专利名称：使用dna微阵列的核酸检测方法以及核酸检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及到使用在基因诊断、DNA序列解析、或基因多态性解析等生物技术领域、特别是在基因检查领域中使用的DNA微阵列的核酸检测方法和核酸检测装置、以及DNA微阵列。
背景技术：
以人类基因组计划为首的各种生物的基因碱基序列解析计划急速进展，庞大的碱基序列信息正在蓄积。人类基因组的全碱基序列已在决定中。今后，通过对生物体中基因的功能的阐明，在各种疾病的诊断、医药品的开发、农作物的品种改良等范围广泛的领域中基因相关技术的开发会飞跃进步。作为这些新领域发展基础的是碱基序列信息和基因的表达以及功能信息。作为大规模进行基因的功能和表达解析，发展为基因检查的技术，Affymetrix公司、Nanogen公司等正在开发DNA芯片或DNA微阵列(以下将两者总称为DNA微阵列)。然而，现在的很多DNA微阵列由于是以荧光检测作为基本原理的，需要激光或复杂的光学系统，系统大型化、且价格昂贵。
而现在开发的DNA微阵列是检测样品中有无基因的DNA微阵列。与此相对，能够对样品中基因定量的DNA微阵列很少。
因此，鉴于上述的实际状况，本发明目的在于提供使用能够高精度地对样品中含有的核酸定量的DNA微阵列的核酸检测方法和核酸检测装置，以及DNA微阵列。
发明内容
达到上述目的的本发明包含以下内容。
(1)使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是包括以下工序使含有核酸的样品作用于备有包含可与所定核酸杂交的核酸探针的多个核酸探针部的DNA微阵列的工序，对于上述多个核酸探针部中的每一个，监测核酸探针与所定核酸杂交的输出，获得有关上述多个核酸探针部中的每一个的输出超过所定值的时间的次数分布的工序，和根据由在上述工序中得到的次数分布进行规则化求得的最大值，对样品中含有的上述所定核酸进行定量的工序。
(2)权利要求1所述的使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是上述DNA微阵列在栅绝缘物表面直接或借助于载体固定核酸探针，备有对应于上述多个核酸探针部的多个绝缘栅场效应晶体管，对来自该绝缘栅场效应晶体管的输出进行监测。
(3)权利要求1所述的使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是在使含有上述核酸样品作用的工序中，在上述DNA微阵列上以该核酸为模板进行核酸扩增。
(4)权利要求3所述的使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是上述核酸扩增是通过恒温扩增法进行的。
(5)核酸检测装置，其特征是备有安装DNA微阵列的测定部，该DNA微阵列配备含有可与所定核酸杂交的核酸探针的多个核酸探针部，对来自安装在上述测定部的DNA微阵列的各个核酸探针部的输出进行检测的检测部，和取得有关上述多个核酸探针部在上述检测部检测的输出超过所定值的时间的次数分布，根据规则化求得的平均值，对样品中含有的上述所定核酸进行定量的演算部。
(6)权利要求5所述的核酸检测装置，其特征是上述DNA微阵列在栅绝缘物表面直接或借助于载体固定有核酸探针，备有对应于上述多个核酸探针部的多个绝缘栅场效应晶体管，上述检测部对来自该绝缘栅场效应晶体管的输出进行监测。
(7)权利要求5所述的核酸检测装置，其特征是上述DNA微阵列配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，上述所定的核酸与上述核酸探针的杂交时间在各个区段是不同的。
(8)配备含有可与所定的核酸杂交的核酸探针的多个核酸探针部的DNA微阵列。
(9)权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是含有对应于上述多个核酸探针部配设的、对所定核酸与核酸探针的杂交进行检测的检测部。
(10)权利要求9所述的DNA微阵列，其特征是上述检测部是绝缘栅场效应晶体管。
(11)权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述所定核酸与上述核酸探针的杂交时间不同。
(12)权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述核酸探针部中的核酸探针的密度不同。
(13)权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述核酸探针部的面积不同。
(14)权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述核酸探针的长度不同。
