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专利名称：乙型肝炎病毒前s1与前s2联合检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂技术领域。具体涉及乙型肝炎病毒前Sl (preSl)抗原 和前S2 (preS2)抗原酶联免疫联合检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肝脏是维持生命的重要器官之一，肝脏受损的最重要因素之一是病毒感染。 至今，已经鉴定出甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒等五种不同类型的受 损肝脏的肝炎病毒。其中，由于乙肝病毒(HBV)破坏肝细胞而发展成慢性肝 炎以及持续的病毒复制会导致肝硬化的可能性一直被人们广泛研究。
乙型肝炎病毒(HBV)是一环状的部分双螺旋结构,长约3.2kb。 HBV基因 组编码HBV抗原，所有四个功能性读码框架位于DNA负链，P基因编码DNA 聚合酶。C基因编码HbcAg。 S基因编码S抗原，前S1抗原和前S2抗原。X基 因编码X产物。在S基因前面的两个小ORFs (开放阅读框open reading frame) 与S基因ORF属于同一个读框，可以将ORFS通读下去，编码两种S蛋白相关 的抗原，这两种抗原也存在于病毒颗粒的表面，这两个抗原分别称为前-Sl(pre-Sl) 和前一S2(pre-S2)。同样，在ORFC前面也有一短的ORF，称为前一C(pre-C)， 编码一较大的C蛋白相关抗原。所有这些ORF都在负链DNA (长链)上，其中 S基因完全重叠于聚合酶基因中，X基因与聚合酶基因、C基因重叠，C基因与 聚合酶也有重叠。
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是一组构成病毒外膜的蛋白，其重要功能之 一是识别肝细胞膜上的受体，使病毒与细胞接触，然后侵入胞内进行复制。HBsAg含有大、中，小3种分子形式蛋白质、它们都由病毒基因的S-开放阅读框 架(S-0RF)所编码。其中小分子蛋白(SHBs)即主蛋白由226个氨基酸组成，中蛋 白(MHBs)是在主蛋白N端加上55个氨基酸的preS2区，大分子蛋白(LHBs)根据 病毒的亚型不同在中蛋白的N端前面再加上由108或119个氨基酸组成的preSl 区，这3种蛋白分子都存在糖基化和非糖基化的形式。从血清中分离得到不同形 态的病毒颗粒表面，SHBs含量最高，但MHBs和LHBs含量各异，在22 nm球形空 壳颗粒中，LHBs含量极低，而含DNA的完整的病毒颗粒中LHBs的含量可达20%。
HBV—DNA检测通常被作为HBV感染及复制的金标准，可用PCR方法测定 HBV-DNA，但PCR方法操作要求高、成本高、需要较高的实验条件，在许多基层医 疗单位尚不能开展而使其应用受限。传统认为在检测血清中乙肝"两对半"指标 中，HBeAg转阴表示HBV复制的停止，但在HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者中，若 前c区发生终止密码子突变时，或当位于x读码区的c启动子发生突变时，HBeAg 表达就会终止或减少，导致HBeAg合成障碍，HBeAg呈阴性，但HBVDNA仍为阳性， 病毒复制并未受到影响，说明HBeAg阴性并不能作为HBV复制终止理想的判断依 据，因此探索新的判定HBV复制的免疫血清学指标已成为目前的研究热点之一。
前S1抗原(Pre-SlAg)的临床意义和用途1、反映HBV的感染与复制状况的 指标，很多文献报道(刘拓等，乙型肝炎病毒前S1蛋白检测及临床意义，宁夏医学 杂志，2006, 28:204-205)(乐爱平等，HBVpreS1-Ag、 HBV-DNA、 HBVM的相关性分析 及其意义，江西医学院学报，2004， 44: 27-30)前Sl抗原可作为HbeAg和HBV-DNA 检测的补充和对照，可弥补因病毒变异和其它原因造成的HBeAg (-)的"误寻"。 2、应用于预后及药物疗效的判断，急性乙型肝炎患者前S1抗原阴转越早，预后 越好，是病毒清除的最早迹象，反之，前S1抗原持续阳性，将发展至慢性肝炎， 因病毒基因变异的HBeAb(+)慢性乙型肝炎病人，较易进展为肝硬化，甚至肝癌。 加强检测前S1抗原，是一种检测疾病预后的良好手段。3、早期诊断乙型肝炎病毒的感染，前S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的最早期，在转氨酶升高前即可査
出，提示可作为早期诊断乙肝病毒感染。在体检和献血员中加査前si抗原，可起
来疾病的早期诊断和尽早切断传染原的重要作用。
前S2抗原(Pre-S2)上有多聚人血清白蛋白的结合位点，参与HBV感染肝细 胞的过程，在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起着重要的作用。文献报道也可将 Pre-S2作为HbsAg无症状携带者有无传染性的一项特异而敏感的观察指标。(俞 树高等，HbsAg无症状携带者血清HBV DNA与PreS2关系初探，福建医学院学报， 1992， 26: 290-292)。
乙型肝炎前S1、前S2抗原不仅仅是HBV感染的新标志，还可作为病毒复制和 急慢性乙肝的预后判断的指标，HBVPreSl-Ag、 PreS2-Ag的连续监测也是免疫清 除HBV、抗病毒治疗及疾病预后的良好观察指标。

发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种能同时检测 前S1抗原和前S2抗原的试剂盒。
本发明提供了一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒。
