专利名称：多发性硬化症的风险评估方法
技术领域：
本发明涉及诊断和评估多发性硬化症预后的方法和试剂。
背景技术：
多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)的一种慢性自身免疫性炎症性疾病。 这是导致青壮年永久残疾的常见原因之一。当患者患有MS时，免疫系统破坏了大脑和脊髓的轴突髓鞘，造成了各种神经系统病症。MS最常见的类型为复发-缓解型(RRMS)，即在无疾病进展(稳定)的部分或完全康复期(缓解)后出现急性神经功能恶化的发作(病情加重，疾病侵袭)。临床上具有使用简单的血清学检测以预测的需要i)有首发表现(FP)，又称为可进展为多发性硬化症(MQ的临床孤立综合症(CIQ的患者，是否会在一定的时间内进展为 MS ；ii)处于CIS期的患者是否存在快速的病情进展的风险，以导致加剧的临床残疾，因此可能需要侵入性的缓解疾病治疗(DMT)；或者iii)处于CIS期的患者是否会有常规或相对缓慢MS疾病进展，从而导致较轻的残疾，需要较少的积极性的治疗。也有用简单的血清学检测预测下述的临床需要i)诊断为RRMS的患者是否有快速病情恶化的高风险，并将导致中枢神经系统(CNS)的高度炎性病变，这可通过磁共振成像(MRI)或临床残疾的累积看出， 并因此可能需要侵入性的缓解疾病疾病治疗(DMT)；或ii)诊断为RRMS的患者是否将有常规或相对缓慢的MS疾病进展，具有较小的磁共振成像(MRI)活性和较少的累积残疾，因此需要较少的积极治疗。发明概述本发明解决了在多发性硬化症(MS)领域一个长期存在的问题，即如何预测一个患有可发展为MS的临床孤立综合症(CIS)的个体的病程。涉及的方法包括将个体定性为两组中一组的成员(i)那些有可能迅速进展到临床确诊多发性硬化症(CDMS)的个人，即在M个月之内，以及(ii)那些有可能较慢进展到临床确诊多发性硬化症(CDMQ的个人， 即超过M个月。涉及的方法还包括将个体定性为另两组中一组的成员(i)那些有可能迅速进展到临床残疾的个人，即在5年之内，以及(ii)那些有可能较慢进展到临床残疾的个人，即超过5年。本发明一部分是基于这样的发现，抗聚糖抗体在评估可进展为多发性硬化症(MS) 的临床孤立综合症(CIS)的患者是否将临床复发(例如在M个月中)的风险时十分有效。 本发明也基于发现抗聚糖抗体可有效评估可进展为多发性硬化症(MQ的临床孤立综合症 (CIS)患者是否将有快速的病情恶化和积累残疾的风险，例如，在一定的时间范围内(如5 年)的永久性残疾。
此处所述的抗聚糖抗体被用来预测在规定的时间段内的第二次神经侵袭，例如， 在大约48个月中；在大约36个月中；在大约M个月中；在大约12个月中；或者在大约6个月中。抗聚糖抗体也被用来预测MS病程进展，其中病程进展可用扩展残疾状况评分(EDSS) 衡量，EDSS是一个评级系统，用于分类和规范MS患者的状况。例如，MS病程进展预测，须在规定的时间段内，如，在大约20年内；在大约10年内；在大约7年内；在大约5年内；或者在大约4年内。MS病程进展以EDSS单位来衡量，例如，进展大于一个EDSS单位；进展大于两个EDSS单位；进展大于3个EDSS单位；或者进程大于6个EDSS单位。病程进展的速度 (快vs.慢)是由抗聚糖抗体水平在患者样本中相对量/等级决定的。首先，测试样本是来自CIS患者或最近确诊为患有首次神经事件的个体。合适的测试样本包括一种生物流体，选自全血、血清和血浆组成的组合。对测试样本进行各种抗聚糖抗体的检测，如抗-Glc(a l，2)Glc(a)抗体(GAGA2)，抗-Glc ( a 1，3)Glc ( a )抗体 (GAGA3)，抗-Glc(a l，4)Glc(a )抗体(GAGA4)，与抗-Glc (a l，6)Glc(a )抗体(GAGA6)。 优选地，抗体为IgM型抗体。测试样品的抗体水平与对照样本的抗体水平相比，其中，当测试样品的抗体水平高于对照样本的抗体水平时，表明在一定的时间段内，个体有更高的遭受第二次神经侵袭的风险，例如，在大约48个月中；在大约36个月中；在大约M个月中； 在大约12个月中；或者在大约6个月中。与在M个月内下一次复发的预测有关的对照是一个参考值，该参考值取自一个或多个MS患者，其特征为遭受了第一次神经侵袭后，又在超过M个月后遭受了随后(第二次)神经侵袭。例如，对照参考水平值与远期复发相关。远期复发是指一个MS患者，遭受过第一次神经侵袭或者有首发表现的，随后在M个月或更久以后遭受第二次神经侵袭，在第一神经侵袭或者有首发表现之后。本发明也提供一种方法，以区别CIS个体会在20年该个体的首发期(FP)中，在扩展残疾状态量表(EDSQ评分有进展，和在20年所述个体的首发期(FP)中个体不会在EDSS 评分有进展。首先，测试样本是来自CIS患者或最近确诊为患有首次神经事件的个体。合适的测试样本包括一种生物流体，选自全血、血清和血浆组成的组合。对测试样本进行各种抗聚糖抗体的检测，如抗_Glc(a l，2)Glc(a)抗体(GAGA2)，抗-Glc ( a 1，3) Glc ( a )抗体 (GAGA3)，抗-Glc(a l，4)Glc(a )抗体(GAGA4)，与抗-Glc (a l，6)Glc(a )抗体(GAGA6)。 优选地，抗体为IgM型抗体。测试样品的抗体水平与对照样本的抗体水平相比，其中，当测试样品的抗体水平高于对照样本的抗体水平时，表明个体在一定的时间段内，例如，在大约 20年中；在大约10年中；在大约7年中；在大约5年中；或者在大约4年中，有遭受更快MS 疾病进展(严重病程)的风险，以及用EDSS评分测量更高水平的残疾。该方法为临床医生提供了有价值的信息，来预测以EDSS测量的快速或缓慢进展至永久或临床残疾，例如，个体在20年中进展至少一个EDSS单位，例如，至少两个EDSS单位；至少3个EDSS单位；大于 3个EDSS单位；大于4个EDSS单位；或者大于6个EDSS单位，等，例如，快速进展被定义为在20年中进展大于等于6个EDSS单位。缓慢进展被定义为在20年中进展小于等于3个 EDSS单位。可选地，测试样本中低的抗体水平，与对照样本中的抗体水平等同或者相似，预示在相同的时间段内，个体可能有一个缓慢的MS病程进展。快速MS病情进展的预测控制是一个参考值，该参考值取自一个或多个MS患者，其被认定为有较高或者较低的EDSS分数。
“参考水平”意味着一组确定的MS患者各种抗体的平均数，中位数，一定的上限或下限百分比，范围水平。例如，该组是由在M个月中自CIS进展到下一次复发的患者，或在一定的时间段内MS残疾快速进展的患者组成。示范的抗体参考水平为平均值+/-0. 5，1， 1.5，或2个标准差的平均值(SD)。优选地，参考水平为平均抗体水平+/-1.5SD。个体的人数至少为5 ；至少为10，至少为25 ；至少为50 ；至少为100或更多的个人。参考水平由已知 MS进展属性的患者样本获得，例如，归档的血液，血清或血浆样品。在实践中，通过测试统计相关的队列中患者(例如，50例患者，100例患者，等等) 确定每种抗体参考血清样本类似的截止水平。即，高于25% ；高于20% ；高于15% ；高于 10%;或低于25%;低于20%;低于15%;低于10%。较高百分比的抗体水平表明有快速复发或病程快速进展的危险，而较低百分比的抗体水平则表明病程进展和复发的风险低。将参考血清样本制成等分试样，冷冻保存供日后使用。参考血清样本为校准样本，有一个预设的抗体水平(截止水平，参考水平，对照水平)。当分析测试样本的抗体水平时，测试样本和参考/校准/对照样本进行平行测试，如果测试样本中的抗体水平高于参考/校准样品的抗体水平，试验样品被认为是“阳性的”，例如，其属于抗体水平升高CIS患者亚组。类似地，如果在测试样品的抗体水平等于/相近或低于参考/校准样品的抗体水平，测试样品被认为是“阴性的”，例如，它属于抗体水平不升高的CIS患者亚组。临床指标包括敏感性，特异性，阴性预测值，阳性预测值，疗效计算须用到真阳性， 假阳性，假阴性和真阴性。一个“真阳性”的样本是MS阳性的样本，根据经典方法诊断/预测MS阳性，利用本发明的方法也诊断为阳性。一个“假阳性”的样本，根据经典方法诊断为阴性，而利用本发明的方法诊断为阳性。类似的，一个“假阴性”的样本，根据经典方法诊断为阳性，而利用本发明的方法诊断为阴性。一个“真阴性”的样本，根据经典方法诊断其评定的性状为阴性，而利用本发明的方法诊断为阴性。例如，参见Mousy (Ed.)，Intuitive Biostatistics New York =Oxford University Press (1995)，在此以参考文献并入本发明。此处所用的术语“灵敏度”是指在测量特征存在时实验室方法呈阳性的概率。灵敏度的计算公式为真阳性结果的数目除以真阳性和假阴性的总和。