图1是表示适用本发明的DNA微阵列的模式斜视图。
图2是DNA微阵列的主要部分剖面图。
图3是表示适用本发明核酸检测装置的模式构成图。
图4是流动池主要部分剖面图。
图5是将流动池分解表示的主要部分剖面图。
图6是表示来自多个核酸探针部的输出的特性图。
图7是表示根据来自多个核酸探针部的输出，在信号处理电路中处理结果的特性图。
图8是使用参照用场效应晶体管，对来自多个核酸探针部的输出测定时的电路构成图。
图9是表示适用本发明的其他DNA微阵列例子的模式斜视图。
图10是表示在DNA微阵列上进行核酸扩增的各个工序模式的DNA微阵列的主要部分剖面图。
图11是表示由核酸探针开始单链核酸延伸状态模式的DNA微阵列主要部分剖面图。
图12是表示由核酸探针延伸的单链核酸呈现的高级结构模式的DNA微阵列主要部分剖面图。
图13是表示使用两种探针在DNA微阵列上检测时的各个工序模式的DNA微阵列主要部分剖面图。
图14是表示使嵌入剂作用的状态的DNA微阵列主要部分剖面图。
具体实施例方式
为了更详细地叙述本发明，根据附图进行说明。在以下图中，对于同样功能部分附予同样符号来进行说明。
［实施例1]作为实施例1，对适用本发明的核酸检测方法，对所定基因(以下称为靶基因)含有的单碱基多态性进行检测的方法进行说明。
图1是本方法中使用的DNA微阵列1的梗概斜视图，图2是该DNA微阵列1的主要部分剖面图。DNA微阵列1就象图1所表示的那样，备有配置在基板上的多个核酸探针部2和与这些多个核酸探针部2对应配置的绝缘栅场效应晶体管3。在本例DNA微阵列1中，多个核酸探针部2被分为两部分(分别被定为第1区域3a和第2区域3b)，在第1区域3a中检测靶基因中一方的多态性(以下有时称为“第1多态性”)，在第2区域3b检测靶基因中的另外一方的多态性(以下有时称为“第2多态性”)。
核酸探针部2是在绝缘栅场效应晶体管4的栅电场绝缘物5的表面固定有核酸探针6的结构。绝缘栅场效应晶体管4备有例如配置在p形硅基板7上作为载波电流供给源的源极8以及取出载波电流的漏极9、配置在这些p形硅基板7、源极8以及漏极9上的栅绝缘物5。
核酸探针6由可与检测对象靶基因杂交的寡核苷酸或cDNA或中间分支的DNA片段构成。核酸探针6通常由300个以下的碱基构成，在适当的反应条件下，可以与检测对象靶基因杂交，对于寡核苷酸希望是80个以下碱基长的核酸片段。
在本例DNA微阵列1中，第1区域3a中的核酸探针6具有可与第1多态性靶基因杂交、而不与第2多态性靶基因杂交那样的序列。另一方面，在第2区域3b中的核酸探针6具有可与第2多态性靶基因杂交、而不与第1多态性靶基因杂交那样的序列。
栅绝缘物5单独或组合使用氧化硅(SiO2)、氮化硅(SiN)、氧化铝(Al2O3)、氧化钛(Ta2O5)等材料，通常为了很好保持晶体管动作，最好是在氧化硅(SiO2)上将氮化硅(SiN)、氧化铝(Al2O3)、氧化钛(Ta2O5)层叠的二层结构。
为了将核酸探针6固定在栅绝缘物5表面，可以用氨基(NH2)、巯基(SH)、生物素等对核酸探针6的一端进行化学修饰。使用由氨基化学修饰的核酸探针6时，用氨基丙基乙氧基硅烷、聚赖氨酸等对栅绝缘物5的表面进行化学修饰后，将氨基导入绝缘膜表面，与戊二醛或苯二异氰酸酯(PDC)反应，将用氨基化学修饰的核酸探针6固定在栅绝缘物5表面。将用巯基化学修饰的核酸探针6固定在栅绝缘物5表面时，在栅绝缘物5表面上形成金薄膜，利用巯基与金的亲和性固定核酸探针。另外，在对用生物素化学修饰的核酸探针6进行固定时，在栅绝缘物5表面上导入链霉抗生物素蛋白，利用生物素与链霉抗生物素蛋白的亲和性将核酸探针6固定在栅绝缘物5表面。在实际固定时，是将含有核酸探针6的溶液只滴在或点在栅绝缘物5表面的所定区域，只在栅绝缘物5表面的所希望的区域上固定核酸探针6。
另一方面，也可以在栅绝缘物5表面形成固定化载体，将核酸探针6间接地固定在该固定化载体的表面或内部。作为固定化载体的材料，可以使用琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚羟乙基甲基丙烯酸酯(pHEMA)等，用氨基或链霉抗生物素蛋白等对固定化载体进行化学修饰，如上所述，分别利用与戊二醛或PDC、或生物素的亲和性，可以将核酸探针固定在固定化载体上。这样做也可以借助于固定化载体间接地将核酸探针6固定在绝缘栅场效应晶体管4的栅绝缘物5表面上。
在象以上那样构成的DNA微阵列1中，通过使检查对象作用，该样品中含有的靶基因和核酸探针6在适当的反应条件下进行杂交。即，对应于样品中含有的靶基因的多态性，第1区域3a以及第2区域3b中任一方的核酸探针6与靶基因或形成复合体，或在第1区域3a以及第2区域3b的两方核酸探针6与靶基因都形成复合体。
