专利名称：基于sirpa表达富集源自多能干细胞的心肌祖细胞和心肌细胞的方法
技术领域：
本发明涉及基于SIRPA表达富集源自多能干细胞的心肌祖细胞和心肌细胞的方法。
背景技术：
人胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞(hiPSC)生成心血管细胞培养物的潜能为研究细胞相互作用和控制这些谱系的特化、定型和成熟的分子调节物提供了强大的模型系统，并为药物检测和再生医学策略提供了人心肌细胞的独特和无限的来源H。然而，将此非凡潜能转化为实践依赖于使高度富集的心肌细胞群可再生的技术，因为污染的细胞类型将影响药物应答和其他体外功能性质，并增加在体内移植后异常生长和形成畸胎瘤的风险
5。当在最佳心脏条件下诱导时，人多能干细胞(hPSC)将有效分化生成混合的心血管群，包括心肌细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞3。尽管心肌细胞可占任意给定hPSC系群体的多达70%，生成此谱系的效力在不同干细胞系之间有明显差别。进一步操纵诱导条件尚未产生从多种hPSC系生成纯的心肌细胞群的策略。为了从分化培养物中富集心肌细胞，已经将心肌细胞特异性荧光报告物或可药物选择的元件引入hPSC6—8。分化后，可通过荧光激活细胞分选(FACS)或加入合适的选择药物富集心肌细胞。尽管这些策略的确允许生成富集的心肌细胞群，它们具有一大缺点，因为必须将报告载体引入所使用的每株hPSC系，导致遗传改造的心肌细胞，因此降低了它们在临床应用中的效用。在更近期的研究中，Hattori等人证明,有可能通过FACS基于其高线粒体含量分离心肌细胞9。尽管此方法似乎可用于分离成熟的心肌细胞，然而具有较少线粒体的细胞，例如来自未成熟的hPSC的心肌细胞可能较难与其他细胞类型区分。发明概述在一个方面，提供了富集细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，其包括提供细胞群，待从所述细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞；和从所述群体中分离表达SIRPA的细胞；其中所述细胞群包含被诱导分化为心肌细胞和心肌祖细胞的人多能干细胞群。在其他方面，提供了使用本文描述的任一种方法得到的经富集的心肌细胞和心肌祖细胞群。在其他方面，提供了富集了心肌细胞和心肌祖细胞的分离的细胞群，其中所述细胞群包含至少60%，优选至少90%的心肌细胞和心肌祖细胞。在其他方面，提供了 SIRPA用于从细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞的用途，其中所述细胞群包含被诱导分化为心肌细胞和 心肌祖细胞的人多能干细胞群。在其他方面，提供了去除细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，其包括:提供细胞群，待从所述细胞群中去除心肌细胞和心肌祖细胞；和从所述群体中去除表达SIRPA的细胞；其中所述细胞群包含被诱导分化为心肌细胞、心肌祖细胞和非心肌细胞的人多能干细胞群。在其他方面，提供了富集细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，其包括:提供细胞群，待从所述细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞；和从所述群体中去除表达CD90，⑶31，⑶140B和⑶49A中至少一种的细胞；其中所述细胞群包含被诱导分化为心肌细胞、心肌祖细胞和非心肌细胞的人多能干细胞群。附图描述通过参考以下说明书和附图可最好地理解本发明的实施方案。在图中:
图1显示了来自hESC的心血管谱系的特化。(a)用于将hESC分化为心脏谱系的方案概述(修改自Yang等人，2008)。(b)在分化期间不同阶段的源自HES2的胚状体(EB)中BRA CHUR Y (T)，MESPl，ISLETl (ISLl)，NKX2-5，MYH6 ( a MHC)，ΜΥΗ7 ( β MHC)，MYL2 (MLC2v)，MYL7 (MLC2a)，NEURODI 和 F0XA2 的定量 PCR(QPCR)分析。第 O 天，hES 细胞；LV,人胎儿左心室；LA，人胎儿左心房；AH，人成人心脏，Ed，源自hESC的内胚层13。棒代表平均值土平均值的标准差，η = 3。图2显示了在hESC分化期间细胞表面受体SIRPA的表达。(a)对源自NKX2_5_GFPhESC的EB的SIRPA的流式细胞术分析(SIRPA)。(b)在指示的时间在源自HES2的EB群上的SIRPA表达。(c)在分化的不同时间源自HES2的EB中的SIRPA及其配体⑶47的表达的RT-qPCR分析。第O天，ES细胞；LV，人胎儿左心室；LA，人胎儿左心房；AH，人成人心脏。棒代表平均值土平均值的标准差，η = 4。(d)对心脏单层培养物进行SIRPA和心肌钙蛋白
I(cTNI)免疫染色。从第20天的源自HES2的EB生成单层。图3显示了通过基于SIRPA表达的细胞分选从源自hESC的培养物富集心肌细胞。(a)在分化的d8、dl2和d20的EB中的SIRPA表达的流式细胞分析。在d8、dl2和d20进行SIRPA的荧光激活细胞分选(FACS)。通过细胞内流式细胞术分析了每个时点的分选前(PS)，SIRPA+和SIRPA_级分的心肌钙蛋白T(cTNT)表达。相比SIRPA_细胞(第8天:13.0±2.1，第 12 天:14.3±3.9，第 20 天:15.7±6.0)，在 SIRPA+级分中在 d8、dl2 和d20的cTNT+细胞频率显著更高(第8天:95.2% ±1.9，第12天:94.4±1.7，第20天:89.6±3.6)。(b)来自3次不同的细胞分离实验的cTNT+细胞的平均富集。棒代表平均值的标准差。星号指示统计显著性，通过student t检验确定( 0.001)。(c) PS, SIRPA+和SIRPA—细胞的QPCR分析。在分析的所有阶段(d8、dl2和d20)，相比SIRPA—级分，在SIRPA+级分中的SIRPA，NKX2-5，MYH6，MYH7和MYL7的表达都显著更高。非心脏谱系的标记物(PECAM和DDR2)的表达局限于SIRPA_组分中。棒代表平均值土平均值的标准差。星号指示统计显著性，通过 student t 检验确定,* (p ( 0.05), ** (p < 0.01), *** (p ( 0.001)，η = 3。(d)对从在第20天分选的PS，SIRPA+和SIRPA_细胞生产的单层培养物的心肌钙蛋白I(cTNI)免疫染色。
图4显示了基于SIRPA表达通过细胞分选从源自hiPSC的培养物中富集心肌细胞。(a)在分化的d20，对38-2和源自MSC_iPSlhiPSC的细胞的SIRPA表达的流式细胞分析。在d20进行SIRPA的荧光激活细胞分选(FACS)，并且通过细胞内流式细胞术分析了分选前(PS) ,SIRPA+和SIRPA_级分的心肌钙蛋白T(cTNT)表达。(b)相比SIRPA_细胞(MSC_iPSl:4.9±2.1，38-2:6.2±0.9)，在两种源自hiPSC的培养物的SIRPA+级分中的cTNT.细胞的频率都显著更高(MSC-1PSl:67.0±3.6,38-2:71.4±3.8)。棒代表平均值土平均值的标准差。星号指示统计显著性，通过student t检验确定，**(p彡0.01), ***(p ( 0.001)，η = 3。(c)在 d20 的分选后，源自 MSC-1PSl 和 38_2hiPSC 的 PS, SIRPA+ 和 SIRPA-细胞的QPCR分析。相比SIRPA_级分，在SIRPA+中的心脏谱系特异性标记物(SIRPA，NKX2-5，MYH6，MYH7，MYL2和MYL7)的表达显著更高。非心脏谱系的标记物(DDR2，I3DGFRB和NEURODI)的表达局限于SIRPA-级分和PS细胞。棒代表平均值土平均值的标准差。星号指示统计显著性，通过 student t 检验确定，*(p < 0.05), **(p < 0.01)，***(p ( 0.001), η = 5。