灵敏度本质上是衡量一种方法能正确地识别具有临床问题的个体的程度。在本发明的一种方法中，可以选择抗体的值，诊断/预测个体是否有较高的下一次复发或快速MS进展的风险的灵敏度至少约20 %， 也可以是，例如，至少约30%，40%，50%，60%，70%，80%或90%。此处所用术语“特异性”是指一种方法在没有测量特征的情况下呈阴性的概率。 特异性计算方法为真阴性结果数目除以真阴性和假阳性的总和。特异性本质上是衡量一种方法能排除那些没有测量性状的个体的程度。抗体切边界值可以选择为，当灵敏度至少约 30 %，个人的特异性诊断/预测在60-70 %，80-85 %，90-95 %，或者95-99. 9 %的范围内。“EDSS评分进展”是指以0. 5或1. 0为增量的由约1. 0到约10. 0的进展，例如，约 1. 0 至 5. 0 ；约 5. 0 至 10. 0 ；约 2. 0 至 4. 0 ；约 4. 0 至约 6. 0 ；约 6. 约 8. 0 约 8. 0 约 10. 0 ； 约1. 5约2. 5 ；约3. 0至3. 5，或者其他任意在1. 0和10. 0之间的增量。在某些情况下，多发性硬化症患者虽经治疗，但预后较差。术语“突破疾病”用来表示尽管采用改变疾病病程(DMT)疗法，仍有疾病活动或进展的临床或影像学证据(例如， 由扩展残疾状态量表(EDSS评分)测量)。突破疾病并不意味着病人治疗没有响应-它意味着，目前尽管采取治疗疾病仍旧活跃。在本发明之前，很难区分快速进展对DMT响应良好的患者和缓慢进展对DMT的响应不好患者。因此，本发明提供了一种确定将发展为突破MS的个体的方法。首先，个体提供一个测试样本。合适的测试样本包括一种生物流体，选自全血，血清，血浆组成的组合。从该组中选择一种抗体，抗GLC(a l，2)GLC(a)抗体、抗GLC(a 1，3)GLC( a )抗体、抗-GLC( a 1， 4)GLC组成(α)抗体、抗GLC(a l，6)GLC(a)抗体，对试验样本进行检测。在一方面，该抗体是IgM抗体。测试样品的抗体水平与抗体的对照水平进行比较，其中至少一种抗体水平高于抗体的对照水平，表明该个体是有可能发展为突破MS。可选地，将血样中的抗体水平与对照样本的抗体水平进行比较，不会进展为突破 MS的个体是通过检测，将个体样本抗体水平与对照样本的抗体水平相比，相同/类似或更低，予以区分。本发明还提供了确定患有临床孤立综合症(CIS)并在二十四个月内会进展到临床确诊多发性硬化症(CDMQ的个体的方法，利用个体提供的血液样本和血液样本检测血液中的抗 _Glc(a l，2)Glc(a)抗体，抗-Glc(a 1，3) Glc ( a )抗体，抗-Glc ( a l，4)Glc(a) 抗体，和抗-Glc ( a 1，6) Glc ( a )抗体。血液样本中的抗体水平与在二十四个月内未进展为 CDMS的CIS个体的抗体水平相比较。在二十四个月内进展为CDMS的CIS个体被确定，如果在血液样本中检测到与在二十四个月内未进展为CDMS的CIS个体的抗体水平相比更高的抗体水平。本发明还提供了确定一个患有CIS个体是否有可能在20年内遭受严重程度为MS病程快速进展的方法，利用处于CIS期个体提供的血液样本，从血液样本中检测抗-Glc (a l，2)Glc(a) (GAGA2) IgM 同型抗体，抗-Glc ( a l，3)Glc(a) (GAGA3) IgM 同型抗体，抗-Glc (a l，4)Glc(a ) (GAGA4) IgM 同型抗体，与抗-Glc ( a l，6)Glc(a ) (GAGA6) IgM 同型抗体。血液样本中的抗体水平与在20年内没有经历严重程度为MS快速进展个体的抗体水平相比。评价一个患有CIS个体有可能在20年内在EDSS评分进展大于一个单位，是依据检测到血液样本中的抗体水平高于20年内没有经历严重程度为MS快速进展个体的抗体水平，EDSS评分成为疾病严重程度的指标。本发明还提供了一个确定患有CIS个体有可能在20年遭受严重程度为MS病程缓慢进展的方法。利用处于CIS期个体提供的血液样本，从血液样本中检测抗-GlC (a 1，2) Glc(a) (6八6々2)1811同型抗体，抗-61(；(0 l，3)Glc(a) (GAGA3) IgM 同型抗体，抗-Glc ( a 1， 4)Glc(a) (GAGA4) IgM 同型抗体，与抗-Glc (a l，6)Glc(a) (GAGA6) IgM 同型抗体。血液样本中的抗体水平与在20年内没有经历严重程度为MS缓慢进展个体的抗体水平相比。评价一个患有CIS个体可能在20年内在EDSS评分进展低于一个单位，是依据检测到血液样本中的抗体水平相同/类似或者低于20年内经历为MS严重程度缓慢进展的个体的抗体水平，EDSS评分成为疾病严重程度的指标。本发明还提供了一个确定个体将发展为突破MS的方法，利用个体提供的血液样本，从血液样本中检测抗_Glc(a l,2)Glc(a)抗体，抗-Glc ( a 1，3) Glc ( a )抗体， 抗-Glc(a l，4)Glc(a)抗体，和抗-Glc ( a 1，6) Glc ( a )抗体。血液样本中的抗体水平与没有发展为突破MS个体的抗体水平相比，例如，采用/不采用DMT疗法，经临床或影像学检测个病程并没有进展的个体。确定一个个体有可能将发展为突破MS，是依据检测到血液样本
本发明还提供了一种计算机可读介质，包含有执行该方法的计算机可执行指令。 首先，存储至少一个与病人的血液样本中至少一种抗体水平相关的第一变量。可选地，抗体水平检测通过绑定于腔室或孔中固定聚糖来进行，并发出荧光信号；化学发光信号或者光密度信号，通过添加预先标记的与IgM同型有相同识别方式的第二种抗体。第二，存储至少一个与至少一种参考水平相关的第二变量。患者相关临床问题的危险因素i)转化为临床确诊多发性硬化症(CDMS) ；ii)EDSS测量的疾病快速进展的MS;或iii)突破MS，用至少包括第一和第二变量的函数计算。最后，输出风险因子。可选地，至少一个的第一变量对应于血液样本中抗-Glc (a l，2)Glc(a)抗体，抗-Glc (a l，3)Glc(a)抗体，抗-Glc (a 1， 4)Glc(a)抗体，和抗-Glc(a l，6)Glc(a)抗体的抗体水平。另一方面，至少一个的第一变量相应于血液中所述抗体水平，其抗体从以下抗体组合中选择抗-Glc(a ld)Glc(a) (GAGA2) IgM 同型抗体，抗 _Glc(a l，3)Glc(a) (GAGA3)IgM 同型抗体，抗-Glc (a 1,4) Glc(a) (GAGA4) IgM 同型抗体，与抗-Glc (a l，6)Glc(a) (GAGA6) IgM 同型抗体。除了上面所述的诊断及预后方法，本发明还解决了在多发性硬化症(MQ领域的长期问题-如何预测为复发-缓解型硬化症(RRMQ的MS患者的疾病活跃。该方法包括将个体定性为两组中一组的成员(i)诊断为RRMS的患者是否有快速病情恶化的高风险，并将导致中枢神经系统(CNS)的高度炎性病变，这可通过磁共振成像(MRI)或临床残疾的累积看出，并因此可能需要侵入性的缓解疾病疾病治疗(DMT)和ii)诊断为RRMS的患者是否将有常规或相对缓慢的MS疾病进展，具有较小的磁共振成像(MRI)活性和较少的累积残疾，因此需要较少的积极治疗。为了提高医生阅读和解释MRI扫描的能力，对比的材料，如化合物钆，往往被用来突出在大脑中的炎性区。钆-增强MRI扫描显示活动性病变，这意味着有血脑屏障破裂，也是炎症所在。因此，钆-增强病变是新的，据估计病变发展后钆只增强病变6个星期或更少的时间。这些病变被定义为“对比增强病变”。这种方式下，钆让医生能确定哪些病变是活跃的，哪些病变是不活跃的病变。使用此信息来评估疾病的活性，并确定是否发生复发。al ( β ) (GAAB)有关，这种分子发现于血脑屏障(BBB)，在同一时段内，对于RRMS患者，具有对比-增强Tl MRI病变比没有对比-增强T IMRI病变程度更高。特别地，对比-增强Tl MRI病变的频率被发现与更活跃RRMS病变相关。“对比-增强Tl MRI病变”是指通过Tl MRI扫描，并使用造影剂，提高医生阅读和解释MRI扫描的能力后可见的病变。例如， 包含钆的造影剂。本发明提供利用MRI检出病变来鉴别诊断为RRMS患者是否会有一个活跃病程的方法。在一个方面，MRI检出病变为对比-增强Tl MRI病变。首先，由诊断为RRMS的个体提供一个测试样本。合适的测试样本包括一种生物流体，选自全血，血清和血浆组成的组合。 检测/测量样本中抗-Glc(a 1，2)(^1(β)抗体(GAAB)的抗体水平。优选地，该抗体是IgM 型抗体。参考水平与在CNS中MRI检出病变风险相关(例如，对比-增强TlMRI病变)，其为一参考值，取自一个或者多个CNS中并没有任何MRI-检出病变MS患者。