在使检查对象样品作用时使用的缓冲液的pH适当条件下，核酸带负电。因此，通过核酸探针6与靶基因形成复合体，在绝缘栅场效应晶体管4的栅绝缘物5附近电荷密度发生变化，栅绝缘物5的表面电位变化。该变化与一般的绝缘栅场效应晶体管的栅电压变化具有同等的作用，可以使通道的导电率变化。因此，可以作为流过源极8和漏极9之间的漏电流变化，检测各个核酸探针部2中的复合体的形成。
在对各个核酸探针部2中复合体的形成进行检测时，可以使用例如图3所表示的检测装置10。检测装置10备有载置在DNA微阵列1的流动池12、用于向流动池12供给各种溶液的流路13、与流路13的起端部连接的杂交液14以及洗涤液15、配设在杂交液14以及洗涤液15和流动池12之间的流路13上，对向流路13供给的杂交液14和洗涤液15进行切换的阀16、控制对流动池12的溶液供给的泵17、借助于阀16用于向流路13供给样品和嵌入剂等的分注器18、接在流路13的终端部的废液瓶19、对来自配置在流动池12的DNA微阵列1的输出进行处理/演算的信号处理电路20。
流动池12就象图4所表示的那样，备有内部流路21形成的筐体22、借助于作为信号线的导线24与DNA微阵列1电连接印刷电路基板25、将印刷电路基板25和信号处理电路20电连接的管脚26、将导线23与内部流路21进行隔离的保护罩27、用于连接内部流路21和流路13的螺栓28。另外，图5给出了流动池12的分解剖面图。
筐体22中的内部流路21以例如直径1mm的孔穿越筐体22内部，在筐体22的靠近中心部与DNA微阵列1连接。而内部流路21至少与DNA微阵列1的第1区域3a和第2区域3b连接。另外，内部流路21通过将在内部配设了流路13的螺栓28装配在筐体22的装螺栓部29与流路13连接。筐体22的装螺栓部29为了装配螺栓28，形成与螺栓相配的螺纹。
在与流路13中的内部流路21连接的端面中，实施平坦化处理。通过使与流路13中的内部流路21连接的端面平坦化，在装配螺栓28的状态下，可以使流路13和内部流路21密封，可以防止漏液。
印刷电路基板25借助导线24可以对对应于多个核酸探针部2的多个绝缘栅场效应晶体管3各个的输出进行检测。
保护罩26可以由例如丙烯、聚丙烯或聚碳酸酯等构成，配设在筐体22和印刷电路基板25之间。保护罩26由于配设在筐体22和印刷电路基板25之间，可防止导线24露出到内部流路21内。
在象以上那样构成的检测装置10中，使用载置在流动池12的DNA微阵列，可以对检查对象样品中含有的靶基因的多态性进行鉴定。具体来说，首先随着切换阀16使得能够向流路13只供给杂交液14，驱动泵17。同时，利用分注器18借助阀16向流路13供给样品。通过这样操作，可以向流路13和流动池12的内部流路21供给含有样品的杂交液14，可以使样品作用于DNA微阵列1的第1区域3a和第2区域3b。
然后在第1区域3a或第2区域3b、或第1区域3a和第2区域3b中，样品中含有的靶基因和具有基因互补序列的核酸探针6进行杂交反应。换而言之，样品中含有的靶基因只与第1区域3a和第2区域3b中含有的核酸探针6之中的具有互补碱基序列的核酸探针6杂交。反应后，供给流路13和内部流路21的溶液通过泵17送到废液瓶19中。
在检测装置10中，核酸探针6和靶基因进行杂交(形成复合体)，绝缘栅场效应晶体管3中就出现漏电流变化。在检测装置10中，绝缘栅场效应晶体管3中的漏电流变化可以通过印刷电路基板进行检测，将信号输送到信号处理电路20。在检测装置10中，特别是由于备有多个核酸探针部2，所以将来自多个绝缘栅场效应晶体管3的各个信号输送到信号处理电路20。
此时，在多个核酸探针部2中，核酸探针6和靶基因的杂交出现了时间差。因此，在来自绝缘栅场效应晶体管4的信号输出液也产生了时间差。例如，来自3个绝缘栅场效应晶体管4的信号就象图6所表示的那样，都分别带着时间差输出的。
在信号处理电路20中，对于来自带有这样时间差的多个绝缘栅场效应晶体管4的多个信号，测定超过阈电压值的时间，以时间作为横轴，以测定超过阈电压值的输出的核酸探针部2的个数作为纵轴，获得次数分布。另外，在信号处理电路20中将得到的次数分布中的平均值作为多个核酸探针部2中的输出时间。
以测定时间作为横轴，以测定超过阈电压值的输出的核酸探针部2的个数作为纵轴，获得次数分布，例如就象图7所表示的那样，得到规则化分布。此时，信号处理电路20作为次数分布的平均值(此时为规则化分布的最大值)，将T3作为输出时间。因此，通过信号处理电路20可以获得由第1区域3a含有的多个核酸探针部2得到的输出时间和由区域3b含有的核酸探针部2得到的输出时间。
