最优化的合成引物对在实际工作中总或多或少存在引物二聚体问题，且 没有规律性，试验结果重复性差，优化后引物对仍形成二聚体的根本问题尚未见公开报导 的解决方法。引物二聚体的形成不仅产生高噪音本底，尤其严重干扰采用荧光染料STOR Green I的实时荧光PCR低拷贝(copy)样本的定量准确性或弱阳性的判断；也竞争性干扰 模板的特异性扩增效率，使大多数实时荧光定量PCR技术定量不精准。
发明内容
为了克服引物对二聚体造成的PCR高背景不易进行荧光染料STOR Green I实时 荧光PCR对低浓度样本检测分析的局限。本发明“一对部分同序引物减少其二聚体的方法” 根据任意对引物在STOR Green I实时荧光PCR检测中总是或多或少存在引物二聚体，而任 意单一引物相互间只要没有连续三个碱基以上的互补，就总是没有任何二聚体形成的实验 前提，提供一种设计中间区部分序列相同的引物对，近似单一引物，从而大大减少二聚体形 成的设计合成方法。“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”其特征在于，没有任何连续互补碱基的 一对引物中间区域预先设置一段4-lOkis同样序列，类似于单一引物自身的同样序列，不 形成二聚体的机理，从而减少引物二聚体形成的程度，优化PCR质量。其特征还在于中间部 分同序引物对3’末端为l-5kiSe靶特异性序列碱基。其一 3’最末端碱与另一 3’末端最 后两碱基绝对避免互补也要避免间隔互补碱基，其特征还在于中间部分同序引物对5’端区 域沿5’ -3’方向平行比对，不要有3个以上间隔碱基互补。所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”的引物设计，其策略原则是首 先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16 Mkise长的优化引物对，在其中间位置，都 从5’ -3’方向设置一段4 lOkise完全相同的序列，优选设置6 Sbase完全相同序列； 引物对3’末端(即相同序列下游尾端)为1 5个base靶特异性序列，优选2 4base 绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还 不能在最末端两碱基；引物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4 10个kise靶特异 性序列，优选6 Sl3ase绝对没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个 互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”优化PCR，其特征是中间部分同 序的引物对(下面将简称“同序引物对”)，进行STOR Green I实时荧光PCR。同序引物对 的浓度(1_5μΜ)也很重要，浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值)，过浓引物也将本底 的Ct值前移(数字减少)，干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进一步增加扩增 特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热 聚合酶或加热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善采用同序引物对的 SYBR Green I实时荧光PCR质量。所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”增加PCR灵敏度，其特征是使用 新型STOR Green ER荧光染料，提高灵敏度10倍以上；也可联合采用巢式nest-PCR，先利 用靶外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因，再采用靶内侧短的同序 引物对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”用于创新PCR，其特征是采用单 一引物，并与靶特异性引物联用，这样就绝对没有引物二聚体的困扰。单管两步法扩增，先 用稀有基因靶特异嵌合引物进行长时高温退火少量热循环扩增特异性靶基因，产生两端均 带少量稀有基因的二次靶模板，再采用单一稀有基因序列引物，常规退火温度退火结合二 次模板两侧定量PCR扩增分析。所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”用于软件，基因检测盒，盒成份包括核酸提取试剂，IOmM dNTPs, Taq聚合酶及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，引物F/R。本发明“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其理论依据是基于长期的实时 染料荧光PCR试验经验总结。在没有加阳性靶基因的核酸扩增系统中，最佳设计的任意引 物对总是存在一定的Ct值，约在25至35循环数之间，而仅加双倍量任意单一引物的荧光 值(引物延伸时读取荧光值)总是一条直线，没有高出基线的Ct读值。