测试样本的抗体水平与对照样本的抗体水平相比，其中，当测试样品的抗体水平高于对照样本的抗体水平时，意味着个体有活跃病变的风险，因为其中枢神经系统(CNS)有检出对比-增强MRI病变，和快速MS病程进展(积极病程)并导致较高程度残废(突破MQ的风险。可选地，测试样本中的抗体水平较低，类似于对照样本中的抗体，表示个体不可能发展为对比-增强Tl MRI病变，并将有一个缓慢的MS病程进展。因此，本发明提供了确定患有RRMS个体会发展为突破MS的方法。首先，由个体提供一个测试样本。合适的测试样本包括一种生物流体，选自全血，血清和血浆组成的组合。 对测试样本中的抗-Glc(a 1，2)(^1(β)抗体(GAAB)进行检测/测量。优选地，该抗体是 IgM抗体。测试样本的抗体水平与抗体的参考水平相比，其中，当测试样品的抗体水平高于抗体的参考水平时则与突破MS相关。当测试样品的抗体水平高于抗体的参考水平，表明预后的个体将发展为对比-增强Tl MRI-检出病变或突破MS，在将来的某一时间，即，在抗体检测之后。例如，个体被认定诊断为MS的可能性极高，有MRI-检出病变为证明，甚至进行 MRI分析之前。可选地，血液样本的抗体水平与参考样本的抗体水平相比较，不会进展为突破MS 的个体是通过检测到个体样本的抗体水平相同/类似或更低于对照样本的抗体水平予以区别。本发明还提供确定患有RRMS个体可能会经历快速进展的MS疾病活动的方法。首先，由RRMS个体提供一个测试样本。合适的测试样本包括一种生物流体，选自全血，血清和血浆组成的组合。对测试样本中的抗-Glc(a 1，2)(^1(β)抗体(GAAB)进行检测/测量。 优选地，抗体为IgM型抗体。测试样本的抗体水平与对照样本的抗体水平相比，其中，当测试样品的抗体水平高于对照样本的抗体水平时，表明个体有活跃的MS病程进展的风险。可选地，测试样本中低的抗体水平，与对照样本中的抗体水平等同或者相似，表明在同一时间段内个体可能为缓慢MS病程进展。与积极MS病程进展的预测有关的对照是一个参考数值，其取自一个或者多个CNS中有MRI-检出病变MS的患者。本发明还提供了一种计算机可读介质，里面包含有执行该方法的计算机可执行指令。首先，存储至少一个与患者的血液样本中至少一种抗体水平(例如，Glc(al，2) foil (β)抗体(GAAB))相关的第一变量。可选地，抗体水平检测通过绑定于腔室或孔中固定聚糖来进行，并发出荧光信号；化学发光信号或者光密度信号，通过添加预先标记的与IgM 同型有相同识别方式的第二个抗体。第二，存储至少一个与至少一种参考水平相关的第二变量。患者相关临床问题的危险因素i)RRMS患者是否将发展成表现为TlMRI增强病变的积极病程；ii)RRMS患者是否将发展为突破MS ；或iii)RRMS患者是否可能经历到快速进展的MS疾病活动，用至少包括第一和第二变量的函数计算。最后，输出风险因子。可选地，至少一个的第一变量对应于样本中抗_Glc( α 1，2) fell (β)抗体。“参考水平”意味着一组确定的MS患者各种抗体的平均数，中位数，一定的上限或下限百分比，范围水平。例如，队列是由在CNS中没有任何对比-增强TlMRI病变的RRMS患者组成。示范的抗体参考水平为平均值+0.5，1，1.5，或为平均值2个标准差(SD)，或者为平均值-0. 5，1，1. 5，或为平均值2个SD。优选地，参考水平为平均抗体水平+或者-1. 5SD。 个体的人数至少为5 ；至少为10，至少为25 ；至少为50 ；至少为100或更多的个人。参考水平通过测量已知MS进展属性的患者样本的抗体水平(例如，抗-GlC(al，2)(ial(i3)抗体 (GAAB))获得，例如，归档的血液，血清或血浆样品。在实践中，通过测试统计相关的队列中患者(例如，50例患者，100例患者，等等) 确定每种抗体参考血清样本类似的截止水平。即，高于25% ；高于20% ；高于15% ；高于 10%;或低于25%;低于20%;低于15%;低于10%。较高百分比的抗体水平表明有快速复发或病程快速进展的危险，而较低百分比的抗体水平则表明病程进展和复发的风险低。将参考血清样本制成等分试样，冷冻保存供日后使用。参考血清样本为校准样本，有一个预设的抗体水平(截止水平，参考水平)。当分析测试样本的抗体水平时，测试样本和参考/校准/对照样本进行平行测试，如果测试样本中的抗体水平高于参考/校准样品的抗体水平， 试验样品被认为是“阳性的”，例如，其属于抗体水平升高CIS患者亚组。类似地，如果在测试样品的抗体水平等于/相近或低于参考/校准样品的抗体水平，测试样品被认为是“阴性的”，例如，它属于抗体水平不升高的CIS患者亚组。测量抗-Glc ( α 1，2) fell ( β )抗体(GAAB)的水平来确定MS的疾病活动有众多的优势。首先，虽然MRI扫描通常不痛苦，患者常常发现经历MRI扫描，会令人陌生和焦虑，包括静脉注射对比-增强剂。使用本文所述的方法，患者只需要提供血液样本，而不是将他们自身进行MRI扫描。此外，测量RRMS患者血液中的抗-Glc( α 1, fed (β)抗体(GAAB)水平能为主治医生提供宝贵的信息，以设计最有效的治疗方案。抗-Glc(a 1，2)(^1(β)抗体水平也可作为一种说服RRMS患者工具，让他们配合他们的医生制定的治疗方案。本发明的其他特征和优势，通过以下优选实施例以及权利要求的描述而显而易见。除另有定义者，本文所有的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同定义。虽然可以在本发明实践或测试中使用类似或等同于此处描述的方法和材料，合适的方法和原料如下文所述。此处提及的所有出版物，专利申请，专利，Genbank中 /NCBI的登入号码，以参考文献形式全部纳入。在冲突的情况下，以包括定义的本申请说明书为准。此外，原料、方法和实施例仅用于描述，并无限制目的。
图1显示了聚糖阵列格式A)载玻片用聚四氟乙烯掩模制造出7个集群微孔，每个集群有32个微孔；B)附加在载玻片上的硅粘合剂的超结构将每一载玻片分成多个血清样本手工应用孔；和C)抗原和对照层涂在每个垫片孔中。图2显示了临床确诊的MS(CDMS)的时间，Kaplan-Meier法，组-C的生存曲线。FP 患者阳性彡1 (抗-GAGA4，抗-GAGA2，抗-GAGA3，或者抗-GAGA6 IgM)与对所有标记都呈阴性的患者相对。截止值4. 0，4. 5，4. 5和4. 3分别对应于抗-GAGA2，抗-GAGA3，抗-GAGA4， 和抗-GAGA6IgM。经log rank检验确定P值。经由Bonferroni校正仅当P值低于0. 0125 时才被认为是显著的。图3显示了确诊的EDSS进展的时间，Kaplan-Meier法，生存曲线。CIS患者阳性彡1 (抗-GAGA4，抗-GAGA2，抗-GAGA3，或者抗-GAGA6 IgM)，与对所有标记都呈阴性的患者相对。截止值148. 8，164. 6，133. 6，和168. IEU分别对应于抗-GAGA2，抗-GAGA3， 抗-GAGA4，和抗-GAGA6IgM。经 log rank 检验确定 P = O. 011664。图4显示了确定CIS患者是否有在24个月内复发的危险的过程的方块流程图。图5显示了确定患者是否在20年中有可能在扩展残疾状态量表(EDSQ评分有进展的过程的方块流程图。图6显示了确定患者是否有可能发展为突破MS的过程的方块流程图。图7显示有/无对比-增强MRI病变的患者的抗-Glc ( α 1, 2)Gal ( β ) IgM抗体 (GAAB)的水平的箱形图。并显示了中间值，25%/75%四分位数和异常值。空方格是异常值，其定义为大于上四分位数加四分位数间距的1. 5倍的值。阴影方格是定义为远远大于上四分位值超过3倍的四分位数间距的值。患者抗GAAB无对比增强磁共振成像对比增强 MRI病变患者的病变和水平有显著差异(P = 0. 04，t检验)。图8显示不同的抗Glc ( α 1，2) fell ( β ) IgM抗体(GAAB)的截止值(EU/mg/mL)接受者操作特征(ROC)曲线，分为有对比-增强病变的RRMS病人(n = 51)和没有对比-增强病变的RRMS病人(n = 97)。在曲线以下的区域(AUC)为0. 603 (p = 0. 02)。ROC曲线分析使得最佳的截止点得以确定，在没有对比-增强病变的病人组的最高的20%处。箭头表示在选定截止值时的灵敏度和特异性。图9显示了确定患者是否有可能发展为由对比-增强Tl MRI病变导致的活跃病程进展的过程的方块流程图。图10显示了确定患者是否有可能发展为突破MS的过程的方块流程图。详细说明多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)的一种脱髓鞘的炎性疾�。