而在检测装置10中，根据来自第1区域3a和第2区域3b的各个输出时间，可以判别靶基因中的多态性。即，当靶基因是只含有第1多态性的纯合型时，可以只从第1区域3a获得输出时间，相反，靶基因是只含有第2多态性的纯合型时，可以只从第2区域3b获得输出时间。当靶基因是含有第1多态性和第2多态性的杂合型时，可以得到来自第1区域3a和第2区域3b两方的输出时间。这样一来，通过检测装置10就可以由来自第1区域3a和第2区域3b的输出时间来判别靶基因的多态性。
通过检测装置10与通过单一核酸探针部判别多态性时相比，可以使测定误差减�。芄唤懈返呐斜�。
另外，在检测装置10中，如前所述，不仅可以象上所那样通过利用信号处理电路20得到输出时间判别靶基因的多态性，也可以象以下那样判别靶基因的多态性。即，信号处理电路20就第1区域3a和第2区域3b分别算出、并比较经过所定时间后输出信号的绝缘栅场效应晶体管4的比例。结果表明当第1区域3a中的比例比第2区域3b中的比例大时，可以判别靶基因是只具有第1多态性的纯合型，相反，当第2区域3b中的比例比第1区域3a中的比例大时，可以判别靶基因是只具有第2多态性的纯合型。而当第1区域3a中的比例和第2区域3b的比例同等时，可以判别靶基因是具有第1多态性和第2多态性的杂合型。
另一方面，例如在希望迅速检测第1多态性存在时，在第1区域3a含有的核酸探针部2中，通过在获得来自至少一个以上核酸探针部2的输出的时候的检测，也可以判定第1多态性的存在。通过进行这样判定，可以迅速判定样品中是否含有第1多态性。
另外，检测装置10就象图8所表示的那样，也可以备有参照电极30以及参照用场效应晶体管31、获取来自绝缘栅场效应晶体管4的输出以及参照用场效应晶体管31的输出的差分的差分测定电路32。此时，在参照用场效应晶体管31的栅绝缘物表面固定着不含有与靶基因互补的碱基序列的核酸33。因此，固定在参照用场效应晶体管31的栅绝缘物表面的核酸不能与靶基因杂交。
参照电极30，将银/氯化银电极或甘汞电极浸渍在例如所定组成·浓度的内部溶液中，配设在由内部流路21供给的溶液中摄入的位置。参照电极30可以配设在例如流动池21内部。
在这样构成的检测装置10中，绝缘栅场效应晶体管4中的漏电流变化以表面电位由驱动电路34检测，参照用场效应晶体管31中的漏电流变化以表面电位由驱动电路35检测。差分测定电路32获得驱动电路34以及驱动电路35各个表面电位的差分，差分作为来自绝缘栅场效应晶体管4的信号输出到信号处理电路20。
通过进行这样的差分测定，输出来自绝缘栅场效应晶体管4的信号，可以补偿各个绝缘栅场效应晶体管4的电特性的差别以及由于周围温度或光的变化引起的输出值的变化，另外，可以抵消样品中的荷电粒子非特异性吸附在栅绝缘物5上引起输出值的变化。这样一来，通过检测装置10可以高精度只检测到由于靶基因和核酸探针6的杂交引起的输出变化。
另外，参照用场效应晶体管31最好集成在与绝缘栅场效应晶体管4同一基板。通过将参照用场效应晶体管31集成在与绝缘栅场效应晶体管4同一基板，可以使绝缘栅场效应晶体管4和参照用场效应晶体管31中的电特性一致。
还有，在检测装置10中，在不需要与绝缘栅场效应晶体管同样数目的参照用场效应晶体管31，获得来自多个绝缘栅场效应晶体管4的输出时，由于可以共同使用一个参照用场效应晶体管31，所以只要有一个以上的参照用场效应晶体管31就可以。
另外，参照用电极30由于可作为电位测定基准使用，所以可以稳定地测定参照用场效应晶体管31和绝缘栅场效应晶体管4的表面电位。
还有，利用上述检测装置10也可以对样品中的靶基因进行定量。在对样品中的靶基因进行定量时，使用含有预先浓度已知的靶基因多个样品进行同样测定，预先求出关于这些多个样品的输出时间。然后通过对测定对象样品的输出时间和多个样品的输出时间进行比较，可以对测定对象样品中含有的靶基因进行定量。
此时，特别是由于使用多个核酸探针部2可以测定输出时间，所以可以对由于例如起因于靶基因的非特异的杂交的噪音成分引起的定量误差进行校正。因此，利用测定装置10可以对测定对象样品中含有的靶基因进行高精度地定量。
另外，检测装置10就象图9所表示的那样，也可以使用备有由第1区域3a和第2区域3b构成的第1区段、由第3区域3c和第4区域3d构成的第2区段、由第5区域3e和第6区域3f构成的第3区段、由第7区域3g和第8区域3h构成的第4区段的DNA微阵列。从第1区域3a至第8区域3h这些区域都各有多个核酸探针部2。第1区域3a、第3区域3c、第5区域3e以及第7区域3g固定着于靶基因中的第1多态性杂交的核酸探针6。第2区域3b、第4区域3d、第6区域3f以及第8区域3h固定着于靶基因中的第2多态性杂交的核酸探针6。