也就是说优化的任 意引物对(序列特异)总会形成一些二聚体，其解链温度多在75°C-77°C;而单一引物在相 同条件下绝对不会形成引物二聚体。见图1。这就提出了一条创新途径，如果一对引物近似 单一引物就不会产生二聚体，那么引物对怎样相似或相同多少就可以像单一引物而不会形 成二聚体？为什么没有互补序列及内部互补发夹二级结构的单一引物不会形成引物二聚 体？分子机理是什么？沿着这条思路，从二聚体形成理论机制和检测引物二聚体最灵敏的 SYBR Green I实时荧光PCR实验两个方面来破解引物二聚体形成真正原因，找出减少引物 二聚体程度的正确方向。首先采用荧光染料STOR Green I实时荧光PCR，试验系列引物对近似度与二聚体 程度的关系。荧光染料STOR Green I是一种双链DNA结合染料，游离时不发出荧光，随着 双链模板扩增，相对应结合的染料就越多，发出的荧光强度Ct值与最初靶基因浓度存在负 对数关系。但是引物二聚体双链亦同样有效结合染料而发出荧光。试验选择一条特异性序 列引物A，不加靶模板，仅加双倍浓度单一引物A的荧光PCR系统扩增，荧光值仅为一条直 线；再人工合成另一条有四个碱基(base)以下连续不同的同一序列寡核苷酸引物B，与引 物A作为引物对，A-B不加模板扩增，荧光值大多为一条直线，部分仅在Ct38才高出基线一 点点，而且连续四个不同碱基在引物中的位置没有影响，说明高度近似的引物对基本没有 二聚体；再人工合成另一条C有7个以上连续不同，但与A没有连续互补的同一引物，与最 初A引物作为引物对，A-C不加模板扩增，其Ct值大多为30 35，甚至连续7个kise以上 不同位于引物5’端也会使荧光值升高，Ct值为30 35。说明不连续的碱基互补，只要足 够多G 6个以上)就能使引物对相互靠近结合，使其3’端找到互补点结合延伸形成二 聚体。换句话说A-C引物对3’端6 Sbase以上连续相同，均为同样序列末端的引物，只 要引物对哪怕是5’端有3个kise以上连续互补，或4 6个kise以上不连续互补就可以 增加引物二聚体形成程度；再人工合成另一条D引物，5’端与A有4个kise不同，同时3’ 端有3kiSe不同，组成A-D引物对，荧光值仍在Ct值35以后才高出基线，也不容易形成二 聚体；这就说明不连续的碱基互补，距离越近就越类似连续碱基互补，容易结合形成引物二 聚体。距离越远，结合力就会越分散，不易形成引物二聚体。最后合成一与A序列完全相同 但5’ 一3’方向相反的E引物，A-E引物对不加模板扩增，Ct值仍约30左右，与普通引物对 形成二聚体无异。这就更进一步说明，一对引物高度近似性且必须都是5’ -3’方向相比较 高度近似性才是避免引物二聚体的唯一正确方向。结果见图2。再由此推导出引物二聚体形成机理的理论假设一般的高度互补引物对二聚体形 成机理是以其3’末端大段连续的互补碱基对头(一条5’ -3’方向，另一条3’ -5’方向) 方式配对结合，末端在聚合酶和底物dNTP作用下延伸，形成二聚体双链。而优化的引物对 没有连续互补碱基形成的合力，其3’末端极少几个不连续互补碱基形成氢键的能力太弱， 不足以抵抗引物链因大量磷酸基团负电荷所形成水化分子颗粒之间的斥力及分子热运动 的阻力，即使降低引物溶液温度也不足以配对结合，还需要除3’末端外的更多个不连续互补碱基的合力才能促使3’末端极少的互补碱基氢键形成。因此，一般优化引物对形成二聚 体过程是优化引物对首先是均以5’ -3’方向平行配对，以多个不连续互补碱基的合力形 成多处氢键，促使引物对3’末端靠近并使末端扭曲，以局部对头配对，将末端极少的不连 续互补碱基配对形成氢键，再互为“引物”延伸形成引物二聚体。单一引物自身不能形成二 聚体的机理也就清楚了 首先自身引物对以5’ -3’方向平行完全不能配对，仅靠3’末端极 少的不连续互补碱基不足以形成氢键，绝对形成不了二聚体。当然，单一引物其一 3’末端 也可以对头方式与另一引物5’区偶尔配对，其极少的互补碱基借助3’末端以外的多处不 连续互补碱基合力而形成氢键，产生极少量的短二聚体，其解链温度低于65°C，基本不影响 本底。而同一反向引物对，序列完全相同，仅其中一条颠倒顺序的引物对，对头时虽完全相同，不形成二聚体；但均以5’ -3’平行配对时总会形成一些多个不连续间隔的氢键，助其 3’末端配对结合，延伸形成二聚体，与普通引物对无异。引物对设计的核心关键首先如绝大多数已发表的引物设计策略，引物对正反两 个方向相比较都不能有连续的互补碱基。但是，引物对平行之间(均5’-3’方向平行对比， 逐一或许平移比对)有多个相近的不连续间隔的互补碱基亦是影响引物二聚体形成的关 键因素。关于这方面的实验、理论和引物设计还尚未见报导。引物设计时选择没有(排除) 任何连续的互补碱基的引物较容易，但对于多数长约20个kise的引物，由于仅4种碱基的 排列组合很容易产生多处不连续的、间断的互补碱基，足以影响二聚体的形成。怎样将这些 不连续的互补碱基数降低到数量最少和合力最小。策略是在引物对序列中间设置一段序列 完全相同的部分以提高引物对的相同性，并将相同序列置于不连续的互补碱基序列中间以 分散它们的合力，分散越远合力就越小。