图5显示了在人胎儿心肌细胞上和在成年人心脏中的SIRPA表达。(a)人胎儿心脏组织和成年人心脏中的SIRPA的RT-qPCR分析。LV，左心室；RV，右心室；AP，心尖；LA，左心房；RA，右心房，AVJ，房室交界区；HEK，人胚胎肾细胞；AH，成年人心脏；第0天，hES细胞；d20，心脏分化的第20天，RT，逆转录酶对照。棒代表平均值土平均值的标准差，η = 6。(b)对人胎儿心室细胞的SIRPA的免疫染色(绿色)，并用Mito Tracker Red(红色，积累在线粒体基质中)和DAPI (蓝色，细胞核染料)染色。(c)对人胎儿心脏组织的SIRPA的流式细胞分析。(d)对人胎儿心脏组织的cTNT的细胞内流式细胞分析。图6显示了利用SIRPA预测心脏分化效率。(a)用不同组合的激活素A (ACTA0，3，6，9ng/ml)和BMP4 (10，30ng/ml)诱导的心脏分化组织的第5天的KDR/H)GFRA流式细胞术谱。已经显示KDR+PDGFRB+群体含有心脏中胚层细胞2。(b) (a)中描述的培养物的第9天的SIRPA流式细胞分析表达谱。(c) (a)中描述的培养物的第20天的cTNT谱(细胞内流式细胞分析)。(d) a-c的定量。在第9天的SIRPA表达(绿色点)和在第20天的cTNT表达(红色菱形)的紧密相关性说明SIRPA对心脏分化效率的预测潜能。图7显示了通过负选择富集心肌细胞。(a)在第20天的分化培养物(HES2)中对在非肌细胞(SIRPA阴性)上特异性表达的标记物的流式细胞分析。(b)在非肌细胞上特异性表达的标记物组合(在PE中:⑶31，⑶90，⑶140B，⑶49A)的荧光激活细胞分选。(c)对分选前细胞，PE阴性(LINO和PE阳性(LIN+)样品的SIRPA的流式细胞分析。(d)在分化第20天的非肌细胞标记物(如在(a)中所示)的定量，η = 4。(e)在细胞分选后的PS, LIN-和LIN+级分中的SIRPA阳性细胞的定量。星号指示统计显著性，通过student t检验确定，林*(P < 0.001)，η = 3。(f)分选前(PS)，LIN—和LIN+样品的非心脏标记物(PECAM1，PDGFRB，THYl 和 DDR2)和心脏特异性基因(SIRPA，NKX2-5，MYH6 和 MYH7)的 QPCR分析。棒代表平均值土平均值的标准差。星号指示统计显著性，通过student t检验确定，* (P < 0.05), (P < 0.01), *** (P ^ 0.001), η = 3。图8显示了 ΝΚΧ2.5-GFP HES3 hESC细胞系的分化动力学。在分化期间的多个时间源自NKX2.5-GFP hESC细胞系的EB的流式细胞分析。在分化的第8天首次检测到GFP表达，并随时间增加，在第20天表达最闻。图9显示了 NKX2.5-GFP HES3和HES2 hESC细胞系的SIRPA表达动力学。(a)通过流式细胞分析来分析和定量SIRPA+/NKX2.5-GFP+细胞。在分化期间的多个时间分析了源自NKX2.5-GFP hESC细胞 系的ΕΒ，η = 5。(b)通过流式细胞分析来分析和定量SIRPA+细胞。在分化期间的多个时间分析了源自HES2 hESC细胞系的ΕΒ，η = 8。d0 =未分化的ES细胞，d5-d20 =在第5天-第20天分化的EB。
图10显示了流式细胞分析策略和染色对照。(a)第20天的源自EB的细胞的流式细胞分析。用活力染料DAPI染色所有细胞，在每个实验中仅分析DAPI阴性细胞(=活细胞)。(b)通过FSC/SSC进一步测定活的单细胞(细胞大小和粒度)以排除碎片和成对细胞或细胞块。(c)分化第20天的源自EB的细胞的未染色对照。(d)第20天的源自EB的细胞的流式细胞分析，使用SIRPA-PE-Cy7抗体和相应的IgG对照。(e)第20天的源自EB的细胞的流式细胞分析，使用SIRPA-生物素/链霉抗生物素-APC(SIRPA-bio/SA-APC)抗体组合，相应的IgG对照和只用二抗染色。(f)通过FSC和SSC比较SIRPA-和SIRPA+细胞群(来自(e))之间的细胞大小。图11显示了 SIRPA抗体的蛋白质印迹分析和特异性的确认。(a)来自第20天(d20)分化培养物的3个样品相比未分化ES细胞(d0)的蛋白质印迹分析。使用SIRPASE5A5抗体，用丽春红染色显示加载的对照。(b)使用SIRPA SE5A5a抗体和对照进行免疫共沉淀。SIRPA移动至预测的大�。缫郧霸赥imms等人，1999中描述和分析的。图12显示了 SIRPA抗体染色与线粒体追踪染料保留标记的比较。(a)在HES2 hESC分化第5、8、12和20天时线粒体追踪染料标记的流式细胞分析。(b)在HES2 hESC分化第
5、8、12和20天时SIRPA的流式细胞分析。(c) SIRPA和线粒体追踪染料标记的共染色，随后在HES2 hESC分化第5、8、12和20天时进行流式细胞分析。图13显示了 SIRPA和cTNT的共表达。首先对细胞的SIRPA染色，然后固定(4%PFA, 20分钟)，随后对cTNT进行细胞内染色。因为两种一抗都在小鼠中产生，也显示了适当的对照。用抗SIRPA-生物素/链霉抗生物素-APC (SIRPA单染)，抗SIRPA-生物素/链霉抗生物素-APC和抗小鼠-PE (证明cTNT的二抗不识别固定后的SIRPA)，抗SIRPA-生物素/链霉抗生物素-APC和抗cTNT和抗小鼠-PE (SIRPA和cTNT共染色)对细胞染色。图14显示了在源自小鼠胚胎干细胞的心肌细胞和成年小鼠组织样品中Sirpa表达的分析。(a)源自mESC的心脏EB培养物的流式`细胞分析。对细胞的Sirpa-APC染色，用4% PFA固定，然后用cTnT/抗小鼠-PE染色。Sirpa表达细胞未与cTnT表达细胞的共染色，表明源自mES细胞的心肌细胞不表达Sirpa。(b)源自mESC的心脏EB培养物的流式细胞分析。Sirpa阳性细胞与⑶45-PE-Cy7共染色，表明这些培养物中存在的Sirpa阳性细胞代表造血细胞，以前已报导了造血细胞表达Sirpa(参考)。(c)在成年小鼠组织样品中的Sirpa的QPCR分析。TA，胫前�。籊A,腓肠�。籊I,胃肠道；RT,逆转录酶对照；ESCM,源自小鼠胚胎干细胞的分化第7天的心肌细胞(Kattman等人，2011)。使用小鼠脑组织作为阳性对照。(d)来自对照(c)和Sirpa缺陷小鼠(ko) (Timms等人，1999)的成年心脏、脑和肾组织和源自小鼠ESC的心肌细胞的蛋白质印迹分析。(d).仅在对照小鼠的脑组织中检测到Sirpa表达，但在Sirpa缺陷样品或对照的心脏、肾或源自mESC的样品的任一种中都没有检测到。如 Timms 等人，1999.ABCAM:Anti_Sirpa antibodies (Abeam, 8120)中所描述的，使用抗体#16和#9 (细胞质结构域特异性的，对所有Sirpa同种型是普遍的，AB#16, AB#9)。图15显示了在FACS后SIRPA-和SIRPA+级分的纯度分析。(a)细胞分选后预分前，SIRPA-和SIRPA+级分的SIRPA流式细胞分析。(b)细胞分选后在分选前，SIRPA-和SIRPA+级分中的SIRPA+细胞的定量，η = 3。图16显示了通过基于SIRPA表达的细胞分选从源自hESC的培养物中富集心肌细胞。(a)NKX2.5-GFP HES3 hESC分化第8、12和20天(d)的SIRPA表达的流式细胞分析。在d8、dl2和d20进行SIRPA的荧光激活细胞分选(FACS)，并通过细胞内流式细胞术分析分选前(PS)，SIRPA+和SIRPA-级分的心肌钙蛋白T(cTnT)的表达。相比SIRPA-细胞(第 8天:9.9±1.7，第 12 天:21.9±2.5，第 20 天:5.2±0.5)，在 SIRPA+级分中 d8、dl2 和d20的cTnT+细胞的频率显著较高(第8天:89.8% ±1.9，第12天:95.0± 1.3，第20天:89.4±4.4)，η = 3。(b)细胞分选后PS, SIRPA+和SIRPA-细胞的QPCR分析。在分析的所有阶段(d8、dl2和d20)，相比SIRPA-级分，在SIRPA+中心脏谱系特异性标记物(NKX2.5，MYH6，MYH7和MYL7)的表达显著较高。非心脏谱系的标记物(PECAM和DDR2)的表达局限于SIRPA-级分和PS细胞，η = 3。图17显示了通过珠分选来分离SIRPA+心肌细胞。(a) SIRPA的流式细胞分析。使用Miltenyi磁珠分选系统分选源自HES2的EB，并且在分选后分析PS，SIRPA+和SIRPA级分的SIRPA表达。(b)PS，SIRPA+和SIRPA-级分的细胞内cTnT流式细胞分析。图18显示了人成人组织的基因表达分析。(a) SIRPA的QPCR RT分析。(b)CD47的QPCR RT分析。图19显示了在源自Y2-1的分化培养物中非肌细胞标记物的表达。(a)在第20天的分化培养物中的非肌(SIRPA-)细胞上特异性表达的标记物的流式细胞分析。(b)Y2-liPS细胞分化第20天的非肌细胞标记物表达的定量。图20是表，其显示了使用SIRPA抗体的荧光激活细胞分选(FACS)的效率。(a)在来自分化第20天的HES2的源自EB细胞的FACS后的SIRPA-细胞的回收，η = 8。(b)在来自分化第20天的HES2的EB来源细胞的FACS后的SIRPA-细胞的回收，η =