另外，在第1区段、第2区段、第3区段以及第4区段中，含有靶基因的核酸与核酸探针6在进行杂交之前的时间被调节为相互都不一样。具体来说，通过将第1区段中的核酸探针6的固定化密度、第2区段中的核酸探针6的固定化密度、第3区段中的核酸探针6的固定化密度以及第4区段中的核酸探针6的固定化密度做成各不相同的密度，在各个区段中进行杂交的时间就变得各不相同了。另外，通过将第1区段中的核酸探针部2的面积、第2区段中的核酸探针部2的面积、第3区段中的核酸探针部2的面积以及第4区段中的核酸探针部2的面积做成各不相同的面积，在各个区段中进行杂交的时间就变得各不相同了。另外，通过将第1区段中的核酸探针6的长度(碱基长度)、第2区段中的核酸探针6的长度(碱基长度)、第3区段中的核酸探针6的长度(碱基长度)以及第4区段中的核酸探针6的长度(碱基长度)做成各不相同的长度(碱基长度)，在各个区段中进行杂交的时间就变得各不相同了。
当使用图9所表示的DNA微阵列时，对于第1区段至第4区段各个区段，测定来自信号处理电路20的输出时间。由于在第1区段至第4区段进行杂交的时间不同，所以作为测定的输出时间可以选择最适的区段。换而言之，含有靶基因的核酸和核酸探针6直至杂交的时间无论过短，还是过长，定量时的误差都变得很大。因此，通过选择最适区段，使用来自选择区段含有的核酸探针部2的信号测定输出时间，可以高精度地进行定量。
另外，在使用图9所示的DNA微阵列1时，也要想迅速检测第1多态性的存在时，在第1区域3a、第3区域3c、第5区域3e以及第7区域3g任一个区域含有的核酸探针部2中通过获得来自至少一个以上的核酸探针部2的输出时候检测，也可以判定第1多态性的存在。使用图9所示的DNA微阵列1，可以更迅速地判定样品中是否含有第1多态性。
［实施例2]作为实施例2就检测样品中是否含有靶基因的系统进行说明，同时，就样品中含有靶基因时对靶基因进行定量的系统进行说明。
在实施例2中，作为DNA微阵列1，使用将在3’末端至少含有与检测对象的靶基因互补的碱基序列的核酸探针6的5’末端固定于栅绝缘物2表面的微阵列。
在本例中，作为样品可以使用从组织片段或白血球提取的含有人染色体的溶液。特别是在本例中，以固定化的核酸探针6作为引物，该样品中含有的人染色体作为模板，在多个核酸探针部2上分别进行扩增，通过对应的多个绝缘栅场效应晶体管4监测该核酸扩增。
具体来说，首先在对阀16切换为可以向流路13供给核酸扩增需要的试剂的同时，驱动泵17。同时，通过分注器18借助阀16向流路13供给含有人染色体的溶液。由此可以向流路13以及流动池12的内部流路21供给含有人染色体的溶液以及核酸扩增需要的试剂。
其次，在DNA微阵列1上进行核酸扩增。具体如图10(a)～(d)所表示的那样，当在含有人染色体的溶液中含有包含靶基因的DNA片段38时，进行以核酸探针6作为引物的核酸扩增。即，首先象图10(a)所示的那样，通过将栅绝缘物2控制在所定温度，核酸探针6与DNA片段38中的靶基因的一部分进行杂交(退火)。然后就象图10(b)所示的那样，当将栅绝缘物2控制在所定温度，通过核酸扩增需要的试剂中含有的酶(DNA聚合酶等)，可以进行以DNA片段38作为模板，从核酸探针6的3’末端开始的延伸反应。延伸反应后，当将栅绝缘物2控制在所定温度时，热变性后可以使DNA片段38脱离。然后再次通过将栅绝缘物2控制在所定温度，就象图10(c)所示那样，不同的核酸探针6与DNA片段38中的靶基因的一部分进行杂交(退火)。然后就象图10(d)所示的那样，当再次将栅绝缘物2控制在所定温度时，通过核酸扩增需要的试剂中含有的酶(DNA聚合酶等)，可以进行以DNA片段38作为模板，从核酸探针6的3’末端开始的延伸反应。
象上述那样，通过栅绝缘物2的温度控制，可以依次进行从核酸探针6的3’末端开始的延伸反应。当测定对象的样品中含有包含靶基因的DNA片段38时，在核酸探针部2进行延伸反应，结果在对应于该核酸探针部2的绝缘栅场效应晶体管4的栅绝缘物5附近电荷密度发生变化，栅绝缘物5的表面电位也发生变化。该变化变得与一般的绝缘栅场效应晶体管的栅电压变化同等的作用，使通道的导电率变化。因此，通过检查装置10可以以流过源极8和漏极9之间的漏电流变化检测各个核酸探针部2中的延伸反应的进行。
在本例中，通过与使用单一的核酸探针部检测靶基因时进行比较，由于使用多个核酸探针部2也可以将误差减�。词乖谘分械陌谢虻牧可偈保部梢哉方屑觳�。
另外，通过上述检测装置10也可以对样品中的靶基因进行定量。当对样品中的靶基因进行定量时，使用含有预先浓度已知的靶基因的多个样品进行同样测定，预先求出关于这些多个样品的输出时间。然后通过对测定对象样品的输出时间和多个样品的输出时间进行比较，可以对测定对象样品中含有的靶基因进行定量。
此时，特别是由于使用多个核酸探针部2可以测定输出时间，所以可以对例如由于起因于靶基因的非特异的杂交的噪音成分引起的定量误差进行校正。因此，利用测定装置10可以对测定对象样品中含有的靶基因进行高精度地定量。
以下给出具体例子。
