专利名称：一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法
技术领域：
本发明涉及细菌内毒素的测定方法，特别提供了一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的标准。
细菌内毒素(Bacterial Endotoxin)是革兰氏阴性细菌所产生的具有各种生物活性的大分子物质，其主要化学成分为脂多糖(LPS)。内毒素是注射剂药品(原料等)中的主要污染物质。
细菌内毒素的检测方法有家兔试验法、鲎试验法。鲎试验法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL)是利用鲎试剂与内毒素发生凝集反应的原理，定性或定量检测药品或机体血液中细菌内毒素感染程度的一种体外检测方法。具体作法又分为凝胶法和定量法。
凝胶法就是一种定性、限量测定内毒素的方法。其原理是在专用的试管中将内毒素样品与鲎试剂等量混合，保温反应，当内毒素与鲎试剂中的C因子发生反应后，激活凝固酶原，切断凝固蛋白原特定位置的精氨酸肽键，形成凝固蛋白从而产生凝胶。中国药典2000年附录中对于细菌内毒素检查法的规定，就是依据此方法，用来判定供试品中内毒素的限量是否符合规定，需要实验者目测是否出现凝胶来判定阴、阳性结果，实验本身工作量较大，且易出现人为误差。
定量法是利用动态比浊法的原理，即在内毒素与鲎试剂反应过程中，采用专用仪器检测记录其浊度变化，预设一个浊度值，当浊度值变化到该预设值时所需的时间作为特征反应时间，该特征反应时间的对数与内毒素浓度的对数呈线性关系。此方法要求标准曲线的重复性好。
目前凝胶法和定量法两种方法之间还没有比较明确的对应关系，药检机构和生产商在实际工作中主要采用凝胶法，依靠人工进行检查，费时、费力、人为干扰因素较多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的标准方法，该方法操作简便、检测结果准确。
本发明提供了一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法，其特征在于——将供试品与鲎试剂等比混合(体积)，反应温度为37.0±1℃，反应时间为60±1分钟；——检测浊度值，浊度值定义为A0’＝-lg(It/I0’)，其中I’0为初始透射光强度，It为检测时透射光强度；——浊度值大于等于0.055时，为阳性结果；浊度值小于0.055时，为阴性结果。
本发明通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法中，对所用的检测仪器要求不是非常严格，所述供试品与鲎试剂的反应在试管中进行，反应液的总体积为0.2毫升至0.7毫升。所采用的试管，其内径可以在5.4毫米至10.2毫米之间。检测浊度值的检测波长范围在400至700nm之间。最好为660nm。
另外本发明通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法中，对试剂的要求也不是很高，所采用的鲎试剂，其灵敏度可为0.015-0.5EU/ml。
本发明的需要检测的关键参数浊度值定义为A0’＝-lg(It/I0’)，其中I’0为初始透射光强度，It为检测时透射光强度，浊度值与入射光强度无关，因此消除了测定管尺寸、反应体系初始状态的影响。另外，该参数可以容易地通过很多现有的技术手段测量实现，还可以通过专门的仪器来测量实现，减少了人工目测判断凝胶与否的误差，提高了结果的准确性；可望替代常规凝胶法进行细菌内毒素的检查，用于药品质量控制和制剂的生产过程监控等。
图1为反应体系浊度值变化示意。
具体实施例方式常规的细菌内毒素限量的测定方法是首先需要进行供试品干扰试验，将细菌内毒素工作标准品稀释到2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ浓度，每一稀释液做4管(10mm内径试管)，轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中。保温60±2分钟待观察结果，另取内毒素检查用水和供试品稀释液，各做2支阴性对照管。其最高浓度2.0λ的4管应均为阳性，最低浓度0.25λ的4管应均为阴性，且阴性对照管均为阴性时，则无干扰。可根据供试品内毒素限量选择合适灵敏度的鲎试剂，依照上述方法做试验来检查供试品内毒素是否超出限量。
本发明通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法是，在内毒素测定仪上，测定含内毒素样品与鲎试剂反应体系的浊度值，当反应时间为60分钟，浊度值大于等于0.055时，为阳性结果；浊度值小于0.055时，为阴性结果。
实施例1.
常规凝胶法的操作步骤是将供试品与鲎试剂等比混合于专用试管中，体积为0.2ml，混匀，封闭管口，置37±1℃水浴中，保温60±2分钟，取出试管缓缓倒转180度，观察结果。当试管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性结果；凝胶不能保持完整，并从管壁滑脱者为阴性结果。
在内毒素测定仪上，将供试品与鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，鲎试剂灵敏度为0.06EU/ml，供试品为标准内毒素溶液，浓度为0、0.03、0.06、0.12EU/ml，检测时间达60分钟时，其对应的浊度值分别为0.005、0.024、0.055和0.090；该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.005和0.024时，凝胶法的结果为阴性；浊度值为0.055和0.090时，凝胶法的结果为阳性。
实施例2.