9。总细胞#=通过流式细胞仪的全部细胞；SIRPA-(SIRPA+)# =分选程序后回收的全部SIRPA-(SIRPA+)细胞；SIRPA-(SIRPA+) %=通过用 SIRPA 抗体染色确定的 SIRPA-(SIRPA+)细胞的百分比；SIRPA-(SIRPA+)eXp细胞# =基于用SIRPA抗体染色和分选的总细胞数预期的 SIRPA-(SIRPA+ )细胞的细胞数；Eff SIRPA-(SIRPA+) = SIRPA-(SIRPA+)细胞回收效率:SIRPA-(SIRPA+)细胞 #/SIRPA-(SIRPA+)预期细胞 # ;EffSIRPA-(SIRPA+)=以百分比表示的SIRPA-(SIRPA+)细胞回收效率。图21是表，其显示了使用非肌细胞标记物的荧光激活细胞分选(FACS)的效率。(a)在来自分化第20天的HES2的源自EB细胞的FACS后的LIN-细胞的回收，η = 6.(b)在来自分化第20天的HES2的源自EB细胞的FACS后的LIN+细胞的回收，η = 6。总细胞#=通过流式细胞仪的全部细胞；LIN-(LIN+)# =分选程序后回收的总LIN-(LIN+)细胞；LIN-(LIN+) %=通过用LIN抗体染色确定的LIN-(LIN+)细胞的百分比；LIN_(LIN+)exp细胞# =基于用LIN抗体染色和分选的总细胞数预期的LIN-(LIN+)细胞的细胞数；EffLIN-(LIN+) = LIN-(LIN+)细胞回收效率:LIN_(LIN+)细胞 #/LIN_ (LIN+)预期细胞# ;Eff LIN-(LIN+)=以百分比表示的LIN-(LIN+)细胞回收效率。发明详述本文描述了使用高通量流式细胞术筛选来鉴定人心肌细胞特异性的细胞表面标记物。我们在这里报导细胞表面受体SIRPA在源自hPSC的心肌细胞以及人胎儿心肌细胞上表达。使用以针对SIRPA的抗体的细胞分�。颐侵っ鞔觝PSC分化培养物中分离由多达98%的心肌细胞组成的细胞群是可能的。在适当分化条件下从人多能干细胞(hPSC)生成的心肌祖细胞和肌钙蛋白T阳性心肌细胞上可特异性和专有地找到细胞表面抗原，SIRPA (又称⑶172a，BIT, SHPSI)。在本申请以前，本领域没有迹象或证据显示SIRPA在发育中的小鼠或人心血管细胞上表达。已经在脑的不同部分以及血液中发现人SIRPA的RNA表达，在肺中发现低水平的人SIRPA的RNA表达。然而，没有在心脏中发现SIRPA RNA表达(http://biogps.gnf.0rg)。已在脑中、血液和淋巴组织中和结肠中检测到SIRPA蛋白表达，在胎盘、胰腺、脾、膀胱和胃中检测到中等至低水平的SIRPA蛋白表达(http: //www.proteinatlas.0rg/)。然而，在成人心脏中没有报导过有蛋白质表达。就这一点而论，发现SIRPA在源自hPSC的心肌祖细胞和心肌细胞中表达既新颖又令人惊讶。在一个实施例中，使用SIRPA结合部分，例如SIRPA抗体提供了从源自人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞的细胞群中鉴定、监控和分离心肌细胞及其祖细胞的简单又新颖的方法。细胞分离简单又有效，在一个实施方案中得到由超过90%的心肌细胞组成的细胞群，所述心肌细胞保持活力且可用于本申请公开的应用。在筛选了超过350种由安大略癌症研究抗体核心设施研究所(Ontario Institutefor Cancer Research Antibody Core Facility)提供的市售抗体后，将 SIRPA 鉴定为潜在的心脏标记物。针对代表不同心脏发育阶段的源自hESC的细胞群筛选抗体，所述细胞群是通过使用以前公布的方案 (Yang等人，2008)3定向分化hESC生成的。进一步研究对与分化培养物中的心肌细胞群(通过心肌钙蛋白T(cTnT)染色确定)大小类似的细胞群染色的抗体，并用于细胞分选。在350种表面抗体中，一种抗体，SIRPA，特异和专有地对源自hESC的心肌细胞群染色。基于SIRPA表达分离的细胞代表了用于多种应用的高度富集的源自多能干细胞的心肌祖细胞(例如在Nkx2.5表达开始时但在细胞收缩和心脏特异性结构蛋白表达以前)和心肌细胞的新来源，所述应用包括但不限于建立患者特异性疾病模型，以及来自正�：突颊咛匾煨远嗄芨上赴男募∽嫦赴托募∠赴囊糯�、外遗传和蛋白质组学分析。SIRPA在心肌细胞及其前体上的特异性表达提示此受体及其下游信号传递途经在心脏发育和分化中的功能。SIRPA也可用作细胞分选实验的阴性标记物，用于富集源自非心源性PSC的谱系，例如包括源自体节的谱系(骨骼肌、骨和软骨/软骨细胞的祖细胞)。因此，在一个方面，提供了富集细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，所述方法包括提供细胞群，待从所述细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞；和从群体中分离表达SIRPA的细胞；其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞和心肌祖细胞的人多能干细胞群。在一个实施方案中，人多能干细胞是胚胎干细胞。在另一个实施方案中，人多能干细胞是经诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，将人多能干细胞暴露于一定量的至少一种有效诱导细胞分化的诱导剂。在优选的实施方案中，至少一种诱导剂包含细胞因子。至少一种诱导剂可包含激活素A,优选地浓度至多40ng/ml,更优选地浓度约6ng/ml或约30ng/ml。至少一种诱导剂可还独立地包含骨形态发生蛋白4,优选地浓度至多40ng/ml,更优选地浓度约10ng/ml。在一些实施方案中，还将人多能干细胞暴露于骨形态发生蛋白抑制剂，所述抑制剂优选地选自Dorsomorphin、Noggin和可溶性骨形态发生蛋白受体。