首先作为第1个具体例子，为了用一种探针研究B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，将对5’末端进行氨基修饰的以下核酸探针6固定于绝缘栅场效应晶体管4的栅绝缘物5上。HBV探针(i)5’-gcg gat ccg tgg agt tac tct cgt ttt tgc-3’在参照用场效应晶体管31的栅绝缘物上固定具有与HBV探针(i)不同的序列核酸33、例如全部由A构成的30碱基长度的核酸33。该核酸33也可以是不固定在参照用场效应晶体管31的栅绝缘物上的5’末端用氨基修饰的核酸。
样品使用由试剂盒(Qiagen Viral DNA Kit)从血清中提取的B型肝炎DNA的样品。通过分注器18将含有B型肝炎DNA、1×PCR缓冲液(加Mg2+)(Takara公司生产)，0.4μM的dNTP、5U的Taq聚合酶(Takara)的样品溶液100μl导入流动池12，通过以下的(1)～(3)工序对栅绝缘物5进行加热·冷却。
(1)热变性94℃×3分钟(2)热变性将94℃×30秒、退火55℃×30秒以及延伸反应72℃×30秒作为一个循环，共进行40个循环。
(3)延伸反应72℃×10分钟上述(1)～(3)工序结束后，使栅绝缘物5的温度上升，或通过分注器18将碱性溶液导入到流动池12后使双链核酸变性为单链核酸。然后，将洗涤液由分注器18导入流动池12，将没有固定在基板上的核酸、未反应的核酸以及各种成分从DNA微阵列1中除去。然后将缓冲液由分注器18导入流动池12，通过信号处理电路20测定绝缘栅场效应晶体管4的输出值。
在第1个具体例子中，信号处理电路20中的输出值是通过核酸扩增由HBV探针(i)的3’末端开始单链聚核酸延伸的结果的输出值，与固定于参照用场效应晶体管31的栅绝缘物的核酸33比较，由于碱基数多，可进行检测。图11中示出了单链聚核酸由核酸探针6延伸的状态模式以及固定于参照用场效应晶体管31的栅绝缘物的核酸33的模式。
在第1个具体例子中，当使用含有B型肝炎DNA的样品时，绝缘栅场效应晶体管4和参照用场效应晶体管31中的表面电位的差分输出是2.8mV。另一方面，使用不含有B型肝炎DNA的样品时，进行同样测定的差分输出是0.4mV。由该结果可以在含有B型肝炎DNA的样品和不含有B型肝炎DNA的样品中获得有意义差值。
以下作为第2个具体例子，为了高灵敏度地检测B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，通过利用样品中存在的靶基因进行的扩增反应，将呈现高级结构那样的核酸探针6固定在绝缘栅场效应晶体管4的栅绝缘物5上。在第2个具体例子中使用的核酸探针6使用具有与B型肝炎DNA互补的碱基序列，而且对5’末端进行了氨基化修饰的以下核酸探针6。
HBV探针(ii)5’-cat agc agc agg atg aag agg aat atg ata ggatgt gtc tgc ggc gtt t-3’另外，在本例中，在参照用场效应晶体管31的栅绝缘物上固定与HBV探针(ii)不同的序列的核酸33、例如全部由A构成的30碱基长度的核酸33。
在第2个具体例子中也在与第1个具体例子同样的试剂和条件下进行上述(1)～(3)工序。然后，同样在将没有固定在基板上的核酸、未反应的核酸以及各种成分从DNA微阵列1中除去的同时通过信号处理电路20测定输出值。
在第2个具体例子中，输出值是通过核酸扩增由HBV探针(ii)的3’末端开始单链聚核酸延伸的同时形成高级结构的结果的输出值，与固定于参照用场效应晶体管31的栅绝缘物的核酸33比较，由于碱基数多、而且高级结构不同可进行检测。图12中给出了单链聚核酸由核酸探针6延伸的状态模式以及固定于参照用场效应晶体管31的栅绝缘物的核酸33的模式。在第2个具体例子中，就象图12所示的那样，当使用含有B型肝炎DNA的样品时，进行延伸反应的结果，获得核酸探针6的3’末端呈现出高级结构、此时为茎环结构认及环结构。该茎结构是由于通过延伸反应合成的单链核酸与HBV探针(ii)的5’末端开始直至30个碱基互补形成的。而环结构是由HBV探针(ii)的3’末端侧开始通过19个碱基形成的。
在第2个具体例子中，当使用含有B型肝炎DNA的样品时，绝缘栅场效应晶体管4和参照用场效应晶体管31中的表面电位的差分输出是4.8mV。另一方面，使用不含有B型肝炎DNA的样品时，也进行同样测定的差分输出是0.5mV。由该结果可以在含有B型肝炎DNA的样品和不含有B型肝炎DNA的样品中获得有意义差值。另外，与第1具体例子比较，在第2具体例子中，由于核酸探针6作为延伸反应的结果形成高级结构，可以更高灵敏度地获得输出值。
以下作为第3个具体例子，为了用两种探针检测B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，将5’末端进行了氨基化修饰的以下核酸探针6固定在绝缘栅场效应晶体管4的栅绝缘物5上。
