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专利名称：一种常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法
技术领域：
本发明属于蛋白质组学领域，具体涉及ー种常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法。
背景技术：
Laemmli在1970年，首次根据分子量的大小使用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离jM噬菌体外壳蛋白(SDS-PAGE，Laemmli 1970年)。在Laemmli的基础上， 0’Farrell发明了聚丙烯酰胺双向凝胶电泳Q-腿)技术(0’Farrell，197 ，这ー技术已经广泛的应用到蛋白质组学研究中。在双向凝胶电泳技术中，样品制备是关键的一歩。目前应用于植物蛋白的提取方法很多，最常用的有TCA/丙酮沉淀法(Giavalisco et al. ,2003； Canovas et al.，2004)，酚抽法(Phe) (Hurkman and Tanak，1986)，随后这些方法被广泛的应用到蛋白质组学研究中，在这些方法的基础上，通过不断的改进和优化，wang等人发现了一种能很好的从植物组织中提取蛋白的BPP法(Wang et al.，2007)，目前这种方法已经被广泛的应用到蛋白质组学研究中(Wang et al.，2009 ；Wang et al.，2011)。在蛋白质组学研究中，蛋白的质量直接影响到双向电泳的結果，蛋白易降解，一般把蛋白粉冻干和溶解在尿素和硫脲的裂解液中进行使用和保存(Gorg et al. ,2004； Peltier et al.，2004 ；Valeria et al.，2005 ；Bao et al.，2006 ；Sun et al. ,2007)，但是， 这样的蛋白在低温下保存不了多久，更无法再常温下进行保存，并且不便于运输，这给研究者在蛋白保存和运输方面带来了很大的困难。

发明内容
本发明的目的在于提供ー种常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，该保存方法可以使蛋白样品在常温下保存长达半个月，在低温下如-20°C以下可以保存一年，甚至更久，经I-DE和2-DE的结果发现，按本发明方法保存的蛋白样品的质量很好，同时具有很好的质谱兼容性，并且运输方便。本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的一种常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，将蛋白样品溶于Tris-饱和酚中，取酚相置于过饱和硫酸铵甲醇溶液中沉淀出蛋白，并将沉淀出来的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在常温下进行长期保存即可。本发明所述的蛋白样品优选蛋白样品的粗提物或市售的蛋白样品的粉末，该蛋白样品的粗提物可以采用BPP法等常规方法从植物或动物样品中提取。本发明所述Tris-饱和酚的pH值大于等于7. 8。本发明所述酚相与过饱和硫酸铵甲醇溶液的体积比优选为1 1 10。本发明将蛋白样品溶于Tris-饱和酚中，取酚相置于过饱和硫酸铵甲醇溶液中沉淀出蛋白，并将沉淀出来的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中可以在常温下可以保存1 15 天。本发明将蛋白样品溶于TriS-饱和酚中，取酚相置于过饱和硫酸铵甲醇溶液中沉淀出蛋白，并将沉淀出来的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在-20°C以下进行保存1 3年。本发明蛋白样品在饱和硫酸按溶液中可以常温保存半个月，在-20°C可以保存一年，甚至更久。为了检测蛋白的质量，对I-DE和2-DE图谱，发现按此方法保存的蛋白质量很好，能很好的用在蛋白质组学研究中，同时具有很好的质谱兼容性，不管是用飞机运输，还是火车运输蛋白样品，都不会影响蛋白的质量，这为蛋白的运输和保存带来了很大的方便。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)使用本发明方法蛋白样品可以在常温保存长达半个月；(2)使用本发明方法蛋白样品可以在-20°C保存一年以上；(3)使用本发明方法保存的样品在常温下便于运输；(4)使用本发明方法保存的蛋白样品质量很好，同时可以得到好的I-DE和2-DE结果；(5)使用本发明方法保存的样品同时具备好的质谱兼容性；(6)使用本发明方法在蛋白质组学的研究中发挥着重要作用，应用前景广阔。