在一些实施方案中，还将人多能干细胞暴露于VEGF、DKK和bFGF中的至少一种。在一些实施方案中，将人多能干细胞暴露于诱导剂介于约I天和约5天之间，优选地约3天。在一些实施方案中，开始诱导人多能干细胞和分离表达SIRPA的细胞之间的时间为介于约5天和约45天之间，优选地介于约8天和约25天之间。在一些实施方案中，在细胞开始表达SIRPA之后分离表达SIRPA的细胞，所述细胞开始表达SIRPA出现在细胞开始表达Nkx2.5的时间附近。优选地，在细胞开始表达Nkx2.5的时间和细胞开始收缩和表达心脏特异性结构蛋白的时间之间分离具有SIRPA细胞表面抗原的细胞。在一些实施方案中，方法还包括从群体中去除表达⑶90，⑶31，⑶140B和⑶49A中至少一种的细胞，优选地使用相应的抗体。分离表达特定分子(在此处为SIRPA)的细胞的方法是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，通过使用SIRPA特异性配体，优选地使用抗SIRPA抗体或抗体片段，或抗体样分子，以及更优选抗SIRPA抗体，将SIRPA的存在直接用于分离细胞。在一些实施方案中，然后使用磁珠和/ 或流式细胞术分离细胞。备选地，可间接地选择表达SIRPA的细胞。例如，在一些实施方案中，群体中的细胞包含与SIRPA基因座的调节控制元件有效连接的报告基因，由此报告基因在表达SIRPA的细胞中表达，并且分离表达SIRPA的细胞的步骤包括分离表达报告基因的细胞。在一个优选的实施方案中，报告基因赋予对细胞毒性剂的抗性。在另一个优选的实施方案中，报告基因是细胞表面标签。在一些实施方案中，经富集的细胞群包含至少60%，优选至少90%，更优选98%的心肌细胞和心肌祖细胞。在其他方面，提供了使用本文描述的任一种方法得到的富集的心肌细胞和心肌祖细胞的细胞群。在其他方面，提供了富集了心肌细胞和心肌祖细胞的分离的细胞群，其中细胞群包含至少60%，优选至少90%，更优选98%的心肌细胞和心肌祖细胞。在其他方面，提供了 SIRPA用于从细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞的用途，其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞和心肌祖细胞的人多能干细胞群。在其他方面，提供了去除细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，所述方法包括:提供细胞群，待从所述细胞群中去除心肌细胞和心肌祖细胞；和从细胞群中去除表达SIRPA的细胞；其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞、心肌祖细胞和非心肌细胞的人多能干细胞群。在其他方面，提供了富集细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，所述方法包括:提供细胞群，待从所述细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞；和从群体中去除表达CD90，⑶31，⑶140B和⑶49A中的至少一种的细胞；其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞、心肌祖细胞和非心肌细胞的人多能干细胞群。在本发明上下文中使用的术语“富集”包括在细胞群中提高期望的一种或多种细胞类型的相对丰度的任意分离或分选方法。本文中使用的术语“心肌细胞”指包含心肌的细胞。术语“心肌祖细胞”表示源自具有分化为心肌细胞的能力的人多能干细胞的祖细胞。本文中使用的“分离细胞”的方法指本领域技术人员公知的用于分选细胞的任意方法，其包括但不限于流式细胞术、荧光激活细胞分选、使用抗体包被的磁珠的磁分离、亲和层析和利用物理性质的差异(例如，密度梯度离心)。“胚胎干细胞”(“ESC”)是源自早期胚胎的多能干细胞。在本发明上下文中使用的“诱导多能干细胞”(“iPSC”)是多能干细胞的类型，其通过诱导特定基因的表达人工地源自非多能细胞。术语“细胞表面抗原”指细胞表面上能够被免疫系统识别和与抗体特异性结合的抗原。本文中使用的短语“被诱导分化”指用于起始人多能干细胞分化为特化细胞类型的本领域公知的任意方法。这些方法可包括将人多能干细胞暴露于诱导剂。本文中使用的术语“诱导剂”指能够起始hPSC分化为特化细胞类型(包括心肌细胞和心肌祖细胞)的任意试剂。诱导剂因此包括细胞因子，包括但不限于激活素A、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，又称FGF2)、血管内皮生长因子(VEGF，又称VEGFA)、dickkopf同系物I (DKKl)，及其组合。诱导人多能干细胞分化为心肌细胞和心肌祖细胞的方法是本领域技术人员公知的(例如见Yang等人3，和Lafla_e等人19)。在一些实施方案中,可通过在得到的经富集的细胞群中测量SIRPA的浓度优化诱导条件(例如诱导剂的浓度及其使用的时机)。从人多能干细胞hPSC (包括胚胎干细胞；hESC和诱导多能干细胞；hiPSC)生成心脏谱系的细胞的能力提 供了新颖和无限的人心肌细胞供应，所述人心肌细胞将用于:1)预测药物毒理学和药物发现，2)用于治疗心血管疾病的移植和3)心血管发育和疾病的体外建模。以下实施例说明了本发明的多个方面，但不限制本文公开的本发明的广泛方面。实施例材料和方法HPSC的维持和分化如文献所述维持hPSC26。如以前描述的将胚状体(EB)分化为心血管谱系2’3(图1a) ο简单地说:在第O天(d0)生成EB,并在分化第一天(d0_dl)加入BMP4(lng/ml)。在第I天收获EB并重悬在诱导培养基中(碱性成纤维细胞生长因子(bFGF ；2.5ng/ml)，激活素A(6ng/ml)和BMP-4 (10ng/ml))。在第4天更换培养基并补充血管内皮生长因子(VEGF ；10ng/ml)和DKK(150ng/ml)。在第8天再次更换培养基并补充VEGF(20ng/ml)和bFGF(10ng/ml)。贯穿实验在 StemPro_34(Invitrogen)中培养 EB。在从第 0-12 天在 5%CO2, 5% 02，90% N2的环境下维持培养物，然后转移至5% CO2/空气环境下用于其余培养期。使用以前描述的方案，通过将编码GFP的序列靶向至HES3细胞的NKX2-5基因座生成 NKX2-5-GFP hESC27 (D.E.，A.G.E.和 E.G.S.，手稿已提交)。在大学健康网络(University Health Network)依照人类伦理委员会的要求并经其许可进行涉及人组织收集和分析的工作。流式细胞术和细胞分选
第5天至第12天EB的解离程序:用0.25%胰蛋白酶/EDTA解离从hPSC分化实验生成的EB。第13天和更老的EB和人胎儿组织的解离程序:在溶于Hanks溶液(NaCl136mM, NaHC03 4.16mM, NaP04 0.34mM, KCl 5.36mM, KH2P04 0.44mM,葡萄糖 5.55mM, Hepes5mM)的II型胶原酶(lmg/ml ；fforthington, LS004176)中室温过夜孵育从hPSC分化培养物生成的EB，同时温和摇晃28。第二天，对细胞悬浮物加入等量的解离溶液(溶于Hanks溶液:牛磺酸，IOmM7EGTA 0.1mM7BSA lmg/ml, II型胶原酶lmg/ml)，温和吹打EB以完全解离。离心细胞(lOOOrpm, 5min)并过滤。对分化超过40天的EB,可能需要用0.25%胰蛋白酶/EDTA的额外处理，以获得完全解离为单个细胞。用抗KDR-别藻蓝蛋白(R&D Systems ；1: 10)和抗I3DGFRA-藻红蛋白(R&DSystems ；1: 20)，抗 SIRPA-1gG-藻红蛋白-Cy7 (克隆 SE5A5 ;BioLegends ; I: 500)10’29，抗SIRPA-1gG-生物素(克隆SE5A5 ；BioLegends ；1: 500)1(1，抗肌钙蛋白T的心脏同种型(cTNT)(克隆 13-11 ；NeoMarkers ；1: 400)，山羊抗小鼠 IgG-别藻蓝蛋白(BD ；1: 200)，链霉抗生物素-别藻蓝蛋白(BD:1: 200)，抗18611^-藻红蛋白-077(克隆皿^(:-21;BioLegends ；1: 500)，抗 IgGl κ -生物素(克隆 MOPC-21 ；BioLegends ；1: 500)对浓度为2.5xl06细胞/ml的细胞染色。对与细胞表面标记物，在含10% FCS的PBS中进行染色。对于细胞内蛋白质，在用 PBS 中的 4%多聚甲醒(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)固定的细胞上进行染色，并在含10% FCS和0.5%皂素(Sigma)的PBS中进行染色。使用LSRII流式细胞仪(BD)分析经染色的细胞。对于荧光激活细胞分�。褂肍ACSAriaTMII (BD)细胞分选仪(SickKids-UHN Flow Cytometry Facility, Toronto, ON, Canada)在 IMDM/6% FCS中分选浓度为IO6细胞/ml的细胞。