由此得出一创新引物设计原则首先遵守一般引物 设计所有原则，选择一对16 Mbase长的优化引物对，在其中间位置，都从5’_3’方向设置 一段4 lOkise完全相同的序列，优选设置6 Skise完全相同序列；引物对3’末端(即 相同序列下游尾端)为1 5个lDase靶特异性序列，优选2 4base绝不连续互补的靶特 异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能留在最末端；引 物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4 10个kise靶特异性序列，优选6 Sbase 绝对没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔 的3对不连续互补碱基。接下来是怎样找到引物对中间预选的6 8个kise完全相同序 列？首先选择一段靶基因，将其有意义链与反意义链都从5’ -3’端方向排序(Alignment) 分析，有4 5kiSe相同序列的较多，6 Sbase以上完全连续相同的情况少见一些，大部 分基因总会有一段这样中间隔100-300bp的回文序列。再按上面的原则选优。如果机遇不 佳，只能找到4 ^ase的相同序列，也可选择引物对的其中一条在相同序列的上游相邻处 (即引物中间)突变一个碱基与另一条相同，增加一个相同碱基，达到5-6个kise完全相同 序列，并在这一条引物5’端和3’端，各再加1 2个base原靶序列的相应碱基以弥补中 间碱基突变所造成的退火温度损失。最高相似度引物设计策略就是PCR上下游扩增引物干脆采用单一引物，这样就绝 对没有引物二聚体的困扰。也就是人造单一引物与靶基因特异性引物相结合的方法。首先 在一对长达25kiSe的靶特异性上下游引物5’端前面都加上同一个12 13kiSe长的稀 有基因序列，并合成一对长约35 40kiSe的杂合引物对。单管两步法扩增，先加常规量1/20-1/50浓度的这对杂合引物(二聚体量少)，利用其3’端的靶特异性进行长时高温退 火结合靶模板，预先少量热循环扩增特异性靶基因，产生两端均带少量稀有基因的二次靶 模板，再合成同一稀有基因序列3’端后面加上34base的靶特异性引物对5’首端序列而 合成的高达90%相同的引物对，常规退火温度退火结合二次模板两侧，最后定量PCR扩增 分析。采用中间部分同序的引物对(下面将简称“同序引物对”)，进行STOR Green I实 时荧光PCR。同序引物对的浓度也很重要，浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值)，过浓 引物也将本底的Ct值前移(数字减少)，干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进 一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶， 化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善采用 同序引物对的STOR Green I实时荧光PCR质量。常规STOR Green I定量实时荧光PCR最 小检出灵敏度可达50拷贝(copy) /次反应，如果需要进一步增加检测灵敏度，既可使用新 型STOR GreenER荧光染料，提高灵敏度10倍以上；也可联合采用巢式nest-PCR，先利用靶 外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因，再采用靶内侧短的同序引物 对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。一、引物对相似度与二聚体形成的实时PCR实验采用STOR Green I荧光染料的实时PCR，在开始的1_15个循环中，靶基因扩增量 还不是增加很多，STOR Green I染料结合双链DNA发出荧光的值很低，到15个循环后DNA 增加进入对数期，每个循环产量增加一倍；很快DNA合成的底物和聚合酶急剧消耗，对数后 期每一个循环产量不到理论的一倍；最后产量不再增加，进入平台期。所以对数早期定量是 最精准的，因此，以最初的1-15个循环平均荧光值作为基线，人为设置高于基线10倍荧光 值的循环数作为循环阈值Ct (Cycle threshold)值。初始靶分子稀一倍，扩增达到同样量 (同样荧光值)的循环数Ct值就要多一个，反之靶分子浓一倍，Ct值就少一个，为负对数关 系。染料实时荧光PCR定量靶分子Ct值一般在15-30之间定量较准确。问题是一对 引物不加靶模板扩增时Ct值往往在30-35之间，甚至在30左右，干扰低浓度靶分子的测 定。而双倍量的单一引物不将模板扩增荧光值为一直线，不升高进入对数期，没有Ct读值， 也就说单一引物没有二聚体双链形成。因此选择乙型肝炎病毒HBV靶基因的一条引物HBVR2作为实验，以HBVR2基准引 物为人为设计合成系列逐步变异(变异部位以下划线表示)不同的引物作为引物对不加模 板扩增，来测试引物对相似程度与二聚体形成之间的关系。HBVR2 :5，_c atg gtg ctg gtg aac_3，Bia3F3 :5， _c atg gtg ctg gtg tct_3，Bia5F4 :5，~r get gtg ctg gtg aac_3，BiamF 5' -c atg gtc gag gtg aac_3，Bia53F:5，~g_gac gtg ctg gtg tct_3，Bia5F7 :5，~r Rct tea ctg gtg aac_3，和一条完全倒置反向的HBVR2 DHBVF 5' —caa gtg gtc gtg gta c_3，