试剂盒中各组成成分包括抗体包被反应条48或96孔、酶标记抗体工作液 1瓶(3.5ml或7ml)、阳性对照液1支(0.5ml或lml)、阴性对照液1支(0.5ml 或lml)、 20倍浓縮洗涤液1瓶(10ml或24ml)、底物显色A液1瓶(3.5ml或 7ml)、底物显色B液1瓶(3.5ml或7ml)和终止液1瓶(3.5ml或7ml)。
阳性对照制备HbeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者的血清。
阴性对照的制备正常人血清。
底物显色A液Na2HP0412H20 (1.7 g/100 ml)、柠檬酸(0.5 g/100 ml)、 3%H202 (200ul細ml)。底物显色B液Na2HP0412H20 (1.7 g/100ml)、柠檬酸(0.5 g/100ml)、 四甲基联苯胺(0.15 g/100 ml)。 终止液2mol/LH2S04
20倍浓縮洗涤液Na2HP0412H20 (2.6 g/100 ml)、 NaH2P042H20 (0.4 g/100 ml)、 20%Tween-20 (2.5 ml/100 ml)。
酶标记抗体工作液Na2HP0412H20 (1.86g/L)、 KH2P04 2H20 (0.22g/L)、 NaCl (9g/L)、牛血清白蛋白(10g/L)及按合适浓度稀释好的酶标记抗体。
抗体包被反应条包被抗体以I-IO ug/ml加入到配制好的碳酸盐缓冲液 (Na2C03: 1.6g/L、 Na2HC03: 2.93 g/L)中，然后以IOOul/孔加入到微孔板中， 置4'C湿盒中静置过夜甩干。
本发明的另一目的是提供了上述乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒 的制备方法。
(1) :釆用基因重组的HbsAg制备HbsAb包被抗体或酶标记抗体；
(2) :采用基因重组的preSl Ag、前S2多肽制备抗前S1、前S2包被抗体 或酶标记抗体；
(3) :抗血清或腹水用硫酸铵沉淀、亲和层析柱(ProteinA/G)或离子交换 层析法(DEAE-Sepharose)纯化得到纯抗体；
(4) :制备预包被板抗体做包被、加入包被液、加入反应板、4'C湿盒 放置过夜、拍干、封闭、干燥、装袋；
(5) :制备酶标记物酶标记抗体以合适的浓度加入酶标稀释液中。
(6) :将试剂盒中其余成分阴性对照、阳性对照、底物显色A液、底物 显色B液、终止液和浓縮洗涤液分装在小瓶中。
所述底物显色A液为Na2HP0412H20、柠檬酸、3% H202和重蒸水pH5.0。 所述底物显色B液为Na2HP0412H20、柠檬酸、3% H202 、 TMB (四甲
7基联苯胺)和重蒸水pH5.0。 所述终止液为浓H2S04和重蒸水。
所述IO倍浓縮洗涤液Na2HP0412H20、 NaH2P042H20、 20% Tween-20和重蒸水。
本发明的效果
1、 在样品中联合检测(包括合并检测和分开检测，以及同时检测和以任何 顺序先后检测，优选同时、合并检测)乙型肝炎病毒前S1抗原与前S2抗原。
2、 在相同反应容器(如反应孔)中在相同的反应中同时检测乙型肝炎病毒 前S1与前S2抗原。
3、 样品为来自待检个体的分离的生物学样品，如血清等。
4、 包被抗体是抗HbsAg单抗，则酶标记结合物是抗前S1、前S2混合抗体， 若包被抗体是抗前S1、前S2混合抗体，则酶标记结合物是抗HbsAg单抗。
具体实施例方式
实施例1制备联合检测乙型肝炎病毒前Sl与前S2酶免试剂盒的生产步骤 (一)抗体制备
1. 制备HBsAb单抗:基因重组的HbsAg加福氏佐剂免疫Balb/C小鼠， 得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆细 胞株，打腹水得抗体，先硫酸铵沉淀后用亲和层析柱纯化。
2. 制备前S1抗体基因重组的preSlAg (l-119aa)加福氏佐剂免疫兔 子，加等体积的饱和(NH4)2S04沉淀，粗提后再用离子交换层析纯化。
3. 制备前S2抗体合成前S2多肽(l-55aa)加福氏佐剂免疫兔子，加 等体积的饱和(NH4)2S04沉淀，粗提后再用离子交换层析纯化。
8(二) 制备酶标记物
纯化的HBAb单抗或前Sl、前S2混合抗体，用简易过碘酸钠法与辣根 过氧化物酶(HRP)偶联。
(1) 称取5mgHRP溶解于lml蒸馏水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M Nal04溶液，室温下避光搅拌 20分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对lmM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析， 4'C过夜。
(4) 加20 ul 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高 到9.0 9.5，然后立即加入10mg IgG在lml 0.01M碳酸盐缓冲液中， 室温避光轻轻搅拌2小时。
(5) 加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4。C2小时。
(6) 将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4"C过夜。
(7) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4'C1小时。
(8) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次， 最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。