为了避免由于压力和剪应力的细胞死亡，使用100微米喷嘴进行所有分选。用于磁珠分�。褂肕iltenyi MACS珠分选系统，并且根据制造商的指南和用于暗标记物的分选条件 进行实验。对于高通量流式细胞术分析，根据制造商的指南使用用于LSRII的BD高通量采样器(HTS)。使用Flowjo软件(Treestar，Ashland, OR,USA)分析数据。免疮染色如以前描述的13进行免疫染色，使用以下一抗:兔抗心肌钙蛋白I(Abcam ；I: 100)，小鼠抗SIRPA (BioLegends ；1: 100)。使用的二抗是:山羊抗小鼠IgGCy3(Jackson ImmunoResearch ；1: 400),驴抗小鼠 IgG_Alexa488(Invitrogen ;1: 400) ο使用DAPI复染细胞核。使用Mito Tracker Red(Invitrogen)对线粒体染色。使用荧光显微镜(Leica CTR6000)显像经染色的细胞，并使用Leica Application Suite软件捕获图像。定量实时PCR使用RNAq ueous-Micro试剂盒(Ambion)制备总RNA并用无RNA酶的DNA酶(Ambion)处理。使用随机六聚体和寡聚(dT)和Superscript III逆转录酶(Invitrogen)将 500ng 至 I μ g RNA 逆转录为 cDNA。如以前所描述的，在 MasterCyeler EPRealPlex (Eppendorf)上进行 QPCR,使用 QuantiFast SYBR Green PCR 试剂盒(Qiagen)13。将表达水平对持家基因TATA盒结合蛋白(TBP)标准化。除了 TBP以外，为了样品间的标准化，使用基因组DNA作为DNA标准物。可直接计算基因组DNA中存在的靶基因的拷贝数(人基因组大小、:2.7xl09bp( = 1.78xl012道尔顿)，对应6.022xl023拷贝的单拷贝基因；Iug基因组DNA对应3.4x10s拷贝的单拷贝基因)。RT-qPCR图的Y轴代表目的基因的拷贝数除以TBP的拷贝数，并因此代表了可在实验间比较的任意(arbitrary)但绝对的单位。人成人心脏总RNA 购自 Ambion,人总 RNA master panel 购自 Clontech。结果和讨论鉴定在源自hESC的心肌细胞上表达的新标记物当用合适浓度的激活素A和BMP4诱导时(图la)，HES2hESC细胞系有效和可重现地分化生成心血管谱系细胞2’3。分化培养物的动力学分析显示了从由BRACHYURY(T)表达定义的原始的条纹状群体(第2-4天)到早期中胚层的发育(MESP1 ;第3-4天)以及NKX2-5和ISLETl (LSLl)阳性心脏前体的出现(第4_8天)的步进式发育进程。在分化第9天和第12天之间首次检测到收缩的心肌细胞，这与MYH6 ( a MHC)，ΜΥΗ7 ( β MHC)和MYL7 (MLC2a)的上调和之后MYL2 (MLC2v)的表达一致(图1b)。源自hESC的群体中的某些心脏特异性基因的表达水平显著低于在胎儿和成人心脏组织中发现的水平。低水平的NEUR0D1和F0XA2表达指示，培养物没有污染大量源自神经外胚层或内胚层的细胞。为了能够实时监控心肌细胞发育，我们将上述方案应用于NKX2-5-GFP报导子hESC细胞系，其中含有插入在HES3hESC的NKX2-5基因座中的EGFP cDNA (Elliott等人，手稿已提交)。首先的NKX2-5-GFP+细胞出现在分化第7天和第8天之间。NKX2-5-GFP+群体的大小随时间增加，在第12和第20天之间达到最高(图8)。在表面荧光显微镜下对源自NKX2-5-GFP ESC的胚状体(EB)的分析证实了在大多数细胞中的核GFP表达。NKX2-5-GFP表达的动力学与HES2培养物中NKX2-5表达的开始紧密平行，指示来自两种hESC细胞系的心脏特化都发生在分化的第6天和第8天之间(图lb，图8)。在第20天的培养物中的高比例的NKX2-5-GFP+细胞证明，所使用的分化方案有效促使从此hESC细胞系生成心肌细胞。为了确定上述发育阶段是否可通过细胞表面标记物进行区分，我们进行了 370种已知抗体(http://data, microarrays.ca/Antibodyffeb)的筛�。褂么� GFP-NKX2-5 细胞系生成的第8、12和20天的群体。最初的筛选着重于鉴定识别存在于NKX2-5-GFP+群体上的抗原的抗体。从此筛选中，我们鉴定出信号调节蛋白a (SIRPA，又称SHPS-1，SIRPA)作为潜在的心脏特异性标记物，因为抗SIRPA抗体w对大多数NKX2-5-GFP+细胞染色且几乎不对阴性细胞染色(图2a)。在所分析的抗体组中，SIRPA是唯一展示此心肌细胞特异性表达图式的抗体。SIRPA首先在分化第8天出现的GFP-NKX2-5+细胞上被检测到，所述群体被认为代表了心脏前体发育阶段。贯穿实验的20天时间过程，在GFP-NKX2-5+群体上始终维持表达(图2a，图9a)。在未分化的hESC群体中或在特征为KDR和TOGFRA共表达的第5天的心脏中胚层群体中没有检测到SIRPA+细胞(图2a并且数据未显示)2。对从非遗传改造的HES2细 胞系生成的EB的分析显示了与抗SIRPA抗体类似的染色图式。最先在分化的第7-8天检测到SIRPA+细胞，并且在接下来的2-4天阳性细胞的百分比显著增加(图2b，图9b)。直接缀合的(SIRPA-PE-CY7)和生物素化(SIRPA_bio)的抗体对第20天的EB群体的类似部分染色(图lOa-e)。有趣的是，在第20天的EB中检测到的SIRPA+细胞似乎比SIRPA—群中发现的那些大得多(图1Of)，这表示可通过流式细胞术评估这些群体的细胞大小。为了验证SIRPA抗体的特异性，我们进行了蛋白质印迹分析和免疫沉淀后的蛋白质分析(图11)。这些实验证明SIRPA蛋白在3个独立的第20天的源自EB的群体中存在，但在未分化的hESC中不存在(图1la)。免疫沉淀分析显示了大小为与以前描述的SIRPA蛋白的大小的条带(图lib)11。通过流式细胞术的SIRPA和cTNT的共染色展示了两种标记物的清楚的共表达(图12a/b)，指示SIRPA在从非修饰的HES2细胞系生成的分化的群体中的心肌谱系上特异性表达。RT-qPCR分析显示了与流式细胞术抗体染色谱紧密类似的SIRPA的表达图式，在分化第6天和第8天之间具有SIRPA mRNA的上调，随后在42天时间过程中持续表达。⑶47 (SIRPA的配体)的表达与观察到的SIRPA表达平行(图2c)。⑶47的流式细胞分析反应了基因表达图式，在未分化的ES上和在第5天的分化培养物上显示低染色水平，随后在第8和第20天的整个群体上广泛染色(数据未显示)。源自第20天的EB的单层培养物的免疫荧光分析显示，SIRPA的表面表达仅在心肌细胞上，这是通过与心肌钙蛋白I(cTNI)的共表达表征的(图2d)。各个对照(IgG和仅有二抗)没有显示任何信号(数据未显示)。总而言之，这些动力学研究显示，SIRPA的表达唯一地标记了在hESC分化培养物中的心脏谱系，从出现NKX2-5+前体细胞开始，并贯穿收缩群体的发育和扩展而持 续。Hattori等人最近证明，基于线粒体含量(通过mito tracker染料的保留测量)来分离心肌细胞是可能的9。比较mito tracker染料的标记和SIRPA染色显示,2种程序标记了第20天的EB中的相同的心肌细胞群(图13c)。但是染料保留法在追踪心血管发育的开始中作用较�。蛭浣喜磺宄乇昙欠⒂牡�12天的群体，且在第8天几乎不标记细胞(图13a/b)。相反地,在这两个时点都可清楚解析到大量SIRPA+群,指示此表面标记物允许监控和分离来自心脏发育的不同阶段的细胞，而使用mito tracker染料的标记仅可用于包含相对成熟的心肌细胞的群体。相比人细胞，通过抗体染色在源自小鼠ESC的心肌细胞上检测不到Sirpa(图14a)。培养物中的Sirpa+群是心肌钙蛋白T(cTnT)阴性的和⑶45阳性的，指示它们代表造血细胞(图14a/b)。基因表达分析证实了流式细胞术的数据，并且相比在脑中的高表达，在源自mESC的心肌细胞以及成年小鼠心房和心室组织中仅显示了低水平的Sirpa mRNA(图14c) ο通过qPCR在任意这些组织中都无法检测到小鼠中唯一的其他已知的Sirp家族成员，Sirpb的表达(数据未显示)。