专利名称:硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法
技术领域:
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒,同时本发明还涉及测定硒浓度的 方法,属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术:
硒是生物必需的微量元素,植物硒是人类和动物获取硒的主要来源,人 体过多的摄入硒能引起硒中毒。硒元素可使人体内的过氧化物分解,保护 细胞膜、心、肾、肺、眼等;可清除人体的自由基,抗衰老,增强人体免 疫功能,可抑制多种致癌物质,人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症。
结合国内外有关硒的各种检测方法.其中常用的测定方法如原子吸收 光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法 (ICP-AES)等;原子吸收光谱(AAS)作为元素特效检测器与GC联用已成为微 量元素分析的主要方法。另外还有,应用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS) 鉴定硒化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用硒依赖性的酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Method)及酶(f禺)联 去(Couple Reaction)技
术,计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光 度的变化,得以测定硒浓度的方法,同时,本发明还将给出用以实现该方 法的硒诊断/测定试剂盒,采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硒浓度测定,而且测定速度快、准确度高,因而 可以得到切实的推广应用。
本发明硒浓度测定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢 过氧化氢+ D-galacto-hexodialdose半乳糖氧化酶 半乳糖
+氧
半乳糖+辅酶半乳糖脱氢酶 D-半乳糖酸内酯+
还原型辅酶
这种方法利用硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase; EC 1.11.1,9)酶(偶)联半乳糖氧化酶(galactose oxidase; EC 1.1.3.9)、半乳 糖脱氢酶(galactose dehydrogenases; EC 1.1.1.120; EC 1.1.1.48)酶促反应 速率比色法/终点法。谷胱甘肽过氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反应产生过氧 化氢,再通过(偶)联合半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶的作用,最终将辅 酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰), 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度,通过测量 340nm处吸光度上升的程度/速度,可以测算硒的浓度大小。
实验表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑, 无论是单剂、双剂还是三剂,如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较 为理想-
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L
半乳糖氧化酶 12000 U/L
半乳糖脱氢酶 12000 U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L D-GALACTO-HEXODIALDOSE 8 mmol/L
本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂,包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半 乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE。 试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体 试剂,直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、 D-GALACTO-HEXODIALDOSE 。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖 脱氢酶。
辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽 二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1或试剂2中的位置可以不 限。试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液 体试剂,直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、 D-GALACTO画HEXODI ALDOSE 。
试剂2
缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶。
辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽 二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以 配制成液体试剂,直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂,本发明测定硒浓度的方法,其辅酶可以是 NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂,包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L半乳糖氧化酶 半乳糖脱氢酶 谷胱甘肽二硫
D誦GALACTO-HEXODIALDOSE
12000U/L 12000 U/L 10 mmol/L 8 mmol/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,进行冷冻干燥,制成干粉试剂;使用 前,加入纯净水,复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C,反应时间10分钟,起始吸光 度《0.1,测试主波长340rnn,测试副波长405nm,被测硒样品与试剂的 体积比例为1/25,反应方向为正反应(上升反应),延迟时间大约1分钟左 右,检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析 仪下,检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度,从而测算出硒的浓度大 小。
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂,包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶
谷胱甘肽二硫
D画GALACTO-HEXODIALDOSE
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 8 mmol/L
试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L
半乳糖氧化酶 12000 U/L
半乳糖脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体双试剂,可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定:温度37'C,反应时间10分钟,起始吸光 度《0.1,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测硒样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为正反应(上升反应),延迟时间大 约1分钟左右,检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析 仪下,检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度,从而测算出硒的浓度大 小。
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂,包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 ■ 3 mmol/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
D-GALACTO-HEXODIALDOSE 8 mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100 mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
半乳糖氧化酶
12000U/L
半乳糖脱氢酶
12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
100 mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶
10000U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体三试剂,可以直接使用。 测定硒浓度时,在全自动生化分析仪上设定温度37"C,反应时间10 分钟,起始吸光度《0.1,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测 硒样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应方向为正反 应(上升反应),延迟时间大约l分钟左右,检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析 仪下,检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度,从而测算出硒的浓度大 小。
申请人经过实验验证,采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到 本发明的目的,鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同,不另一一例举。
总之,实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0010; 吸光度时间反应曲线应呈直线上升;试剂可测有效(R》0.99)线形范围可 达0.5mmol/L;试剂测试的不准确度,其相对偏差不超过±7%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2 %;试剂的灵敏度可达0.064 ±
0.032 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好,线形范围宽广,足以便 于推广应用。
权利要求
1. 一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法的硒的浓度测定方法,其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 <u>谷胱甘肽过氧化物酶/Se</u> 2谷胱甘肽+过氧化氢过氧化氢+D-galacto-hexodialdose <u>半乳糖氧化酶</u> 半乳糖 +氧半乳糖+辅酶 <u>半乳糖脱氢酶</u> D-半乳糖酸内酯+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度,测算出硒的浓度大小测定结果。
2. —种硒诊断/测定试剂盒,主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶1000———80000 U/L半乳糖氧化酶1000———訓00 U/L半乳糖脱氢酶1000———腦00 U/L谷胱甘肽二硫1—50 mmol/LD-GALACTO-HEXODIALDOSEl一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围;在此范围内效果较好,在此范围外,试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液体试剂,直接使用。
3. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳 糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成单剂试 剂。
4. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳 糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成双剂 试剂;试剂1,由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、 D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、谷 胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶组成。辅酶、谷胱甘 肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、 D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳 糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成多剂 试剂;试剂1,由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、 D-GALACTO-HEXODIALDOSE组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、半 乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶组成;试剂3,由缓冲液、稳定剂、谷胱甘 肽过氧化物酶组成。辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE在试剂1、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒,其特征在于还包括稳定剂 14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒,同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分,属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、谷胱甘肽二硫、D-GALACTO-HEXODIALDOSE、谷胱甘肽过氧化物酶、半乳糖氧化酶、半乳糖脱氢酶及稳定剂;通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列的酶促反应,再将反应物置于紫外/可见光分析仪下,检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度,从而测算出硒的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464332SQ20071019212
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司