(9) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析， 透析完全后，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分 装后，-20。C分装保存。
(三) 抗体选择模式
包被抗体是抗HbsAg单抗，则酶标记结合物是抗前S1、前S2混合抗体， 若包被抗体是抗前S1、前S2混合抗体，则酶标记结合物是抗HbsAg单 抗。实施例2 试剂盒的配制(一)预包被抗体板的制备
1. 包被
包被抗体以l-10ug/ml加入到配制好的碳酸盐缓冲液(pH: 9.0-9.5)中，然后以100ul/孔加入到微孔板中，置4'C湿盒中静置过夜甩干。
2. 封闭
在包被板条中，加入200ul/孔的封闭液，37'C封闭2小时，甩干，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋中，封口，在4'C中保存。
3. 酶标记物酶标记抗体以合适的浓度(1: 1000)加入酶标稀释液中。
4. 阳性对照制备HbeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者的血清，60'C放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定OD值〉0.5，分装。
5. 阴性对照的制备用本试剂盒测定正常人血清OD值在0-0.05之间，分装。
6. 底物显色A液
Na2HP0412H20 1.7 g柠檬酸 0.5 g
3% H202 200 ul
重蒸水 100 ml
调整pH: 5.0
7. 底物显色B液
Na2HP0412H20 1.7 g柠檬酸 0.5 g
重蒸水 100 ml
调整pH至5.0后，加入10mlDMO含60mgTMB (四甲基联苯胺)的溶液25ul。
108. 终止液
浓恥04 11 ml
重蒸水 89 ml
9. IO倍浓縮洗涤液Na2HP0412H20 2.6 gNaH2P04 2H20 0.4 g20% Tween-20 2.5 ml重蒸水 100 ml调整pH: 7.20
实施例3 试剂盒使用
1、 取所需量的板条，每孔加入100ul样品。各板设阳性对照2孔(100ul)、阴性对照2孔(lOOul)，以及空白对照孔l孔(蒸馏水100ul)， 37-C温育30分钟；
2、 洗板甩干板中液体，加入400 ul/孔洗涤液，放置30秒甩干，如此重复洗五次；
3、 除空白对照孔以外，各孔加入100ul/孔的酶标记抗体，37'C温育30分钟；
4、 洗板甩干板中液体，加入400ul/孔洗涤液，放置30秒甩干，如此重复洗五次；
5、 加底物，50 ul/ LTMB显色A液，50 ul/孔TMB显色B液，混匀，37°C温育15分钟；
6、 加50ul/孔终止液，置酶标仪中450nm波长下，测定读数。
权利要求
1、一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒，其特征在于它包括抗体包被反应条、酶标记抗体、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、底物显色A液、底物显色B液和终止液。
2、 根据权利要求1所述的抗体包被反应条为48或96孔；酶标记抗体工作液1瓶3.5ml或7ml;阳性对照液1支0.5ml或lml、阴性对照液1支0.5ml或lml、 20倍浓縮洗涤液1瓶10ml或24ml、底物显色A液1瓶3.5ml或7ml、底物显色B液1瓶3.5ml或7ml和终止液1瓶3.5ml或7ml。
3、 一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1 ):采用基因重组的HbsAg制备HbsAb包被抗体或酶标记抗体；(2) :采用基因重组的preSl Ag、前S2多肽制备抗前S1、前S2包被抗体或酶标记抗体；(3) :抗血清或腹水用硫酸铵沉淀、亲和层析柱或离子交换层析法纯化得到纯抗体；(4) :制备预包被板抗体做包被、加入包被液、加入反应板、4'C湿盒放置过夜、拍干、封闭、干燥、装袋；(5) :制备酶标记物酶标记抗体以合适的浓度加入酶标稀释液中；(6) :将试剂盒中其余成分阴性对照、阳性对照、底物显色A液、底物显色B液、终止液和浓縮洗涤液分装在小瓶中。
4、 根据权利要求3所述的一种乙型肝炎病毒前Sl与前S2联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于步骤(6)所述底物显色A液为Na2HP0412H20、柠檬酸、3% H202和重蒸水pH5.0;所述底物显色B液为Na2HP0412H20柠檬酸、3%H202 、 TMB (四甲基联苯胺)和重蒸水pH5.0;所述终止液为浓H2S04和重蒸水；所述10倍浓縮洗涤液为Na2HP0412H20 、2Qn/oTween-20和重蒸水。
全文摘要
本发明提供了一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒。包括包被反应条(48或96孔)、酶标记抗体、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、底物显色A液、底物显色B液和终止液。本发明的试剂盒能同时检测前S1抗原和前S2抗原，使用方便，结果准确。
文档编号G01N33/576GK101464463SQ20071017257
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者龙琼英 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星长征医学科学有限公司