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专利名称：Maldi-tof ms辅助鉴定霍乱弧菌的方法
技术领域：
本发明涉及霍乱弧菌的检测新方法，尤其是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)辅助鉴定的方法。
背景技术：
在霍乱弧菌是烈性肠道传染病——霍乱的病原菌，霍乱发病急、传播快，主要症状为剧烈的腹泻和呕吐，可引起严重脱水、周围循环衰竭和急性肾衰，治疗不及时易死亡。目前已发现霍乱弧菌有200多种血清型，据报道只有01和0139两种血清型能引起霍乱的暴发流行(Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholora, Mol. Biol. 1998. Rev. 62 :1301-1314.)。霍乱弧菌广泛存在于河水、湖水以及海水中，甚至存在于牡蛎、海蟹、河蟹等水生动物的体表和体内，是水生环境中的正常栖息菌。对霍乱弧菌的检测主要是以分离培养进行鉴定，但这些传统的检测方法费时费力，诊断血清昂贵。人们不断地开展快速检测技术的研究，建立了很多基于核酸的快速检测方法，如PCR法、实时PCR法等，这些方法在霍乱弧菌的快速检测中发挥了很大作用。基 MIt 1 ! 1/ ^if WI^Mie (matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry, MALDI-T0F-MS)是近几年快速发展起来的应用于细菌快速检测的一项新技术，是一种新型的软电离生物质谱。它通过测得待测微生物的蛋白质指纹谱图，通过Biotyper软件对这些指纹谱图进行处理，并和数据库中已知微生物的标准指纹图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。在操作上制样简便、可微量化、高度自动化，已越来越多地用于微生物的检测与鉴定，特别是在细菌耐药性分型研究方面有很多报道。该技术的局限性是依赖于数据库的资源是否充足(Rapid typing of bacteria using matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry and pattern recognition software. J Microbiol Methods 2002 ;48 :127-38.)。然而，针对具体微生物的检测，该技术在应用的普及方面存在可依赖的数据库的资源不足的问题， 目前，Biotyper数据库非常缺乏霍乱弧菌的特征谱图。因此，迫切需要创建霍乱弧菌鉴定质谱图数据库并建立以此为基础的霍乱弧菌检测方法，并进一步开展MALDI-T0F-MS对霍乱弧菌分型和主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)研究。

发明内容
本发明的目的之一在于提供MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法，包括如下步骤①选取40 45株霍乱弧菌新鲜培养物，进行MALDI-T0F-MS检测前的样品预处理；②采集所有菌株样品的MALDI-T0F-MS图谱；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱；
④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱；⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。上述本发明的方法中所述的步骤①选择的霍乱弧菌共42株，分别是01群霍乱弧菌23株、0139群霍乱弧菌11株、非01/非0139群霍乱弧菌8株。上述本发明的方法中所述的步骤①的预处理方法是取霍乱弧菌新鲜培养物，在 Eppendorf管中加入300 μ L纯净水，挑取5 IOmg微生物培养物，混勻，再加入900 μ L无水乙醇，混勻后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50 μ L70%甲酸，混勻，再加入 50 μ L乙腈，混勻，同样以13000r/min离心aiiin，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干Ih后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1 μ L，晾干5min 后用于后续检测。本发明的上述方法中所述的步骤②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行图谱采集，仪器参数设定为线性操作模式，正离子模式；检测质量范围3000 13000Da ；激光点击数每个图谱50 ；激光频率30. OHz ；离子源加速电压20kv ；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800 17378Da。本发明的上述技术方案中所述的步骤⑥根据匹配分数判定检测结果的标准为当2. 300 <匹配分数< 3. 000，表示菌种鉴定的可信度很高；当2. 000 <匹配分数< 2. 300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；当1. 700 <匹配分数< 2. 000之间，表示可能的菌属鉴定；在0.000 <匹配分数< 1.700之间，表示不可信的鉴定。