对照和Sirpa缺陷的小鼠组织的蛋白质印迹分析证实了在对照小鼠脑中的高Sirpa表达，但在源自Sirpa缺陷的小鼠的任意组织中都没有表达(图14d)。最重要地，在来自对照小鼠的心脏、肾或源自mESC的心肌细胞中没有检测到Sirpa表达。小鼠和人的SIRPA功能和蛋白质同源性的差异先前已在有关巨噬细胞和红血球的相互作用的研究中进行了描述12。从源自hESC的群体中纯化心肌细胞为了评估SIRPA表面受体的表达是否可用于生成经富集的心肌细胞群，通过细胞分选从分化的第8、12和20天的源自HES2的EB中分离SIRPA阳性(SIRPA+)和SIRPA阴性(SIRPA_)级分，并通过细胞内流式细胞术分析心肌钙蛋白T(cTNT)的表达(图3a)。对分选前(未分选的，PS)群体的分析证明，cTNT表达与对应的分化阶段(PS:d8, dl2，d20)的SIRPA表达紧密平行。分选后，来自每个阶段的SIRPA+级分高度富集了 cTNT+心肌细胞，而SIRPA—组分去除了这些细胞。尚不清楚在SIRPA—组分中存在的少量cTNT+细胞是来自分选程序的污染物还是代表真实的SIRPA阴性心肌细胞。在多个实验中，基于FACS的分离可重现地产生显著富集的心肌细胞群(SIRPA+:第8天(95.2% ±1.9)，第12天(94.4%±1.7)，第 20 天(89.6% ±3.6) ;SIRP、第 8 天(13.0% ±2.1)，第 12 天(14.3% ±3.9)，第20天(15.7% ±6.0))(图3b)。在图15和图20 (表I)中总结了 SIRPA+和SIRPA_分选的群体的纯度和从分选程序回收细胞的效率。分子分析显示，SIRPA+细胞比SIRPA_群体表达显著更高水平的NKX2-5，MYH6，MYH7和MYL7(图3c)，这进一步证明心肌细胞的富集。不出所料，SIRPA表达局限于SIRPA+群。与心脏标记物形成对照，非肌细胞标记物例如成纤维细胞标记物DDR2和THYl (⑶90，数据未显示)和内皮细胞标记物PECAM (⑶31)在SIRPA—群中以较高水平表达(图3c)。当平铺为单层培养物时，来自SIRPA—和SIRPA+级分的细胞都形成活细胞群，这些细胞群可容易地维持数周。在未分选(PS)和源自SIRPA+的群体中检测到收缩的细胞，但在从SIRPA—细胞生成的群体中没有检测到。免疫组化分析显示了在SIRPA+群中的广泛的cTNI表达，证实在这些培养物中高比例的心肌细胞。在SIRPA_群中仅检测到很少cTNI阳性细胞(图3d)。如从SIRPA和NKX2-5-GFP的共表达所预料，也可以通过使用抗SIRPA抗体的分�。釉醋訬KX2-5-GFP HES3的培养物中分离富集了心脏谱系细胞的群体。通过基因表达和cTNT染色定义的心脏前体(第8天)和心肌细胞(第12和20天)局限于SIRPA+组分，而非肌细胞在SIRPA—群体中富集(图16)。为了能够快速处理大量细胞，我们也尝试了通过磁珠分选分离SIRPA细胞。通过此方法从NKX2-5-GFP分化培养物中分离SIRPA+细胞得到与FACS实验得到的类似的、高度富集了心肌细胞的群体(图17a-c)。然而，使用现有的磁珠分选方案在分选过程中丢失了大量细胞，导致此方法与FACS相比较低的效率(比较图17d至图20(表I))。总之，来自这些细胞分选研究的结果明确证明SIRPA表达标记了源自hESC的分化培养物中的心脏谱系，并 且使用抗SIRPA抗体的细胞分选允许分离高度富集了心肌细胞的群体。从人诱导多能干细胞纯化心肌细胞为了确定SIRPA表达是否标记在其他源自hPSC的细胞群中的心脏谱系，我们接下来分析了从2种不同的hiPSC细胞系，MSC-1PSl (又称Y2-1)和38-2生成的EB13a4t^B cTNT+细胞的比例(MSC-1PSl:12.2% ±5.6,38-2:26.7% ±5.7;图4a)所证明的，2种细胞系的心脏分化效率低。在2种EB群体中检测到类似的低水平的SIRPA表达。从2种iPSC细胞系的SIRPA+细胞的FACS产生显著富集了 cTNT+心肌细胞的群体(SIRPA+:MSC_iPSl (67.0%±3.6) ,38-2(71.4% ±3.8) ；SIRPA_:MSC-1PSl (4.9% ±2.1) ,38-2 (6.2% ±0.9))(图 4a，b)。这些SIRPA+群比对应的SIRPA_细胞表达显著更高水平的NKX2-5，MYH6，MYH7, MYL2和MYL7。如在源自hESC的细胞中所观察到的，非肌细胞标记物(包括DDR2，PDGFRB, THYl和NEUR0D)局限于SIRPA_组分(图4b，c和未显示的数据)。这些数据明确记载，此标记物用于从多种多能干细胞系(包括用现有方案不能有效分化为心脏谱系的多能干细胞系)生成富集的心肌细胞群的效用。在人胎儿和成人心脏细胞中的SIRPA表达为了确定SIRPA是否在原代人心肌细胞上表达，我们接下来通过RT-qPCR分析了胎儿(妊娠18-20周)和成人心脏组织中的表达图式。如在图5a中所示，在所有胎儿来源的心脏组织中(左(LA)和右心房(RA)细胞，左(LV)和右心室(RV)细胞，心尖(AP)和房室交界区(AVJ))检测到SIRPA转录物，水平与在第20天的源自hESC的细胞中发现的水平可比较(图3a)。SIRPA在未分化的hESC(dO)或对照HEK(人胚胎肾)细胞中不表达。与胎儿心脏结果类似，在成人心脏中也检测到SIRPA表达，表明其表达标记人心脏发育的不同阶段的心肌细胞。在成年人脑和肺中检测到高水平的SIRPA (图18a)，在许多其他组织中发现低水平表达。这些低水平可能反映了已知表达此受体的组织巨噬细胞的存在15’16。SIRPA配体，⑶47，在大多数组织中表达，证实了在以前的研究中描述的表达图式(图18b)15。免疫荧光染色显示，SIRPA定位于胎儿心室细胞表面的膜上，但不存在于其他膜组分(例如线粒体膜)上，这是由缺乏与Mito Tracker Red的共染色所指示的(图5b)。流式细胞分析显示在所有胎儿心脏组织中的高比例的SIRPA+细胞，其水平与在各个组分中cTNT+细胞的百分比相关联(图5c，d)。这些结果明确证明，SIRPA在胎儿心肌细胞上以及成人心脏中表达，说明其心脏特异性表达不是源自多能干细胞的培养物的假象。俥用SIRPA表汰来监控hPS C分化的效率最近，我们报导了 KDR和TOGFRA的共表达提供了监控在用BMP4和激活素A处理后的心脏中胚层诱导的可靠方法2 (图6a)。尽管此研究显示KDR+PDGFRA+群体的诱导是生成心肌细胞群的基本的第一步,并非所有的KDR+PDGFRA+群体分化生成心脏谱系细胞(此类群体的实例:用30ng/ml BMP4和无外源激活素A(AO)诱导)。为了确定SIRPA是否将更准确地在早期阶段预测分化群体的心脏潜能，我们监控了用不同浓度的激活素A和BMP4诱导的第9天的EB中的SIRPA表达(图6b)。对相同的群体评估了第5天的KDR和TOGFRA的表达(图6a)和第20天的cTNT的表达(图6c)。尽管第5天的KDR+PDGFRA+群体的大小和第20天的cTNT+细胞的比例之间相关性很少，在第9天具有最大的SIRPA群体的培养物(激活素A6ng/ml，BMP4 10ng/ml)在较晚的时点含有最高数量的cTNT+细胞。对于检测的大多数条件，SIRPA表达与cTNT输出相关性良好，并且SIRPA的最高水平预测了第20天最高的心肌细胞发育(图6d)。这些数据证明，第9天的SIRPA表达是心肌细胞潜能的可靠指示物，因此可用于监控和优化将hPSC定向分化为心脏谱系的诱导方案。通过去除非肌细胞谱系细胞富集源自hPSC的心肌细胞除了识别心肌细胞的抗体，我们的流式细胞筛选也鉴定出标记分化培养物中非肌细胞群的抗体组。此组抗体，包括抗⑶90 (THY1，在成纤维细胞上表达)，抗^31 (PECAM1，在内皮细胞上表达)，抗⑶140B(PDGFRB，在平滑肌细胞上表达)和抗⑶49A(整联蛋白1A)，它们都识别第20天的源自HES2的EB的SIRPA-群体的不同部分(图7a/d)。这些抗体的组合标记了培养物中多数非肌细胞(SIRPA—)(图7c，分选前)。