形慈范ㄆ淙非胁∫蚝头⒉』�。MS的诊断需要排除那些可以更好地解释临床，影像学以及临床奇特的结果的其他疾病。MS诊断标准，又称修订的McDonald标准，其定义了患有MS的个体所需要的参数(Polman et al. ,2005 Ann Neurol，58 :840-6)。为了更好地界定可能符合/不符合McDonald标准的可疑MS病例，MS专家国际小组最近编制了鉴别诊断导致MS的一致决定的指南(Miller et al. ,2008 Multiple Sclerosis, 14 :1157-1174)。多发性硬化症(MQ的病程按照不可预知的进展模式以及广泛的变量时间表，其残疾的积累没什么特别的标记，使得很难或无法准确地确定个体病人的预后(Vollmer Τ, 2007 J Neurol Sci，256 Suppl 1 :S5_13)。异质性可能与临床孤立综合症(CIS)患者将有下一次复发或对改变疾病病程疗法(DMT)有反应的时间表有关联。异质性也可以指病程进展速度和残疾的积累。异质性也可以指在中枢神经系统(CNQ中有表现或没表现的对比-增强TlMRI病变。在许多情况下，MS患者虽经治疗，但预后差。特别地，“突破疾病” 一词是用来表示尽管采取了 DMT治疗，疾病活动或进展的临床或磁共振成像(MRI)的证据(如可扩展残疾状态量表(EDSS评分)来衡量)((Rudick and Polman 2009，Lancet Neurology, 8 :545-559)。突破病并不意味着病人治疗没有响应，它只意味着尽管采取治疗， 疾病仍旧活跃。本发明描述的方法涉及预测一个患有可发展为MS的临床孤立综合症(CIS)个体的病程。该方法包括定性个体为两组成员之一 (i)那些有可能迅速进展到临床确诊的多发性硬化症(CDMQ，即在M个月内，及(ii)那些有可能较为缓慢进展到CDMS，即超过M 个月。该方法还涉及到定性个体为另外两个小组之一的成员(i)那些有可能在临床残疾方面进展迅速，即在5年之内，及(ii)那些有可能在临床残疾进展缓慢，即大于5年。RRMS最早的临床表现是CIS。目前的临床实践是以一线DMT治疗将发展为MS的 CIS的患者以及新确诊患者。医师指出尽早开始治疗的好处，但不是所有的患者都会同意。 最近一项在美国神经学家中进行的调查显示，至少有10%新确诊的多发性硬化症患者会延迟他们的治疗，因为他们害怕注射(Perrin et al. ,2009 JMCP，15(7) :572)。因此，基于在 24个月内从CIS发展为CDMS的风险将CIS患者分组，可以作为说服患者接受DMT早期治疗的一个重要工具，因为组(i)的患者将同意接受DMT，而组(ii)中的患者可延迟治疗至下一个的临床或影像发病期。目前的临床实践的另一个方面是在首次DMT失败后，采用另一现有DMT。采用的可以是另一种一线DMT或更具侵入性的二线(第二代)DMT。因此，按照例如在5年中用EDSS 测量的评分，来预测MS病情进展迅速以及更多的残疾的风险，基于此将CIS患者分组。这是确定治疗方案的一个关键因素，因为组(i)中的患者将接受侵入性DMT方案，而组(ii) 中的患者接受较少侵入性的DMT或其他一线DMT。在有症状的发作中，静脉注射高剂量的皮质类固醇激素，如甲泼尼龙，是常规治疗急性复发的方法。这种治疗的目的是尽早结束发作，并给病人留下较少的长期性障碍。虽然一般来说在短期内能有效缓解症状，但皮质类固醇激素治疗不会对长期的康复有重大影响((Brusaferri and Candelise, 2000 J. Neurol. ,247(6) :435-42)。潜在的副作用，包括骨质疏松症和记忆力下降，后者是可逆的(Dovio et al. ,2004 Clin. Endocrinol. Metab.， 89(10) :4923-8 ；Uttner et al. ,2005 Neurology,64(11) :1971-3) 对皮质类固醇激素不响应的严重的发病可由血浆置换术治疗。复发型多发性硬化症(RRMQ最早的临床表现是临床孤立综合症(CIS)。一些研究表明，在最初发作时使用干扰素治疗可以减少病人发展为临床多发性硬化症的机会(Jacobs et al. ,2000 N Engl J Med, 343 (13) :898-904; Comi et al. ,2001 Lancet,357(9268) :1576-82 ；Kappos et al. ,2007 Lancet,370(9585) 389-97)。这些和其他CIS的研究表明早进行DMT治疗的好处，与之相关的目前临床实践有新确诊的RRMS患者和可发展为MS的CIS患者，在有首发表现和MRI扫描异常之后马上采用 DMT。不同国家监管的机构已经批准了 6种改变RRMS疾病病程疗法(Rudick and Polman 2009，Lancet Neurol，8 :545-559)。其中三种是干扰素两种配方为干扰素 beta-la(商标名称为 Avonex ，CinnoVex ，ReciGen 和 Rebif · )以及一种为干扰素 beta-lb (美国商标名称Betaseron ，在欧洲和日本为Betaferon )。第四种药物为醋酸格拉替美(Copaxone )。第五种药物为米托蒽醌，是一种免疫抑制剂，还可用于癌症化疗， 只在美国得到批准，主要用于治疗继发进展型MS。第六种药物为那他珠单抗(以Tysabri 销售)。所有六种药物都有一定的效果，可减少发病的次数和减缓残疾的进展，虽然其疗效不同，但仍旧缺乏对它们长期影响的研究(Ruggieri et al. ,2007 CNS Drug Rev, 13 (2) 178-91 ；Munari et al. , Cochrane Database of Systematic Reviews 2003, Issue4. Art. No. :CD004678 ；Rice et al. ,2001 Cochrane Database Syst Rev(4) :CD002002 ; Martinelli Boneschi et al. ,2005 Cochrane Database Syst Rev (4) :CD002127) 。
调节剂之间的比较(除米托蒽醌之外)表明，最有效的是那他珠单抗，无论是在减少复发率和制止病情恶化(Johnson KP, 2007 J. Neurol. Sci. ,256 Suppl 1 :S23_8)；也被证明可以减少MS的严重性。米托蒽醌可能是其中最有效的(Gonsette RE, 2007 Expert opinion on pharmacotherapy, 8 (8) :1103-16)，但是，由于严重的心脏中毒故需限制其使用，一般认为它不适合长期的治疗，(Murray TJ, 2006 Expert opinion on drug safety, 5 (2) :265-74)。 频繁注射以给予干扰素和醋酸格拉替美，从每一天一次的醋酸格拉替美到每星期一次(但是肌内注射)的Avonex⑧。每一个月以静脉输液给予那他珠单抗和米托蒽醌。这些DMTs也被称为1线的DMT。最近，一个“真”二代DMT成功完成了 III期的临床试验。使用Fingo 1 imod(FTY720)
1和Mylinax (Cladrabine)的III期临床试验中的治疗组与一线DMT的研究相比有较高的疗效。第二代的改变疾病病程疗法(DMT)目前正推向MS市�。蝗欢诘谌锥蔚牧俅惭芯勘ǜ媪瞬焕囊幻妫缫蝠逭罡腥竞推し舭┮鹚劳�。由于第二代DMTs严重的副作用，它们不会被用于所有患者。此外，其他四种比一线DMTs更积极有效药剂，但有不良副作用，目前正处于III期临床试验中。MS患者残疾进展的异质性是通过观察在不同的时间间内隔RRMS发病人群的扩展残疾状态量表(EDSQ。在疾病发病5年后，10-15%的RRMS患者的扩展残疾状态评分 (EDSS)达到3.0(对应的是完全非卧床，但有中度残疾的病人)，8-12年后，27% -30%的 RRMS患者EDSS评分达3，在20年后，39 %的RRMS患者EDSS评分达3，而39 %的RRMS患者达到至少6EDSS评分(对应的是病人走路需要拐杖的辅助；Simone IL et al. ,2002 Neurology,24 ；59 (12) :1922-8 ；Pittock SJ et al.,2004 Ann Neurol，56 :303-306 ； TintoreM et al.，2006 Neurology, 67 :968-972)。最近，临床孤立综合症(CIQ被“重新定义”为一种怀疑潜在的炎性脱髓鞘疾病的单相表现(Miller DH et al.，2008Multiple Sclerosis, 14 :1157-1174)。