图1是实施例1中30°C放置不同时间段的I-DE蛋白图谱，其中B0，Bi，B3，B5， BlO和B15分别是牛血清蛋白(BSA)样品在30°C分別放置0天，1天，3天，5天，10天和15 天的I-DE ;C0，C1，C3，C5，C10和C15分别是橡胶树C-乳清蛋白样品在30°C分別放置0天， 1天，3天，5天，10天和15天的1-DE，M是蛋白Marker ；图2是实施例2中30°C放置不同时间段C-乳清的双向电泳0-腿)蛋白图谱，其中⑶，Cl，C3，C5，ClO和C15分别是橡胶树C-乳清蛋白样品在30°C分別放置0天，1天，3 天，5天，10天和15天的双向电泳图谱，其中图C15中箭头标的点是做了质谱鉴定的点；图3是实施例3中甘蔗叶片和树皮的蛋白样品在不同保存方法后的双向电泳 (2-DE)蛋白图谱，其中A是甘蔗叶片的蛋白样品保存在-20°C的过饱和硫酸铵溶液中的双向电泳0-腿)蛋白图谱；B是甘蔗叶片的蛋白样品在4°C冰箱中保存ニ个月的双向电泳 (2-DE)蛋白图谱，其中区域a与b，e与f区域进行了比较，区域b和f是蛋白样品降解比较明显的区域。图C是橡胶树树皮的蛋白样品在-20°C的过饱和硫酸铵溶液中保存了一年的双向电泳0-腿)蛋白图谱；图4是实施例2中通过MALDI T0F/T0F MS鉴定出来的蛋白点C297的肽指纹图谱， 其中蛋白点C297被切除，用胰蛋白酶酶解通过MALDI-T0F/T0F分析，肽指纹图谱(PMF)光谱峰代表不同肽段的強度，序列下面划线的部分和非划线的部分别代表匹配的和非匹配的肽段数。
具体实施例方式如无特殊指明，以下所采用的试剂或方法均为常规试剂或常规方法，其中w/v指重量体积百分含量，ν/ν指体积百分含量。实施例1牛血清白蛋白(BSA)，购自BI0SHARP公司，将牛血清白蛋白(BSA)粉末溶解在Tris-饱和酚(pH 8.0)中，Tris-饱和酚(pH 8.0)购自北京索莱宝科技有限公司，然后将酚相加入到5倍体积的过饱和硫酸铵甲醇溶液(硫酸铵加到甲醇溶液中，使得溶液达到过饱和，放在4°C过夜备用)中沉淀蛋白，把沉淀了的蛋白样品于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在 30°C温箱中分别放置0天，1天，3天，5天，10天和15天，最后样品都放在_20°C备用。需要说明的是，该过饱和硫酸铵甲醇溶液是在任何温度下都是过饱和的在常温下配置好后，放在4°C左右的冰箱中保存，使用前取出来用即可。用BPP法(Wang et al. 2007，Wang et al. 2010)提取橡胶树胶乳C-乳清中的蛋白。其中，从橡胶树胶乳C-乳清中提取蛋白过程如下采用BPP法，每ImL的C-乳清中加入 3mL BPP 蛋白提取液(IOOmM EDTA, IOOmM Tris (pH 8. 0)，50mM 硼砂，50mM 维生素 C，1 % PVPP (w/v)，1 % Triton Χ-100 (ν/ν)，然后室温将漩涡混勻5分钟后，加入等体积的Tris-饱和酚(pH 8. 0)，继续涡混振荡10min，4°C，12000rpm，离心15min之后将上层酚相转入另ー 离心管，向其中加入等体积蛋白提取液，涡混振荡5min，4°C，12000rpm离心15min，将上层酚相转入另ー离心管中，向其中加入5倍体积的过饱和硫酸铵甲醇溶液沉淀蛋白，并且把过饱和硫酸铵沉淀后的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在30°C温箱中分别放置0天，1天， 3天，5天，10天和15天，然后放在-20°C备用。然后在4°C，15min，15000g条件下离心，倒去上清，沉淀用_20°C预冷6h以上的甲醇洗涤一次，再在4°C，15min，15000g条件下离心，倒去上清，沉淀再用_20°C预冷Mi以上的丙酮洗涤两次，毎次洗涤后4°C，15000g离心15min，将蛋白沉淀在室温风干，最后用裂解液 [7M尿素，2M硫脲，质量百分含量2 % CHAPS (乙醇胺丙基ニ甲氨基丙磺酸盐)，13mM DTT (ニ 硫苏糖醇)]在室温融解蛋白2小时以上。SDS-PAGE使用的是16厘米平板凝胶，分离胶为质量百分含量为12. 5%的聚丙烯酰胺、浓缩胶为质量百分含量为4%的聚丙烯酰胺(Laemmli 1970)，然后将蛋白样品进行 SDS-PAG凝胶电泳，16°C、8w条件下电泳4小吋，凝胶通过考马斯亮蓝染色，检测结果见图1 所示。从牛血清蛋白(BSA)样品在30°C分別放置0天(图1 :B0)，1天(图1 :B1)，3天 (图1 :B3)，5天(图1 :B5)，10天(图1 :B10)和15天(图1 :B15) I-DE图谱上可以看出，牛血清蛋白的条带很清晰，没有弥散现象出现，这说明使用本发明方法保存的蛋白样品质量很好。为了进一步检测本发明方法，本申请人又用橡胶树胶乳C-乳清做了 1-DE，其中C-乳清蛋白在30°C也分別放置了 0天(图1 =CO)，1天(图1 :C1)，3天(图1 :C3)，5天(图1 C5)，10天(图1 :C10)和15天(图1 :C15)，从这些图中可以看出C-乳清蛋白的条带主要集中在17kDa-130kDa之间，每一个条带都分的很开，没有弥散的条带出现，这进ー步说明了， 从组织中提取出来的蛋白，使用本发明的方法可以常温保存长达半个月，便于运输，对蛋白样品的质量没有影响。实施例2按实施例1中的方法提取出来的溶于pH值为8. 