设置6组变异引物对PCR反应
变异引物作为上游引物F(5 μ Μ)0. 5μ 1
下游HBVR2反向引物(5 μ Μ)0. 5μ 1
IOmM dNTP0. 5μ 1
IOXTaq buffer2. 5μ 1
Taq0. 5μ 1
SYBR Green I1. 5μ 1
dH2019 μ 1
25 μ 1
和单一引物HBVR2对照
下游HBVR2反向引物(5 μ Μ)1 μ 1
IOmM dNTP0. 5μ 1
IOXTaq buffer2. 5μ 1
Taq0. 5μ 1
SYBR Green I1. 5μ 1
dH2019 μ 1
另设一有HBV模板阳性对照pUCHBV+P上游HBVF2正向引物(5 μ M)下游HBVR2反向引物(5 μ Μ)IOmM dNTPIOXTaq bufferTaqSYBR Green IClH2O_25 μ 1上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)。 首先变性94°C 4分钟，然后40个循环，95°C 30秒，52°C 30秒，74°C 30秒。于74°C读取荧 光值，并设置52°C _95°C融解曲线分析。实验结果见图2 除Bia5F7和DHBVF的Ct值明显提前外，其它组Ct值较双倍单 一引物实验组对照变化不是很大。二、引物设计公式和STOR Green I实时荧光PCR定量实时荧光PCR中间部分同序引物对F/R的设计公式为首先排除任何连续互补碱
基序列。L(LeftTerminal 5，区)+M(Middle 中间同序区)+R(Right End 3，端)=长度
25 μ 1
0. 5μ 1 0. 5μ 1 0. 5μ 1 0. 5μ 1 2. 5μ 1
0.5μ 1
1.5μ 1 18. 5μ 116-24base。L :F/R比对至少不能有3个以上间隔互补碱基的靶特异序列，或F/R为完全同样 碱基序列。M :F/R都为4-lOlDase同样碱基序列并为靶特异序列。R :F/R为l-5kiSe靶特异序列，其一 3’最末端不与另一 3’末端最后两碱基互补， 亦不能有间隔互补碱基。SYBR Green I实时荧光PCR定量单个反应模板(Template)10 μ 1上游正向引物F (5 μ Μ)0. 5μ 1下游反向引物R(5 μ Μ)0. 5μ 110mM dNTP0. 5μ 110XTaq buffer2. 5μ 1Taq0. 5μ 1SYBR Green I1. 5μ 1dH209μ 1 _25 μ 1实际操作时，每个样本取40 μ 1，加入30 μ 1 A液(包括上游正向引物F 2μ 1, IOmM dNTP 2 μ 1，SYBR Green I 6 μ 1, dH20 20 μ 1)和 30 μ 1 B 液(含下游反向引物 R 2μ 1，IOXTaq buffer 10 μ l，Taq 2μ l,dH20 16 μ 1)。然后每个样本分取 3 份X 25 μ 1 平 行检测，分析统计结果。上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc. DNA Engine 0ption 2)。 首先变性94°C 4分钟，然后40-45个循环，95 °C 20-30秒，52 °C 20-30秒，74°C 20-30秒。于 74°C读取荧光值，并设置52°C _95°C融解曲线分析。
图1.为三对典型引物对二聚体和三个单一引物实时荧光PCR荧光值图，单一引物
荧光值为一直线。图2.为引物对相似度与二聚体形成的实时荧光PCR循环数Ct值分析，Bian5F7/ HBVR2的循环数CU8. 3，DHBF/HBVR2的循环数CU6，其余都约Ct37_38。图3.为HBV实时荧光PCR定量双份间的平行性和图4的线性分析。图5.为HBV实时荧光PCR精确定量和图6的线性分析。具体实施例乙型肝炎病毒载量实时荧光PCR检测以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于 本发明的范围。乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)引起 的一种世界性的传染性疾病。在我国人群中乙肝感染率非常高，极大的�：α巳嗣堑纳硖� 健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(PCR)荧光定量法等。酶免疫法应用较广，但是实时荧光PCR定量法可以精确测定乙型肝炎 病人的病毒载量，对感染者病毒复制水平的判断，病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有 无法替代的重要作用。选取乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus，HBV)X区(1545-1887)序列如下加粗部 分为保守区，划线部分为实时荧光PCR扩增引物。将全长该序列克隆到PUC19