“单相表现，，， 意味着首发表现为单一的临床发作，发病较快。同期可能有多种临床/临床奇异表现(代表在空间的扩散)，虽然在时间上扩散不应该是显而易见的。四个CIS的等级的定义基于单相临床表现是否有单或多病灶的临床或MRI特征(Miller DH et al. ,2008 Multiple Sclerosis, 14 :1157-1174).最后，应该有合理理由怀疑炎性脱髓鞘性疾病为其基本病理。在可进展为多发性硬化症的CIS患者中，EDSS进展如下所示。百分之二十五 (25 % )的CIS患者在20年后达到至少6. 0的EDSS评分。大约45 % CIS患者在相同的20年期间达到3. 0的EDSS评分，而余下的30% CIS患者在20年后的EDSS评分低于3. 0 (Fisniku LK et al. ,2008 Brain，131 :808-817)。因此，某些确定亚群的RRMS发病患者有更严重的/ 活跃的疾�。庑┗颊叻⒄刮叩纳瞬械燃兜母怕式细撸囱杆倩颉翱焖佟盡S患者。某些临床(例如，性别为男性，发病年龄较晚，和多症状发病)和临床奇异因素(如，数量，体积和磁共振成像(MRI)病变部位，脑脊液(CSF)中存在寡克隆区带(OB))都表现出了适度的预测能力，预测哪些患者的残疾会更迅速地进展(TintoreM et al. ,2006 Neurology,67 968-972 ；and Bergamaschi R 2007 Int Rev Neurobiol，79 :423_447) 。 M胃，予页
量有其局限性，似乎只能帮助EDSS评分为4以下的残疾预测(Confavreux C et al.，2003 Brain, 126 :770-782)。由于目前所有的改变疾病病程疗法(DMT)，只能用于EDSS评分低于 6. 5的患者，而第二代介入DMT有不良副作用或最近才完成III期研究，需要一组预后工具以提高临床医生预测CIS患者什么时候将复发或者CIS患者是否会迅速进展的能力。这样的预后工具将帮助给予患者适当的建议，确定需要给予更加侵入性的DMT患者，并改善治疗试验的设计和分析(Miller DH, 2004 NeuroRx, 1 :284-294 ；Bergamaschi R2007 Int Rev Neurobiol，79 :423-447)。在本发明之前，没有任何已知的抗原特异性介绍存在，以辅助确定疾病活动(下一次复发)，疾病的严重程度(突破疾病)，或病程进展的速度(EDSS进展)。如本文所述的测试，提供有关下一次复发或MS可能进展的速度有多快的信息，通知医师以定制适当的干预治疗。例如，基于在FP治疗后缺少异常的MRI扫描，一个患者可被错误地认为在M个月内不可能发展为临床确诊的MS(CDMS)，而如果使用本发明的方法则表明，患者很可能在M个月内复发或病情进展。如果本发明的方法预测CIS患者在M个月内下一次复发的可能性极高，将要经历CDMS神经性发作和有异常的MRI，但拒绝DMT的患者可被说服遵守治疗。所述测试的临床功效与其目前在临床实践中的使用的其他的例子，与这些四聚糖能预测快速MS进展和突破疾病能力有关。在CIS病例中，约25%在20年内会进展到EDSS 评分6. 0。其余的75%将进展到EDSS评分3. 0(45% )，或将低于EDSS评分3. 0 (Fisniku LK et al. ,2008 Brain, 131 :808-817)。目前的一线DMT (处方给CIS)将推迟下次复发平均 2 年(Kappos L, et al.，2007Lancet，370 (9585) :389-97)。一个 MS 专家不知道新诊断的MS患者或CIS患者是否为快速或缓慢进展者，对于DMT响应好或者响应差，或是否有突破疾病的可能性。因此，新诊断的MRI异常的MS患者或CIS患者大部分给予一线DMT。在 731天，一个出现额外的临床事件的患者仍然没有关于病程足够的数据。这样的患者可能是一个对DMT响应良好的MS快速进展患者。可选地，同一患者可能是一个缓慢进展患者， 对DMT响应不良。目前的做法是“等待及观望”。随着时间的流逝和更多的MRI病变数据， 以及EDSS进展积累使得决定成为可能。如果必要的话，四聚糖可在CIS期预测哪些患者进展残疾的可能性极高，可做出改变治疗方案为更具侵入性的治疗的决定。对于“活跃”的患者，可以转为新的第二代DMT，其更具侵入性并有不良的副作用。相比之下，对于“消极”的患者，可提供较少的侵入性治疗，例如，一线DMT。目前，在美国仅批准了自我注射和输液疗法来治疗复发的MS。口服疗法如 Fingolimod和Mylinax正处于开发中，很快将扩大治疗方案的选择。最近，为了从医生的角度研究CIS患者在MS治疗上的未满足的需求，在美国对一个神经学家的样本中进行了一次深入的电话调查。这项调查在2008年11月至2009年2月进行。这项调查，由国家多发性硬化症协会(匪SS)和EMD krono公司之间联合协作，由GFK Roper完成。在参与本次调查的神经学家中(N = 250)，大部分都是私人执业(77% )有彡16年治疗MS的经验(57% )。 几乎所有的医生(98%)表示，他们总是向他们的病人解释尽早开始药物治疗的好处。医生表示，平均地，他们在过去12个月新确诊的MS患者，至少有10%推迟了至少6个月的治疗。医生认为，注射恐惧(68%)，担心可能出现的副作用(66%)，否认患有MS(61%)是推迟治疗最常见的理由。当在描述MS治疗上所需的改善时，70%的特别提到口服，接下来是更好的平衡疗效和安全性(49% )和减少副作用(47% )。在认识到的好处的整体排名中， 医生认为，口服疗法，将有助于提高病人的依从性(53%提到)，提高生活质量(49%提到)， 并使其更容易为患者治疗(47%提到)。当被特别问及关于坚持治疗时，几乎所有的医生 (97%)同意，口服治疗，如获批准，将改善病人坚持服用所开MS药物的能力。医师指出了及早开始治疗的好处，但不是所有患者都会遵守。可获得口服治疗是在MS治疗中最想要的改善(Perrin et al.，2009 JMCP, 15(7) :572)。因此，四聚糖面板和测定血液中四聚糖抗体的浓度的试验提供了宝贵的信息，主治医生根据这些信息来设计最有效的治疗方案，以及提供一个工具来说服可进展为MS的 CIS患者依从他们的医生规定的治疗。一直以来，人们都在搜索有用的在血清中产生的生物标志物，包括抗体。在复发性多发性硬化症(RRMS)患者中，血清IgM抗体的N-糖肽特别地增加(Lolli F，et al. 2005 Proc Natl Acad Sci USA, 102 :10273-78 ；Lolli F, et al. 2005 J Neuroimmunol, 167 131-37)。对两个髓鞘肽的高抗体滴度，髓鞘的少突胶质细胞糖蛋白(MOG)和髓鞘碱性蛋白
16(MBP)被一些(Berger T, et al. 2003N Engl J Med, 349 139-45)，但不是所有(Kuhle J, et al. 2007 N Engl J Med，356 :371-78)报告用于预测CIS患者的早期复发。IgG抗体的生成，特别是在脑脊液(CSF)中生成，但并不在相应的血清(即寡克隆区带)中生成，一直是诊断和鉴别诊断MS有用的测试((Freedman MS, et al. 2005 Arch Neurol，62 :865-70)。此外，最近的研究结果表明RRMS患者与其他神经系统疾病(OND)患者相比，IgM 抗体对 Glc(a l，4)Glc(a ) (GAGA4)的水平升高(Schwarz M, et al. 2006 J Neurol Sci, 244 :59-68)。本发明呈现的结果确定何时病程(从CIS开始)升高抗体水平至GAGA2，GAGA3，GAGA4 or GAGA6，预测与疾病活动关联的各种临床发作(下次复发)，疾病的严重程度(突破)，或在某一时段内其病情进展。在本发明之前，没有已知的诊断或预后复发型多发性硬化症(RRMS)的基于生物标志物的特定血清面板。如下所述，队列-C (FP (n= 100)) IgM抗体在葡萄糖聚糖面板上通过萤光免疫检验法测定。在队列C中，58例患者经历了早期复发(<Μ个月)；31例患者经历晚期复发(彡M个月)和11例患者没有经历后续的第二次发作。Kaplan-Meier曲线显示抗体面板呈阳性的患者到下次复发时间的减少(P = 0. 02，log rank)。MS病变的磁共振成像磁共振成像(MRI)是在诊断和监测MS疾病活动主要工具，这项技术能将大脑脱髓鞘区域可视化。MRI，又称核磁共振成像(NMRI)，主要是用来显示人体详细的内部结构和功能限制的医疗成像技术。相比于计算机断层扫描(CT)，MRI为不同的身体软组织之间提供了更大的对比度，在神经系统(脑)成像上尤其有用。