为了确定是否可以通过去除表达非肌细胞标记物的细胞来富集心肌细胞，我们将这些抗体组合并将第20天的EB分选为谱系阳性(LIN+)和谱系阴性(LIN_)级分(图7b)。此方法在生成不含任何结合抗体或磁珠的富集的群体中有优势。不出所料，LIN—群体显著富集了 SIRPA+细胞，而LIN+群体去除了心肌细胞(图7c/e)。在图21 (表2)中总结了在LIN—和 LIN+细胞的FACS后的细胞回收效率。基因表达分析显示，非肌细胞特异性基因(包括PECAMl，H)GFRB，THYl和DDR2)主要在LIN+级分中表达，而心脏基因表达被限制于LIN_级分(图7f)。当平铺在明胶包被的平皿或重新聚集为细胞簇时，LIN_级分生成含有高比例收缩心肌细胞的群体(数据未显示)。抗体的相同谱系混合物也标记了源自iPSC (MSC-1PSl)的第20天EB群体的非肌细胞(SIRPA-)级分(图19)，指示此去除方法可应用于具有不同分化效率的不同PSC细胞系。总之，这些数据说明通过去除非肌细胞谱系，可以从源自hPSC的分化培养物中富集心肌细胞。此方法因此代表了获得高度纯化的心肌细胞培养物的备选方法，并可就此而言用于需要不含任何结合抗体的纯化的心肌细胞群的策略。我们对调节谱系特化的信号传递途经的理解的增加已导致将hPSC有效和可重现地定向分化为特定细胞类型的策略^有关心脏谱系发育，已建立了促进混合的心血管群体生成的方案，所述心血管群体代表在人心脏中发现的主要细胞类型，包括心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞。取决于使用的PSC细胞系，心肌细胞通常占此类混合群体的10%和70%之间2’3。尽管已使用此类混合群体证明了源自PSC的细胞用于预测性毒理学5，体外建模人类疾病17’18和心脏疾病的基于移植的疗法19的潜在效用，最终将需要高度富集和良好定义的细胞群将此潜力转化为实际应用。我们现在将SIRPA鉴定为心肌细胞特异性标记物，首次使得能够从hESC和hiPSC中简单和常规地获得高度富集的心肌细胞群。这些心肌细胞富集的群体可通过FACS或磁珠分选分离，后一种方法使得能够分离用于体内研究所需的大量细胞。通过简单的分选方法获得高度富集的心肌细胞群将使得能够开发确定的高通量药物发现和毒理学测定，详细表型评估从患者特异性hPSC生成的细胞，和生成安全用于移植的确定的细胞群。SIRPA在从最早的心脏阶段到收缩的和更成熟的心肌细胞的心脏谱系细胞上都表达的事实将允许比较不同群体的体内潜能。除了 SIRPA以外，我们的筛选还鉴定出确定源自PSC的心血管群体的非肌细胞级分的标记物组。使用的标记物表明，它们代表成纤维细胞(CD90，THY1)2°，血管平滑肌细胞(⑶140B，TOGFRB)21和内皮细胞(⑶31，PECAM1)的组合。将允许获得这些细胞类型各自的富集的群体和心肌细胞的富集的群体。源自PSC的心肌细胞的许多提议的应用可能需要三维改造的组织以更准确地反映在成年心脏中的药物应`答和功能。最近的研究指出，需要将心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的适当的组合掺入到此类组织构建体中，以使其在体外或体内发挥最佳功能22_24。我们能够生成纯的肌细胞和非肌细胞群，这将允许生成由不同比例的不同细胞类型组成的改造的构建体，使我们能够确定形成具有最类似于人心脏的结构和功能性质的心脏组织所需的每种细胞类型的最佳比例。SIRPA在源自PSC的细胞群和在胎儿心脏组织中的特异性表达图式表明，此受体在人心肌细胞谱系中起一定的功能作用，也许早在发育的前体阶段就开始起作用。配体⑶47的表达与EB中的SIRPA平行地上调和在培养物中的大部分细胞上发现⑶47的事实进一步支持此解释，即此配体/受体对在人心肌细胞发育和/或功能中起作用。SIRPA的一个充分研究的作用是在巨噬细胞中，其中其似乎介导了从体内去除不表达配体CD47的细胞的信号16。在人细胞中提出的唯一的其他功能是在平滑肌谱系中，其中已显示SIRPA在介导IGF-1诱导的促有丝分裂的信号传递中起重要作用25。考虑到在小鼠心肌细胞中检测不到SIRPA，其在人细胞中的功能可能涉及2种物种间不同的心肌细胞生理学和/或功能方面。总之，本文报导的发现证明，SIRPA的表达唯一地标记PSC分化培养物中的心肌细胞谱系。通过FACS或磁珠分选分离SIRPA+细胞提供了从多种PSC系生成高度富集的心肌细胞群的简单方法，所述PSC系包括使用现有方案不能有效分化为心血管谱系的PSC系。尽管本文已描述了本发明的优选实施方案，本领域技术人员将理解，可对本发明进行修改而不背离本发明的精神或随附的权利要求的范围。在此说明书中的所有参考，包括在以下参考文献中的参考，在此引入作为参考。参考文献IMurry， C.E.&Keller， G.Differentiation of embryonic stem cells toclinically relevant populations:lessons from embryonic development.Cell 132，661-680， (2008).
2Kattman, S.J.等人 Stage-specific optimization of activin/nodal and BMPsignaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stemcell lines.Cell Stem Cell 8，228-240，(2011).
3Yang， L 等人 Human cardiovascular progenitor cells develop from aKDR+embryonic-stem-cell-derived population.Nature 453,524-528，(2008).
4Zwi，L 等人Cardiomyocyte differentiation of human induced pluripotentstem cells.Circulation 120，1513-1523，(2009).
5Braam，S.R.，Passier, R.&Mummery，C.L.Cardiomyocytes from humanpluripotent stem cells in regenerative medicine and drug discovery.TrendsPharmacol Sci 30，536-545，(2009).
6Anderson, D.等人 Transgenic enrichment of cardiomyocytes from humanembryonic stem cells.Mol Ther 15，2027-2036，(2007).
7Huber，1.等人 Identification and selection of cardiomyocytes duringhuman embryonic stem cell differentiation.FASEB J 21,2551-2563，(2007).Ritner, C.等人Anengineered cardiac reporter cell line identifies human embryonic stemcell-derived myocardial precursors.PLoS One 6，el6004，(2011).
Hattori, F.等人 Nongenetic method for purifying stem cell-derivedcardiomyocytes.Nat Methods 7，61-66，(2010).
Seiffert，M.等人 Signal-regulatory protein alpha (SIRPalpha) but notSIRPbeta is involved in T-cell activation,binds to CD47 with high affinity,andis expressed on immature CD34(+)CD38(-)hematopoietic cells.Blood 97,2741-2749，(2001).