最为优选地，本发明所述的MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法包括如下步骤①选取01群霍乱弧菌23株、0139群霍乱弧菌11株和非01/非0139群霍乱弧菌8株的霍乱弧菌新鲜培养物进行MALDI-T0F-MS检测前的样品预处理取霍乱弧菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300 μ L纯净水，挑取5 IOmg微生物培养物，混勻，再加入 900 μ L无水乙醇，混勻后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50 μ L70%甲酸，混勻， 再加入50 μ L乙腈，混勻，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干Ih后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1 μ L，晾干5min后用于后续检测；②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集所有菌株样品的 MALDI-T0F-MS图谱，器参数设定为线性操作模式，正离子模式；检测质量范围3000 13000Da ；激光点击数每个图谱50 ；激光频率30. OHz ；离子源加速电压20kv ；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800 17378Da ；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱；④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱；⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数按照下述原则判定检测结果当2. 300 <匹配分数< 3. 000，表示菌种鉴定的可信度很高；当2. 000 <匹配分数< 2. 300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；当1. 700彡匹配分数< 2. 000之间，表示可能的菌属鉴定；在0. 000 <匹配分数< 1. 700之间，表示不可信的鉴定。本发明的目的之二在于提供建立MALDI-TOF MS霍乱弧菌标准图谱的方法，包括权利要求1的步骤① ③，即①选取40 45株霍乱弧菌新鲜培养物，进行MALDI-T0F-MS检测前的样品预处理；②采集所有菌株样品的MALDI-T0F-MS图谱；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱。其中各个步骤的优选手段与前文所述的相同。基于此，建立MALDI-TOF MS霍乱弧菌标准图谱的方法的最优选技术方案是①选取01群霍乱弧菌23株、0139群霍乱弧菌11株和非01/非0139群霍乱弧菌8株的霍乱弧菌新鲜培养物进行MALDI-T0F-MS检测前的样品预处理取霍乱弧菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300 μ L纯净水，挑取5 IOmg微生物培养物，混勻，再加入 900 μ L无水乙醇，混勻后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50 μ L70%甲酸，混勻， 再加入50 μ L乙腈，混勻，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干Ih后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1 μ L，晾干5min后用于后续检测；②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集所有菌株样品的 MALDI-T0F-MS图谱，器参数设定为线性操作模式，正离子模式；检测质量范围3000 13000Da ；激光点击数每个图谱50 ；激光频率30. OHz ；离子源加速电压20kv ；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800 17378Da ；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱。本发明的另一目标在于提供由上述方法建立的霍乱弧菌标准图谱。本发明通过采集42株霍乱弧菌的数据并获得特征指纹图谱，成功创建了霍乱弧菌鉴定质谱图数据库及标准图谱，可以实现对霍乱弧菌的准确鉴定。并且该方法操作上制样简便、可微量化、高度自动化。


本发明附图3幅，图1是本发明的霍乱弧菌的MALDI-TOF MS标准图谱；图2是本发明的42株霍乱弧菌MALDI-TOF MS聚类分型树状图；图3是42株霍乱弧菌主成分分析的3D分散图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明的技术方案及其应用，但不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，本发明所使用的仪器和试剂包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Microflex LRF20, Bruker Daltonik GmbH公司)；全自动细菌生化分析仪(BD PH0ENIX-100，美国BD公司)。α - ft -4-轻基肉桂酸(α -Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, CHCA)，乙月青(Acetonitrile，ACN)，三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA),肽标准品，蛋白标准品。上述试剂均购自Bruker Daltonik GmbH公司。检测样品配置基质的溶剂为ACN TFA 水(50 2. 5 47.5)。标准肽溶液配置基质的溶剂为ACN TFA 水(30 :0.1: 69.9)。MALDI-T0F-MS基质溶液是用溶剂将基质配成饱和溶液，基质溶液现用现配。营养琼脂(Nutrient Agar，ΝΑ)，均购于美国BD公司。ΑΡΙ-20Ε生化鉴定试剂盒购于法国梅里埃公司。实施例1(1)选取霍乱弧菌菌株选取由辽宁出入境检验检疫局收集的42株霍乱弧菌，包括01群霍乱弧菌23株、 0139群霍乱弧菌11株和非01/非0139群霍乱弧菌8株霍乱弧菌，具体信息见表1。表1 中所涉及的霍乱弧菌经ΑΡΙ-20Ε生化鉴定和全自动细菌生化分析仪鉴定，进一步确认为霍乱弧菌无误，可用于建立MALDI-TOF MS鉴定标准图谱。表 权利要求