不同于CT，MRI不使用电离辐射，但使用一个强大的磁场使身体里水中的氢原子的核磁化。当身体暴露在强磁场中时，氢原子的原子核定向排列，从而成为微小的指南针。射频(RF)场用于系统地改变这种磁化的排列方式， 引起氢原子核的能量的变化。无线电波脉冲停止后，当原子核恢复到先前的状态时会发出共振波，从而在原子核的振荡上产生小的差异，这可由一台电脑扫描仪检测出来。现在使用的多种MRI (最常见的是Tl增强扫描和T2增强扫描)以不同的方式测量此弛豫时间。计算机的处理可生成一个三维图像，反映成像组织的化学结构，包括其中水的含量和水分子运动的差异。由于水(由氢原子和氧原子组成)构成人体体重的三分之二，这个信号可以被附加的磁场操纵构造整个身体的图象，包括人类的大脑。MRI扫描对诊断和监测的MS特别有用，因为这些扫描使大脑脱髓鞘区可视化。髓磷脂是一种在神经细胞轴突周围形成脂肪层(髓鞘)的电介质材料(绝缘)。神经细胞通过这些长的由髓鞘绝缘的神经轴突传导电信号(动作电位)来进行联络。患有MS，人体自身的免疫系统攻击和破坏髓鞘。“脱髓鞘”是指神经轴突周围的保护髓鞘的损失，这会导致神经信号中断，从而造成许多与MS相关的症状。由于，保护神经纤维的髓鞘层由脂肪组成， 完整的髓鞘通常排斥水。然而，在神经纤维脱髓鞘的区域，由于缺乏保护的脂肪层而允许积水。因此，正如上文所述，MRI扫描检测脱髓鞘区域的水，而且这些区域无论呈现为明亮的白色斑点或黑暗的区域，主要取决于所使用的扫描类型。在大脑或脊柱已脱髓鞘的区域被称为“病灶”或“斑”。事实上，短语“多发性硬化症”，是指在大脑和脊髓白质上疤痕(硬化， 即斑块或病变)。如上所述，常见的用于MS的MRI扫描包括Tl增强扫描和T2增强扫描。在大脑中，Tl增强扫描提供了良好的灰质/白质对比。Tl增强MRI扫描显示的“黑洞”为MRI图像上的暗区。这些所谓的低信号的病灶是永久性轴突损伤的区域。Tl增强病灶也可是水肿区 (肿胀)，其不是永久性的，在随后的扫描中也不可见。Tl增强扫描是常规磁共振成像技术的一部分，用于监测和诊断MS，通常与T2增强扫描结合使用。T2增强MRI扫描显示病灶的总数(损伤负载)和疾病负担。这些都是高信号的病灶，意味着它们作为MRI图像上的亮点出现。T2增强扫描是常规磁共振成像技术的一部分，它用于监测和诊断MS，通常与Tl增强扫描结合使用。有时不可能只通过调整成像参数产生足够的图像对比度，以充分显示感兴趣的解剖构造或者病理，在这种情况下需使用对比增强剂。用于检测MRI病灶的MRI造影剂由于其特殊的磁学性质而被选定。最常用的静脉注射造影剂是基于钆的螯合物。当怀疑是MS时， 顺磁性对比剂，钆，往往被使用以提高医生阅读和解释的Tl MRI扫描的能力。造影剂如钆被静脉注射，以增强血管，肿瘤或炎症的外观。钆-增强的组织和流体在Tl增强影像上显得极为明亮。要确定哪些病变在使用造影剂后增强，在使用造影剂之前和之后(例如，钆) 均执行Tl的扫描。造影剂的使用为检测血管组织提供了高灵敏度，并使其对脑组织的评估成为可能。钆-增强的Tl增强MRI扫描通过突出对应于炎症区的血-脑屏障损坏的区域来提供疾病活动的信息。钆(Gd)是一种稀有的镧系元素，具有很强的顺磁性。使用钆显著降低了相邻活动的水质子的Tl弛豫时间。因此，在使用钆(IV)后，在Tl增强像中有一个来自CNS组织的本地增强信号，通常情况下，没有血-脑障碍，例如，室周器官，脑膜，脉络丛，或屏障异常损坏，甚至缺失，这在许多类型的病灶中都会出现。这是活跃的MS病灶的病例，其增强与由急性血管周围炎症而改变血脑屏障通透性有关。钆与炎症区域反应，当病灶处于活动状态将 “亮起来”，表明脱髓鞘是活动的存在。因此，钆增强病变是相对较新的，例如，在病灶发展后六个星期或更少。在这种方式下，在MRI扫描前使用钆使得医生确定哪些病灶是活动的哪些病灶是不活动的。如上所述，通过钆增强MRI扫描的鉴定活动性病灶也表明血脑屏障有破裂。使用钆后可见的病灶为对比-增强Tl MRI成像病灶。在MS领域，在每月的MRI扫描上看到新的对比-增强病灶的数量是MRI监测的试验性治疗研究中使用最广泛的响应变量(Sormani et al.，1999 J Neurological Sci, 163(1) :74-80) 0使用此信息来评估疾病的活动，并确定是否发生复发。例如，在使用干扰素beta治疗期间存在钆-增强病灶表明，未来将有临床和MRI疾病恶化(Rudick，et al.2004 Ann Neurol, 56 :548-55 ；Rio，et al. 2008 Mult Scler, 14 :479-84 ；and Durelli, et al. 2008 J Neurol Neurosurg Psychiatry, 79 :646-51.)。抗-Glc(al，2)Gal(g)抗体(GAAB)水平的预后值如下文所述，比抗体参考水平更高水平的抗-Glc ( α 1，2) fell ( β )抗体(GAAB)能确定复发-缓解型MS (RRMS)患者将发展为由对比-增强Tl MRI病灶表现的活动性的病程。 此夕卜，比抗体参考水平更高水平的抗-Glc ( α 1，2)feil ( β )抗体(GAAB)能确定哪些RRMS患者将发展为突破MS,即尽管采取治疗，MS疾病仍旧活动。本发明描述了有关预测RRMS患者将发展为由对比-增强TlMRI病灶表现的活动性病程的方法。该方法包括定性个体为两组成员之一 (i)那些有快速病程进展的风险，导致使用磁共振成像(MRI)能观察到的在CNS中的高水平炎性病变，或者积累的临床残疾，因此可能需要侵入性的改变疾病病程(DMT)疗法；和ii)患者诊断为RRMS患者，将有一个正常或相对缓慢MS病程进展，较少MRI活性和较少的累积残疾，从而需要更少的侵入性治疗。在疾病的早期阶段，可基于MS疾病快速进展以及炎症性病灶的风险将患者分开， 这可以作为说服患者接受DMT早期治疗的一个重要工具。因为组(i)的患者将同意接受 DMT，而组(ii)中的患者可延迟治疗至下一个的临床或影像发病期。此外，基于预测MS的病情迅速进展以及有炎症性病灶的风险将RRMS患者分开(例如，对比强Tl MRI病灶反映在CNS中有活动的炎症)是在确定治疗方案时一个关键因素，因为组(i)中的患者将接受侵入性DMT方案，而组(ii)中的患者接受较少侵入性的DMT或其他一线DMT。在本发明之前，没有任何已知的抗原特异性的介绍存在，以帮助确定疾病活动 (存在活跃的MRI病灶)，或者疾病的严重程度(突破病)。如本文所述的一项测试，提供了有关活跃的MRI病灶的存在或MS可能进展的速度有多快的信息，通知医师以定制适当的干预治疗。更具体地说，在本发明之前，没有已知的具体的以血清为基础的生物标志物能反映MS疾病活动，其活动由CNS中对比-增强Tl MRI病灶来表现。如下所述，在由RRMS患者(N= 148)组成的队列中通过酶免疫法测定抗体水平(例如，抗-Glc(a 1，2)(^1(β)抗体(GAAB))。所有患者均接受MRI扫描，发现51例有对比-增强Tl MRI病灶，97例没有对比-增强TlMRI病灶。对比-增强Tl MRI病灶患者的抗-Glc ( α 1, 2)Gal ( β )Gal ( β ) IgM 抗体(GAAB)水平显著高于无对比-增强Tl MRI病灶的患者。基于接收器工作特性(ROC) 的分析，对截止水平和参考水平进行了界定。基于多方差的数理回归模型，抗-GAAB IgM水平高于截止水平，发现MRI活动的独立预测因素(P = 0. 003，0R3. 07，CI951. 44-6. 55)。^MM 1 : ^ IrM抗体的抗-α _测丨多发+牛硬化欠发作后白勺复发活动血清样本此处介绍的结果是来自于一个追溯既往的研究，该研究收集后诊断为RRMS的患者在断为FP期时，冷冻(_70°C )再解冻的血清标本。对照组包括其他神经系统疾病(OND) 患者的血清样本，该样本为同一时段的常规样本并被送到脑脊液(CSF)诊断实验室储存。 从医院的记录中获得人口统计学和临床数据。MS样本的入选标准如下患者年龄在采样区间(18-60岁)，后续血液抽样至少4年，根据Poser标准诊断为RRMS患者(Poser CM, et al. 1983 Ann Neurol，13 :227-31)。符合上述标准的样品在两个血清库之一鉴定，位于加拿大渥太华的渥太华医院总校区或者位于比利时布鲁塞尔的Cliniques Universitaires Saint-Luc0复发定义为任何新的神经系统事件，伴有症状或体征，或者早期症状的显著恶化，或者在没有发烧的情况下持续了至少48小时的体征。所有样品均在所属机构编码，然后被送往Glycominds Ltd.实验室进行抗体分析。完成所有的分析进行解码。对三个不同的队列进行了分析队列-A包括88个样本(44FP η = 44，OND η = 44)，根据MS患者的年龄和性别匹配OND患者；队列-B的包括252个样本(FP η = 167，OND η = 85)；队列-C包括100FP患者。所有样品检测采用盲法。总IgM的测量总IgM水平的测定采用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Bethyl laboratories, Montgomery, TX, USA)根据制造商的说明，以mg/mL为单位报告。使用聚糖阵列的抗-GAGA2，抗-GAGA3，抗-GAGA4，与抗-GAGA61gM免疫荧光阵列