HBV探针(i)5’-gcg gat ccg tgg agt tac tct cgt ttt tgc-3’HBV探针(iii)5’-gca agc ttt cta aca aca gta gtt tcc gg-3’另外，在本例中，也在参照用场效应晶体管31的栅绝缘物上固定具有与HBV探针(ii)不同的序列的核酸33、例如全部由A构成的30碱基长度的核酸33。
在第3个具体例子中也在与第1个具体例子同样的试剂和条件下进行上述(1)～(3)工序。图13(a)～(d)给出了第3具体例子中的核酸扩增。图13(a)～(d)中，将HBV探针(i)表示为核酸探针6a，将HBV探针(iii)表示为核酸探针6b。当检查对象样品含有B型肝炎DNA时，就象图13(a)所示那样，通过将栅绝缘物2控制在所定温度，含有B型肝炎DNA的DNA片段38与核酸探针6a进行杂交(退火)。然后就象图13(b)所示的那样，当将栅绝缘物2控制在所定温度，通过核酸扩增需要的试剂中含有的酶(DNA聚合酶等)，可以进行以DNA片段38作为模板，从核酸探针6a的3’末端开始的延伸反应。然后就象图13(c)所示的那样，当将栅绝缘物2控制在所定温度时，热变性后可以使DNA片段38脱离，从核酸探针6a的3’末端开始延伸的区域的一部分与核酸探针6b进行杂交(退火)。然后就象图13(d)所示的那样，再次将栅绝缘物2控制在所定温度，以从核酸探针6a的3’末端延伸的区域作为模板，进行从核酸探针6b开始的延伸反应，最后核酸探针6a和核酸探针6b之间形成核酸双链。
然后，通过分注器18借助阀16向流路13导入缓冲液，除去DNA微阵列1上未反应的样品等。然后，通过分注器18借助阀16向流路13导入含有溴乙锭或Hoechst 33258等嵌入剂39的溶液。通过导入嵌入剂，就象图14所示那样，在核酸探针6a和核酸探针6b之间形成核酸双链中插入了嵌入剂39。嵌入剂39只与双链的核酸反应、结合，不结合单链核酸。嵌入剂插入核酸双链后，与第1个具体例子同样，通过信号处理电路20测定输出值。
结果，当使用含有B型肝炎DNA样品时，差分输出是5.6mV。而使用不含有B型肝炎DNA的样品时，差分输出是0.4mV。象上述那样，在第3个具体例子中在含有B型肝炎DNA的样品和不含有B型肝炎DNA的样品中也获得有意义差值。另一方面，不使用嵌入剂39在图13(d)所示的核酸双链的状态下测定时，差分输出是2.2mV。该结果表明，由于嵌入剂39带有电荷，所以通过使含有嵌入剂39的溶液作用，可以谋求约2倍的高灵敏度。
以下作为第4个具体例子，为了用两种探针检测B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，将5’末端进行了氨基化修饰的以下核酸探针6固定在绝缘栅场效应晶体管4的栅绝缘物5上。
HBV探针(ii)5’-cat agc agc agg atg aag agg aat atg ata ggatgt gtc tgc ggc gtt t-3’HBV探针(iV)5’-tcc tct aat tcc agg atc aac aac aac cag aggttt tgc atg gtc ccg ta-3’
另外，在本例中，将含有B型肝炎DNA、0.1mM的dNTP、0.5mM的MgCl2、32U的Bst聚合酶(New England Biolab公司生产)的样品溶液100μl由分注器18导入流动池12，通过于65℃对栅绝缘物5进行温育，进行扩增反应。另外，该恒温扩增反应与图10(a)～(d)所示情况同样进行。还有，在本例中也与第3个具体例子同样，将嵌入剂39插入到核酸双链后通过信号处理电路20测定输出值。
结果，当使用含有B型肝炎DNA的样品时，差分输出是5.8mV。另一方面使用不含有B型肝炎DNA的样品时，差分输出是0.3mV。象上述那样，在第4个具体例子中也在含有B型肝炎DNA的样品和不含有B型肝炎DNA的样品中都获得有意义差值。另一方面，不使用嵌入剂39的状态下进行测定时，差分输出是2.4mV。该结果表明，通过使含有嵌入剂39的溶液发挥作用，可以谋求约2倍的高灵敏度。
产业上的利用可能性就象以上详细说明的那样，在本发明中，通过对来自多个核酸探针部的输出进行监测，获得对于输出超过所定的值的核酸探针部的个数的每一时间分布，在对目的核酸进行检测的同时也可以进行定量。利用本发明在对目的核酸进行高精度检测的同时，也可以进行高精度定量。