0的Tris-饱和酚中的橡胶树胶乳C-乳清蛋白粗提取物，用6倍体积的过饱和硫酸铵甲醇溶液沉淀后，将沉淀出来的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在30°C温箱中分别放置0天，1天，3天，5天，10天和15天后， 按实施例1中的方法洗涤裂解蛋白获得800微克C-乳清中的蛋白，用Mcm长pH值4-7的线性IPG胶条(GE Healthcar)，在水化盘中水化18小时，接着使用聚焦仪(Hoefer IEF100)完成等电聚焦过程，完成后的的胶条第一次在平衡液(50mMTriS-HCl，pH8. 8，6M尿素，体积百分含量30%甘油，质量百分含量2%十二烷基磺酸钠(SDQ，质量百分含量为0. 02%溴酚兰)中加入质量百分含量为的ニ硫苏糖醇(DTT)浸泡胶条15分钟，第二次向平衡液中加入质量百分含量为4%的碘乙酰胺浸泡胶条15分钟后，平衡结束后使用超纯水将胶条上残留的平衡缓冲液冲洗干净。将平衡后的胶条转移到第二向垂直凝胶(使用质量百分含量为12. 5%的聚丙烯酰胺凝胶)的上端，用质量百分含量1 %的琼脂糖将胶条密封，使用电泳仪(Hoefer)进行SDS-PAGE凝胶电泳，起始恒功率6W/胶电泳lh，之后调节恒功率8W/胶电泳他至溴酚蓝指示剂到达凝胶底端。电泳完成后，进行后续的凝胶染色过程，结果见图 2。从C-乳清中提取出来的蛋白在过饱和硫酸铵甲醇溶液中分别保存0天(图2，C0)，1天 (图 2，Cl)，3 天(图 2，C3)，5 天(图 2，C5)，10 天(图 2，C10)和 15 天(图 2，C15)后的双向凝胶电泳0-腿)图谱可以看出，使用本发明方法保存的蛋白样品，蛋白点聚的很好， 没有拖尾现象出现，证明蛋白样品在此方法下保存，样品的质量没有发生改变，可以把此发明方法用在蛋白质组学研究中。为了进一步确定此发明方法的MS兼容性，本申请发明人从过饱和硫酸铵甲醇溶液中保存了 15天的胶乳C-乳清的2-DE(图2，C15)上切取了染色后的ー些蛋白点，11个代表性的蛋白点通过MALDI TOF MS鉴定，并且进一步通过T0F/T0F MS/MS确定，结果见表 1。来自全胶乳C-乳清的蛋白(点α97)的质谱结果的肽指纹图谱在图4中被显示出来， 捜索结果显示这是酯酶蛋白(Esterase)(表1)。正如图4中看到的，这些相匹配的肽段有很低的噪音背景，说明肽指纹图谱PMF和离子碎片谱图(PFF)的质量很高。在鉴定的11个蛋白点中，每种蛋白都获得了较高的捜索分数，1个蛋白点(点 C258)被鉴定出来是14-3-3蛋白，1个蛋白点(点C2004)被鉴定出来是胶乳过敏原(latex protein allergen Hev b 7)(表1)。这些蛋白都是胶乳中C-乳清特有的蛋白，许多另一些胶乳中的蛋白也被明确的鉴定出来了(表1)，这说明本发明的蛋白保存方法不仅能得到好的2-DE图谱，同时具有很好的质谱兼容性，为蛋白质组学研究提供了一定的帮助。表1胶乳中C-乳清蛋白的MALDI T0F/T0F MS/MS鉴定结果
权利要求
1.ー种常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，其特征是将蛋白样品溶于Tris-饱和酚中，取酚相置于过饱和硫酸铵甲醇溶液中沉淀出蛋白，并将沉淀出来的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在常温下进行长期保存即可。
2.根据权利要求1所述的常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，其特征是所述的蛋白样品为蛋白样品的粗提物或市售的蛋白样品。
3.根据权利要求1或2所述的常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，其特征是所述Tris-饱和酚的pH值彡7. 8。
4.根据权利要求1所述的常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，其特征是所述酚相与过饱和硫酸铵甲醇溶液的体积比为1 1 10。
5.根据权利要求1所述的常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，其特征是将蛋白样品溶于Tris-饱和酚中，取酚相置于过饱和硫酸铵甲醇溶液中沉淀出蛋白，并将沉淀出来的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在常温下保存1 15天。
全文摘要
本发明公开了一种常温保存蛋白质组学用蛋白样品的方法，将蛋白样品溶于Tris-饱和酚中，取酚相置于过饱和硫酸铵甲醇溶液中沉淀出蛋白，并将沉淀出来的蛋白于过饱和硫酸铵甲醇溶液中在常温下进行长期保存，所述的蛋白样品包括蛋白样品的粗提物或市售的蛋白样品。该保存方法可以使蛋白样品在常温下保存长达半个月，在低温下如-20℃以下可以保存一年，甚至更久，经1-DE和2-DE的结果发现，按本发明方法保存的蛋白样品的质量很好，同时具有很好的质谱兼容性，并且运输方便。
文档编号G01N1/28GK102539215SQ20121006776
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者常丽丽, 王丹, 王旭初, 王海燕, 郭安平 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所