采用免疫荧光法(IFA)测定队列C样本中抗-GAGA2，抗-GAGA3，抗-GAGA4，与抗-GAGA6 IgM的水平，载玻片用聚四氟乙烯掩模制造出7集群微孔，每个集群有32个微孔 (图1A)。一种硅粘合剂超结构(图1B)附在载玻片上。这种硅填料将每一载玻片分成多个孔以供血清样本的手工应用。每个孔内放置聚糖抗原与内部控制(图1C)。如上所述，ρ-硝基苯基衍生物的 GAGA2，GAGA3, GAGA4，与 GAGA6 (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada)通过一个链接以共价键结合到载玻片上(Schwarz M，et al. 2006 J Neurol Sci， 244 59-68)。检测程序载玻片上的孔在封闭液中G00L/孔)室温培养60分钟。清除封闭液后，300L/ 孔的病人的血清在的牛血清白蛋白(BSA)在20mM的Tris-HCl pH值7. 2,0. 9% NaCl， 稀释到1 40，加入0. 05% Tween-2水溶液到每个孔中。每片载玻片中包含5个血清样本和一个任意单位的对照样本。每个样本在不同的载玻片上测试5次。样本培养45分钟。 移除血清，将载玻片在HS4800系统中进行进一步的清洗和处理。简言之，载玻片在混合系统中使用 TNTT 缓冲液清洗(20mM Tris-HCl pH 7·2，2Μ NaCl,0. 05% Tween-20,0. 05% Triton X-100)。生物素化羊抗人IgM(l 500)和Alexa-633标记的链霉亲和素(1 150 ； Molecular Probes, OR, USA)依次培养lh，其间进行清洗，混合系统在32°C光保护温度控制的环境下。在清洗和烘干后，利用激光扫描仪对载玻片进行扫描(GenePix 4000B,Molecular Device, Baltimore, MD, USA)；载玻片图像分析采用Optiquant ”软件和RFU代表的抗-聚糖IgM对每种抗原的相对结合和对照微孔进行了计算。每个孔的数据质量进行了验证，通过确保人IgM的信号水平，和抗-人IgM的点在截止水平以上。如果孔不符合标准，样本再次进行测试。计算每个样品抗-GAGA2，抗-GAGA3，抗-GAGA4，和抗_GAGA6IgM的抗体水平， 将样本RFU除以参考样本RFU。抗-α-葡萄糖水平的变异系数(CV)对于内部载玻片孔为 8-12%，对于混合站不同的运行周期(载玻片间)为15-22%。如果至少四种抗体中的一种高于截止水平，样品被视为阳性。每种抗原的截止值分别为FP人群的平均值加1，1. 5，或2 个SD，最佳合适的截止值(4. 0,4. 5，4. 5和4. 3分别对应于抗-GAGA2，抗-GAGA3，抗-GAGA4， 和抗-GAGA6IgM)。统计方法采用学生t检验或采用曼-惠特尼U检验对数值变量在组间进行比较，依赖于其是否遵循正态分布，以及如果任何细胞的预期数小于5，2检验比较各组之间的速度或 Fisher精确测试。数值变量之间进行Pearson相关分析。P值小于0. 05被认为有统计学意义。结果的不确定性由95%可信区间表示。诊断的准确性由敏感性，特异性，阳性预测值 (PPV)和阴性预测值(NPV)算出。为每个组计算发展为临床确诊的MS(CDMS)的累积风险， 根据Kaplan-Meier法，组与组之间的差异使用log-rank检验通过单因素分析评估。为了测试标记抗体区分患者是否为高风险或低风险提前转化为CDMS(队列C)FP 患者的能力，对几个截止值进行了研究。分析中使用了 Bonferroni校正因子。队列-A 确定哪些FP患者在M个月内将有第二次发作队列-A的临床和人口学特征以及抗-GAGA4水平如表1所述。在血液抽取和首次复发的之间的时间中有关数据，来自于41/44FP患者。沈个Q6/41)FP患者(63%)在采血后2年中第一次复发。这些患者的平均年龄与较晚遭受了第二次发作的患者相比，明显比小(平均34岁与42岁，P = 0.001)，然而，在被研究人群中，年龄和抗-GAGA4 IgM水平没有联系。为了检查抗-GAGA4 IgM水平和较早(即，2对4年)的第二次发作的风险之间的关系，对抗-GAGA4 IgM水平为整个FP组的抗体水平中位数以上的患者进行检查。16(16/20) (80% )高于抗体滴度中位数的患者在两年内出现第二临床发作，相比下，这个数据在滴度等于或低于中位数的患者中只有10/21 (47%)(优势率4. 495%置信区间1. 1-17. 7,Fisher 精确检验，P = O. 05)。表1 队列-A的人口统计资料，临床特征和抗_GAGA4IgM水平
权利要求
1.一种确定患有临床孤立综合症(CIS)的个体在二十四个月内会进展到临床确诊的多发性硬化症(CDMQ的方法，该方法包括所述个体提供一测试样本；检测所述测试样本中的抗-Glc(a l，2)Glc(a)抗体，抗-Glc ( α 1，3)Glc ( α )抗体， 抗-Glc(a l，4)Glc(a)抗体，和抗-Glc ( a 1，6) Glc ( a )抗体；以及将所述测试样本的所述抗体的水平与所述抗体的参考水平相比较，其中至少有一种所述抗体的水平与所述抗体的参考水平的抗体相比更高的话表明，所述个体有可能在二十四个月内进展到CDMS。
2.权利要求1所述的方法，其中有一种所述抗体的水平与所述抗体的参考水平的抗体相比更高表明，所述个体在36个月内有遭受第二次神经侵袭的风险。
3.权利要求1所述的方法，其中有一种所述抗体的水平与所述抗体的参考水平的抗体相比更高表明，所述个体在48个月内有第二次遭受神经侵袭的风险。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的测试样本是一种生物流体，为全血，血清，或者血浆。
5.权利要求1所述的方法，其中所述抗体为IgM同型抗体。
6.一种确定患有CIS的个体有可能在20年内遭受严重的MS病程快速进展的方法，该方法包括由处于CIS期的个体提供一测试样本；检测所述测试样本中的抗-Glc(a l，2)Glc(a) (GAGA2)抗体，抗-Glc ( a 1，3) Glc ( a ) (GAGA3)抗体，抗-Glc(a l，4)Glc(a ) (GAGA4)抗体，或抗-Glc ( a 1，6) Glc ( a ) (GAGA6)抗体；将所述测试样本每种抗体的样本水平与所述抗体的参考水平相比较；以及其中至少有一种所述抗体的水平与所述抗体的参考水平的抗体相比更高表明，所述个体在20年内可能在EDSS评分上进展超过1个单位，所述EDSS评分可预测疾病严重程度。
7.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在20年内有可能在EDSS评分上进展至少两个单位。
8.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在20年内有可能在EDSS评分上进展至少三个单位。
9.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在20年内有可能在EDSS评分上进展超过三个单位。
10.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在20 年内有可能在EDSS评分上进展超过六个单位。
11.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在10 年内有可能在EDSS评分上进展超过1个单位。
12.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在7年内有可能在EDSS评分上进展超过1个单位。
13.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在5年内有可能在EDSS评分上进展超过1个单位。
14.权利要求6所述的方法，其中至少有一种所述抗体的水平较高表明所述个体在4年内有可能在EDSS评分上进展超过1个单位。