权利要求
1.“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是设计PCR的一对扩增引物最基 本原则是尽最大比例的近似单一引物。所述PCR引物对中间区域沿5’ -3’方向设置一段 4-10BASE同样序列以分散引物链多处间隔互补碱基所形成氢键的合力；所述引物3’末端 预留Hbase，其一 3’最末端与另一条3’末端最后两个碱基绝对避免互补，也要避免有间 隔的碱基互补。所述中间部分同序引物对5’端区域沿5’-3’方向平行比对，不要有3个以 上间隔碱基互补，从而优化PCR质量。
2.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其设计原则是 首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16 Mbase长的优化引物对，在其中间位置， 都从5’-3’方向设置一段4 lOkise完全相同的序列，优选设置6 Sbase完全相同序列； 引物对3’末端(即相同序列下游尾端)为1 5个base靶特异性序列，优选2 4kiSe 绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还 不能留在最末端；引物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4 10个kise靶特异性 序列，优选6 Sbase绝对没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互 补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。
3.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是中间部 分同序的引物对(下面将简称“同序引物对”)，进行STOR Green I实时荧光PCR。同序引 物对的浓度也很重要，浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值)，过浓引物也将本底的Ct值 前移(数字减少)，干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进一步增加扩增特异性 和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶 或加热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善采用同序引物对的STOR Green I实时荧光PCR质量。
4.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是使用新 型STOR Green ER荧光染料，提高灵敏度10倍以上；也可联合采用巢式nest-PCR，先利用 靶外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因，再采用靶内侧短的同序引 物对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。
5.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征采用单一 引物，这样就绝对没有引物二聚体的困扰。单管两步法扩增，先进行长时高温退火少量热循 环扩增特异性靶基因，产生两端均带少量稀有基因的二次靶模板，再采用单一稀有基因序 列引物，常规退火温度退火结合二次模板两侧定量PCR扩增分析。
6.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是所述的 “一对部分同序引物减少其二聚体的方法”基因扩增试剂盒，成份包括样本核酸提取试剂， IOmM dNTPs, Taq聚合酶及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，引物F/R。
全文摘要
本发明“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，根据发明人的发现-没有连续互补碱基的引物对沿5’-3’方向平行配对形成多处间隔氢键的合力促使它们3’末端个别互补碱基形成氢键使末端结合延伸成二聚体；和单一引物自身不形成二聚体的现象。尽最大比例设计PCR引物对近似单一引物。其特征在于PCR引物对中间沿5’-3’方向预设一段4-10bsae同样序列，所述引物对3’末端1-5base避免间隔互补碱基，所述5’端区避免3个以上的间隔互补碱基，最好5’端完全同序。可极大减少引物二聚体形成，优化PCR质量，尤其是荧光染料实时PCR。
文档编号G01N21/64GK102146432SQ20101010537
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者刘涛, 张宝林, 张辉, 江必胜, 江洪 申请人:北京泰格瑞分子检验有限公司
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