Timms, J.F.等人 SHPS-1 is a scaffold for assembling distinctadhesion-regulated mult1-protein complexes in macrophages.Curr Biol 9,927-930,(1999).
Subramanian，S.，Parthasarathy，R.，Sen，S.，Boder, E.T.&Discher,
D.E.Species—and cell type-specific interactions between CD47 and humanSIRPalpha.Blood 107,2548-2556，(2006).
Nostro,M.C.等人Stage-specific signaling through TGFbeta family membersand WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotentstem cells.Development 138,861-871, (2011).
Park, 1.H.等人Reprogramming of human somatic ceus to pluripotency withdefined factors.Nature 451，141-146，(2008).
Matozaki, T.，Murata，Y.，Okazawa, H.&Ohnishi，H.Functions and molecularmechanisms of the CD47_SIRPalpha sigualling pathway.Trends Cell Biol 19,72-80,(2009).
Okazawa, H.等人 Negative regulation of phagocytosis in macrophages bythe CD47-SHPS-lsystem.JImmunol 174，2004-2011，(2005).
Carvajal-Vergara, X.等人 Patient-specific induced pluripotentstem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.Nature465，808-812，(2010).
Itzhaki, 1.等人Modelling the long QT syndrome with induced pluripotentstem cells.Nature 471，225-229，(2011).
Laflamme, M.A.等 A Cardiomyocytes derived from human embryonic stemcells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.NatBiotechnol 25,1015-1024， (2007).
Kisselbach，L，Merges, M.，Bossie，A.& Boyd, A.CD90 Expression on humanprimary cells and elimination of contaminating fibroblasts from cell culturres.Cytotechnolog y59，31-44， (2009).
Ross, R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the1990s.Nature 362，801-809，(1993).
Stevens, K.R.等人 Physiological function and transplantation ofseaffold-free and vascu larized human cardiac musele tissue.Proc Natl AcadSciUSA 106,16568-16573， (2009).
Dvir, T.等人Prevascularization of cardiac patch on the omentum improvesits therapeutic outcome.Proc Natl Acad Sci USA 106，14990-14995，(2009).
Lesman,A.等人Transplantation of a tissue-engineered human vaseularizedcardiac musele.Tissue Eng PartA 16，115-125，(2010).
Ling，Y.，Maile，L A.，Lieskovska, J.，Badley-Clarke，J.&Clemmons, D.R.Roleof SHPS-1 in the regulation of insulin-like growth factor I—stimulated She andmitogen-activated protein kinase activation in vascular smooth muscle cells.MolBiol Cell 16，3353-3364， (2005).
Kennedy, M.，D ' Souza, S.L.，Lynch-Kattman，M.，Schwantz, S.&Keller，G.Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in humanES cell differentiation eultures.Blood 109，2679-2687，(2007).
Costa,M.等人A method for genetic modification of human embryonic stemcells using electroporation.Nat Protoc 2,792-796，(2007).
Sharma，P.，Shathasivam，T.，Ignatchenko，V.，Kislinger, T.&Gramolini，A.0.1dentification of an FHLl protein complex containing ACTNl，ACTN4，andPDLIMl using affinity purifications and MS-based protein-protein interactionanalysis.Mol Biosyst 7，1185-1196，(2011).
Seiffert，Μ.等人 Hu man signal-regulatory protein is expressed onnormal， but not on subsets of leukemic myeloid cells and mediates cellularadhesion involving i ts eounterreeeptor CD47.Blood 94,3633-3643，(1999).
权利要求
1.富集细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，所述方法包括: (a)提供细胞群，待从所述细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞；和 (b)从群中分离表达SIRPA的细胞； 其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞和心肌祖细胞的人多能干细胞群。
2.权利要求1的方法，其中人多能干细胞为胚胎干细胞。
3.权利要求1的方法，其中人多能干细胞为诱导多能干细胞。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中将人多能干细胞暴露于一定量的至少一种有效诱导细胞分化的诱导剂。
5.权利要求4的方法，其中基于群中的SIRPA浓度优化至少一种诱导剂的量。
6.权利要求4和5中任一项的方法，其中至少一种诱导剂包含细胞因子。
7.权利要求4-6中任一项的方法，其中至少一种诱导剂包含激活素A，优选地所述激活素A浓度为至多40ng/ml,更优选地所述激活素A浓度为约6ng/ml或约30ng/ml。
8.权利要求4-7中任一项的方法，其中至少一种诱导剂包含骨形态发生蛋白4，优选地所述骨形态发生蛋白4浓度为至多40ng/ml，更优选地所述骨形态发生蛋白4浓度为约10ng/mlο
9.权利要求4-8中任一项的方法，其中还将人多能干细胞暴露于骨形态发生蛋白抑制剂。
10.权利要求9的方法,其中骨形态发生蛋白抑制剂选自由Dorsomorphin、Noggin和可溶性骨形态发生蛋白受体所组成的组。
11.权利要求4-10中任一项的方法，其中还将人多能干细胞暴露于VEGF、DKK和bFGF中的至少一种。
12.权利要求4-11中任一项的方法，其中将人多能干细胞暴露于诱导剂介于约I天和约5天之间，优选地约3天。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中在开始诱导人多能干细胞和分离表达SIRPA的细胞之间的时间为介于约5天和约45天之间，优选地介于约8天和约25天之间。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中在细胞开始表达SIRPA后分离表达SIRPA的细胞，所述细胞开始表达SIRPA出现在细胞开始表达Nkx2.5的时间附近。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中在细胞开始表达Nkx2.5的时间和细胞开始收缩和表达心脏特异性结构蛋白的时间之间分离具有SIRPA细胞表面抗原的细胞。
16.权利要求1-15中任一项的方法，还包括从群体中去除表达⑶90，⑶31，⑶140B和⑶49A中的至少一种的细胞。
17.权利要求16的方法，其中使用相应的抗体去除表达⑶90，⑶31，⑶140B和⑶49A中的一种的细胞。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中使用SIRPA特异性配体分离表达SIRPA的细胞。
19.权利要求18的方法，其中使用抗SIRPA抗体或抗体片段，或抗体样分子，优选抗SIRPA抗体分离表达SIRPA的细胞。
20.权利要求18或19的方法，其中使用磁珠分离表达SIRPA的细胞。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中使用流式细胞术分离表达SIRPA的细胞。
22.权利要求1-17中任一项的方法，其中群体中的细胞包含与SIRPA基因座的调节控制元件有效连接的报告基因，其中报告基因在表达SIRPA的细胞中表达，并且分离表达SIRPA的细胞的步骤包括分离表达报告基因的细胞。
23.权利要求22的方法，其中报告基因赋予对细胞毒性剂的抗性。
24.权利要求22的方法，其中报告基因是细胞表面标签。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中经富集的细胞群包含至少60%，优选至少90 %，更优选98 %的心肌细胞和心肌祖细胞。
26.使用权利要求1-24中任一种的方法得到的经富集的心肌细胞和心肌祖细胞的细胞群。
27.富集了心肌细胞和心肌祖细胞的分离的细胞群，其中细胞群包含至少60%，优选至少90%，更优选98%的心肌细胞和心肌祖细胞。
28.SIRPA用于从细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞的用途，其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞和心肌祖细胞的人多能干细胞群。
29.去除细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，所述方法包括: (a)提供细胞群，待从所述细胞群中去除心肌细胞和心肌祖细胞；和 (b)从群体中去除表达SIRPA的细胞； 其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞、心肌祖细胞和非心肌细胞的人多能干细胞 群。
30.富集细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，所述方法包括: (a)提供细胞群，待从所述细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞；和 (b)从群体中去除表达⑶90，⑶31，⑶140B和⑶49A中的至少一种的细胞； 其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞、心肌祖细胞和非心肌细胞的人多能干细胞群。
全文摘要
本发明涉及基于SIRPA表达富集多能干细胞来源的心肌祖细胞和心肌细胞的方法。
文档编号G01N33/567GK103189502SQ201180051991
公开日2013年7月3日 申请日期2011年8月26日 优先权日2010年8月27日
发明者G·凯勒, A·M·克拉夫特, N·C·杜博伊斯 申请人:大学健康网络
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