15.权利要求6所述的方法，其中所述的测试样本是一种生物流体，为全血，血清，或者血浆。
16.权利要求6所述的方法，其中所述抗体为IgM同型抗体。
17.一种确定患有CIS的个体有可能在20年经历严重程度为MS病程缓慢进展的方法， 该方法包括由处于CIS期的个体提供一测试样本；检测所述测试样本中的抗_Glc(a l，2)Glc(a) (GAGA2)抗体，抗-Glc ( a 1，3) Glc ( a ) (GAGA3)抗体，抗-Glc (a l，4)Glc(a) (GAGA4)抗体，和抗 _Glc(a l，6)Glc(a) (GAGA6)抗体；将所述测试样本每种抗体的水平与所述抗体的参考水平相比较；并且其中每种所述抗体的水平相等或者更低表明，所述个体在20年内可能在EDSS评分上缓慢进展，所述EDSS评分可预测疾病严重程度。
18.权利要求17所述的方法，其中每种所述抗体的水平相等或者更低表明所述个体在 5年内可能在EDSS评分上进展不超过1个单位。
19.权利要求17所述的方法，其中所述的测试样本是一种生物流体，为全血，血清，或者血浆。
20.权利要求17所述的方法，其中所述抗体为IgM同型抗体。
21.一种确定将发展为突破MS个体的方法，该方法包括所述个体提供一测试样本；检测所述测试样本中的抗-Glc(a l，2)Glc(a)抗体，抗-Glc ( a 1，3)Glc ( a )抗体， 抗-Glc(a l，4)Glc(a)抗体，和抗-Glc ( a 1，6) Glc ( a )抗体；并且将所述测试样本所述抗体的水平与所述抗体的参考水平相比较，其中至少有一种所述抗体的水平与所述抗体的参考水平的抗体相比更高表明，所述个体有可能发展为突破MS。
22.权利要求21所述的方法，其中至少一种所述抗体的水平更高表明所述个体在5年内可能发展为突破MS。
23.权利要求21所述的方法，其中所述的测试样本是一种生物流体，为全血，血清，或者血浆。
24.权利要求21所述的方法，其中所述抗体为IgM同型抗体。
25.一种包含计算机可执行指令的计算机可读介质所执行的方法包括存储至少一个与CIS患者的测试样本中至少一种抗体水平相关的第一变量；存储至少一个与至少一种参考水平相关的第二变量；用至少包括第一和第二变量的函数计算转变为临床确诊的多发性硬化症(CDMQ的患者的风险因子；并且输出风险因子。
26.权利要求25中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与测试样本中的抗-Glc (a l，2)Glc(a)抗体，抗-Glc (a l，3)Glc(a)抗体，抗-Glc (a l，4)Glc(a)抗体， 和抗_Glc(a l，6)Glc(a)抗体水平对应。
27.权利要求25中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与选自下列组别中的测试样本的至少一种抗体水平对应抗_Glc(a lj)Glc(a) (GAGA2)IgM同型抗体， 抗-Glc (a l，3)Glc(a) (GAGA3) IgM 同型抗体，抗 _Glc(a l，4)Glc(a) (GAGA4) IgM 同型抗体，与抗-Glc (a l，6)Glc(a) (GAGA6) IgM 同型抗体。
28.一种包含计算机可执行指令的计算机可读介质所执行的方法包括存储至少一个与CIS患者的测试样本中至少一种抗体水平相关的第一变量； 存储至少一个与至少一种参考水平相关的第二变量；用至少包括第一和第二变量的函数计算患者在EDSS评分上进展的风险因子；并且输出风险因子。
29.权利要求观中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与测试样本中的抗-Glc (a l，2)Glc(a)抗体，抗-Glc (a l，3)Glc(a)抗体，抗-Glc (a 1,4) Glc ()抗体，和抗-Glc (a l，6)Glc(a )抗体对应。
30.权利要求观中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与选自下列组别中的测试样本的至少一种抗体水平对应抗_Glc(a lj)Glc(a) (GAGA2)IgM同型抗体， 抗-Glc (a l，3)Glc(a) (GAGA3) IgM 同型抗体，抗 _Glc(a l，4)Glc(a) (GAGA4) IgM 同型抗体，与抗-Glc (a l，6)Glc(a) (GAGA6) IgM 同型抗体。
31.一种包含计算机可执行指令的计算机可读介质所执行的方法包括 存储至少一个与患者的测试样本中至少一种抗体水平相关的第一变量； 存储至少一个与至少一种参考水平相关的第二变量；用至少包括第一和第二变量的函数计算患者进展为突破MS的风险因子；并且输出风险因子。
32.权利要求31中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与测试样本中抗-Glc(a l，2)Glc(a)抗体，抗 _Glc(a l，3)Glc(a)抗体，抗 _Glc(a l，4)Glc(a)抗体， 和抗-Glc (a l，6)Glc(a)抗体对应。
33.权利要求31中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与选自从下列组别中的测试样本的至少一种抗体水平对应抗_Glc(a l，2)Glc(a) (GAGA2)IgM同型抗体， 抗-Glc (a l，3)Glc(a) (GAGA3) IgM 同型抗体，抗 _Glc(a l，4)Glc(a) (GAGA4) IgM 同型抗体，与抗-Glc (a l，6)Glc(a) (GAGA6) IgM 同型抗体。
34.一种确定有由对比-增强Tl MRI病灶检测的活跃病程风险的个体的方法，该方法包括所述个体提供一测试样本；检测所述测试样本中抗_Glc( a 1，2) foil (β) (GAAB) IgM抗体的抗体水平；并且将所述测试样本中的所述抗体水平与所述抗体的参考水平相比，其中所述抗体水平与所述抗体的参考水平相比更高与由对比-增强Tl MRI病灶检测的活跃病程相关。
35.权利要求34所述的方法，其中所述的测试样本是一种选自全血，血清和血浆所组成的组合的生物流体。
36.一种确定会发展为突破MS的患有RRMS个体的方法，该方法包括 所述个体提供一测试样本；检测所述测试样本中抗_Glc( a 1，2) foil (β) (GAAB) IgM抗体的抗体水平；并且将所述测试样本中的所述抗体水平与所述抗体的参考水平相比，其中所述抗体水平与所述抗体的参考水平相比更高与突破MS相关。
37.权利要求36所述的方法，其中所述的测试样本是一种选自全血，血清和血浆所组成的组合的生物流体。
38.一种包含计算机可执行指令的计算机可读介质所执行的方法包括存储至少一个与RRMS患者的测试样本中至少一种抗体水平相关的第一变量； 存储至少一个与至少一种参考水平相关的第二变量；用至少包括第一和第二变量的函数计算进展为由对比-增强Tl MRI表现的活跃病程的风险因子；并且输出风险因子。
39.权利要求38中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与测试样本中抗-Glc ( α 1，幻fed ( β ) (GAAB) IgM抗体水平对应。
40.一种包含计算机可执行指令的计算机可读介质所执行的方法包括存储至少一个与RRMS患者的测试样本中至少一种抗体水平相关的第一变量； 存储至少一个与至少一种参考水平相关的第二变量； 用至少包括第一和第二变量的函数计算进展为突破MS的风险因子；并且输出风险因子。
41.权利要求40中的计算机可读介质，其中至少一个第一变量与测试样本中抗-Glc ( α 1，幻fed ( β ) (GAAB) IgM抗体水平对应。
全文摘要
本发明涉及多发性硬化症诊断和评估预后的方法和试剂。本发明是基于以下发现，部分地，抗-聚糖抗体对评估可发展为多发性硬化症(MS)的临床孤立综合症(CIS)患者是否会有临床复发的风险有用，例如，24个月。该发明也基于发现了抗-聚糖抗体对评估可发展为MS的CIS患者会有快速的病程进展以及累积残疾的风险有用，例如，永久性残疾，在某一特定时间范围内，例如，5年。
文档编号G01N33/68GK102439457SQ201080016344
公开日2012年5月2日 申请日期2010年2月11日 优先权日2009年2月12日
发明者A·杜克勒, J·亚登, N·多坦 申请人:格里科麦德斯有限公司
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