1.MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法，包括如下步骤①选取40 45株霍乱弧菌新鲜培养物，进行MALDI-T0F-MS检测前的样品预处理；②采集所有菌株样品的MALDI-T0F-MS图谱；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱；④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱；⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤①选择的霍乱弧菌共42株，分别是 01群霍乱弧菌23株、0139群霍乱弧菌11株、非01/非0139群霍乱弧菌8株。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤①的预处理方法是取霍乱弧菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300 μ L纯净水，挑取5 IOmg微生物培养物，混勻，再加入900 μ L无水乙醇，混勻后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50 μ L 70%甲酸， 混勻，再加入50 μ L乙腈，混勻，同样以13000r/min离心aiiin，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干Ih后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔 1 μ L，晾干5min后用于后续检测。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行图谱采集，仪器参数设定为线性操作模式，正离子模式；检测质量范围 3000 13000Da ；激光点击数每个图谱50 ；激光频率30. OHz ；离子源加速电压20kv ；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800 17378Da。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤⑥根据匹配分数判定检测结果的标准为当2. 300 <匹配分数< 3. 000，表示菌种鉴定的可信度很高；当2. 000 <匹配分数< 2. 300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；当1.700 S匹配分数< 2. 000之间，表示可能的菌属鉴定；在0. 000 <匹配分数< 1. 700之间，表示不可信的鉴定。
6.权利要求1所述的方法，包括如下步骤①选取01群霍乱弧菌23株、0139群霍乱弧菌11株和非01/非0139群霍乱弧菌8株的霍乱弧菌新鲜培养物进行MALDI-T0F-MS检测前的样品预处理取霍乱弧菌新鲜培养物， 在Eppendorf管中加入300 μ L纯净水，挑取5 IOmg微生物培养物，混勻，再加入900 μ L 无水乙醇，混勻后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50 μ L70%甲酸，混勻，再加入 50 μ L乙腈，混勻，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干Ih后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1 μ L，晾干5min 后用于后续检测；②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集所有菌株样品的MALDI-T0F-MS图谱，器参数设定为线性操作模式，正离子模式；检测质量范围3000 13000Da ；激光点击数每个图谱50 ；激光频率30. OHz ；离子源加速电压20kv ；采用氮激电源，质荷比(m/z) 数据采集范围为800 17378Da ；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱；④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱；⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-T0F-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数按照下述原则判定检测结果当2. 300 <匹配分数< 3. 000，表示菌种鉴定的可信度很高； 当2. 000 <匹配分数< 2. 300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定； 当1.700 S匹配分数< 2. 000之间，表示可能的菌属鉴定； 在0. 000 <匹配分数< 1. 700之间，表示不可信的鉴定。
7.建立MALDI-TOFMS霍乱弧菌标准图谱的方法，包括权利要求1的步骤① ③。
8.权利要求7的方法建立的霍乱弧菌标准图谱。
全文摘要
MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法，包括如下步骤①选取40～45株霍乱弧菌新鲜培养物，进行样品预处理；②采集所有菌株样品的图谱；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化得霍乱弧菌标准图谱；④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。本发明成功创建了霍乱弧菌鉴定质谱图数据库及标准图谱，可以实现对霍乱弧菌简便、可微量化、高度自动化的准确鉴定。
文档编号G01N27/64GK102253110SQ201110154469
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月9日 优先权日2011年6月9日
发明者曹际娟 申请人:曹际娟