序列表<110>株式会社日立高新技术<120>使用DNA微阵列的核酸检测方法以及核酸检测装置<130>PH-1503-PCT<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>1gcggatccgt ggagttactc tcgtttttgc<210>2<211>49<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>2catagcagca ggatgaagag gaatatgata ggatgtgtct gcggcgttt 49<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>3gcaagcttt c taacaacagt agtttccgg<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag aggttttgca tggtcccgta 50
权利要求
1.使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是包括以下工序使含有核酸的样品作用于备有包含可与所定核酸杂交的核酸探针的多个核酸探针部的DNA微阵列的工序，对基于各个上述多个核酸探针部的每一个，监测核酸探针与所定核酸杂交的输出，获得有关上述各个多个核酸探针部的输出超过所定值的时间的次数分布的工序，和根据由在上述工序中得到的次数分布进行规则化求得的最大值，对样品中含有的上述所定核酸进行定量的工序。
2.权利要求1所述的使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是上述DNA微阵列在栅绝缘物表面直接或借助于载体固定核酸探针，备有对应于上述多个核酸探针部的多个绝缘栅场效应晶体管，对来自该绝缘栅场效应晶体管的输出进行监测。
3.权利要求1所述的使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是在使含有上述核酸的样品作用的工序中，在上述DNA微阵列上以该核酸为模板进行核酸扩增。
4.权利要求3所述的使用DNA微阵列的核酸检测方法，其特征是上述核酸扩增是通过恒温扩增法进行的。
5.核酸检测装置，其特征是备有安装DNA微阵列的测定部，该DNA微阵列配备含有可与所定核酸杂交的核酸探针的多个核酸探针部，对来自安装在上述测定部的DNA微阵列的各个核酸探针部的输出进行检测的检测部，和取得有关上述多个核酸探针部在上述检测部检测的输出超过所定的值的时间次数分布，根据规则化求得的最大值，对样品中含有的上述所定核酸进行定量的演算部。
6.权利要求5所述的核酸检测装置，其特征是上述DNA微阵列在栅绝缘物表面直接或借助于载体固定核酸探针，备有对应于上述多个核酸探针部的多个绝缘栅场效应晶体管，上述检测部对来自该绝缘栅场效应晶体管的输出进行监测。
7.权利要求5所述的核酸检测装置，其特征是上述DNA微阵列配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，上述所定核酸与上述核酸探针的杂交时间在各个区段不同。
8.DNA微阵列，配备含有可与所定的核酸杂交的核酸探针的多个核酸探针部。
9.权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是含有对应于上述多个核酸探针部配设的，对所定核酸与核酸探针的杂交进行检测的检测部。
10.权利要求9所述的DNA微阵列，其特征是上述检测部是绝缘栅场效应晶体管。
11.权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述所定核酸与上述核酸探针的杂交时间不同。
12.权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述核酸探针部中的核酸探针的密度不同。
13.权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述核酸探针部的面积不同。
14.权利要求8所述的DNA微阵列，其特征是配备含有上述多个核酸探针部的多个区段，在上述多个区段中，上述核酸探针的长度不同。
全文摘要
对样品中含有的核酸进行高精度定量。包括使含有上述核酸的样品作用于配备含有可与所定核酸杂交的核酸探针的多个核酸探针部的DNA微阵列的工序，对来自各个上述多个核酸探针部的输出进行监测、取得有关各个上述多个核酸探针部在上述检测部检测的输出超过所定的值的时间的规则化分布的工序，和根据由在上述工序中得到的规则化分布求得的最大值，对样品中含有的上述所定核酸进行定量的工序。
文档编号G01N27/414GK1703623SQ0282935
公开日2005年11月30日 申请日期2002年8月12日 优先权日2002年8月12日
发明者松井拓也, 宫原裕二, 服部久美子 申请人:株式会社日立高新技术
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