在内毒素测定仪上将供试品与鲎试剂等比混合于5.4mm内径平底试管，反应温度为37.2℃，反应总体积为0.3ml，鲎试剂灵敏度为0.5EU/ml，供试品为含有内毒素的去离子水，反应时间达15分钟时，检测其对应的浊度值为0.063；该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.063，凝胶法的结果为阳性。
实施例3.
在内毒素测定仪上将供试品与鲎试剂等比混合于采用5.4mm内径平底试管，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，鲎试剂灵敏度为0.03EU/ml，供试品为浓度为0.24EU/ml标准内毒素水溶液，检测时间达60分钟时，其对应的浊度值为0.07；该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.07，凝胶法的结果为阳性。
实施例4.
在内毒素测定仪上将供试品与鲎试剂等比混合于采用7mm内径平底试管，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.5ml，鲎试剂灵敏度为0.03EU/ml，供试品为含有内毒素的去离子水，当检测时间达25分钟时，其浊度值为0.063时，采用分光光度计对其在400、600和700mm三个检测波长下进行测定，结果吸光度值分别为0.444、0.166和0.151。该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.063时，凝胶法的结果为阳性。
实施例5.
采用分光光度计，在22.℃的室温下，采用10.2mm内径的试管作为反应测定管，供试品为含有内毒素的去离子水样品，鲎试剂灵敏度为0.5EU/ml，测定体系体积为0.7ml，供试品与鲎试剂的比例为1∶1，检测波长设定为660mm，测定其吸光度值，85分钟时，吸光度值为0.124。
在内毒素测定仪上将供试品与鲎试剂等比混合于采用7mm内径平底试管，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.7ml，鲎试剂灵敏度为0.5EU/ml，检测时间达85分钟时，其对应的浊度值为0.10。该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.10时，凝胶法的结果为阳性。
实施例6.
在内毒素测定仪上，将1.5mg/ml的克林霉素磷酸酯氯化钠注射液与鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管，反应温度为37.0℃，鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml，反应体积0.3ml，60分钟时，测定浊度值为0.004。同时该供试品与鲎试剂依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.004时，凝胶法的结果为阴性。
实施例7.
在内毒素测定仪上将供试品与鲎试剂等比混合于5.4mm内径平底试管，反应温度为37.0℃，反应总体积为0.2ml，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，供试品为含有内毒素的去离子水，检测时间达60分钟时，其对应的浊度值为0.14；该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.14时，凝胶法的结果为阳性。
实施例7在内毒素测定仪上将供试品与鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管，反应温度为37.0℃，反应总体积为0.3ml，鲎试剂灵敏度为0.06EU/ml，供试品为氯化钠水溶液，浓度为140mM，检测时间达60分钟时，其对应的浊度值为0.004；该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.004时，凝胶法的结果为阴性。
实施例8在内毒素测定仪上将供试品与鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管，反应温度为37.5℃，反应总体积为0.3ml，鲎试剂灵敏度为0.015EU/ml，供试品为无热源水，检测时间达60分钟时，其对应的浊度值为0.003；该供试品与鲎试剂同时依照凝胶法做平行对照检测，结果表明浊度值为0.003时，凝胶法的结果为阴性。
权利要求
1.一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法，其特征在于——将供试品与鲎试剂等比混合，反应温度为37.0±1℃，反应时间为60±1分钟；——检测浊度值，浊度值定义为A0’＝-lg(Ig/I0’)，其中I0’为初始透射光强度，It为检测时透射光强度；——浊度值大于等于0.055时，为阳性结果；浊度值小于0.055时，为阴性结果。
2.按照权利要求1所述的一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法，其特征在于所述供试品与鲎试剂的反应在试管中进行，反应液的总体积为0.2毫升至0.7毫升。
3.按照权利要求2所述的一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法，其特征在于所采用的鲎试剂，其灵敏度可为0.015-0.5EU/ml。
4.按照权利要求2所述的一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法，其特征在于所采用的试管，其内径为5.4毫米至10.2毫米。
5.按照权利要求1所述的一种通过测定浊度值来确定内毒素限量的方法，其特征在于检测浊度值的检测波长范围在400至700nm之间。
6.按照权利要求1所述的一种通过测定浊度值来确定内毒素限量的方法，其特征在于检测浊度值的检测波长为660nm。
全文摘要
一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法，其特征在于将供试品与鲎试剂等比混合，反应温度为37.0±1℃，反应时间为60±1分钟；检测浊度值，浊度值定义为A
文档编号G01N33/52GK1715925SQ20041002088
公开日2006年1月4日 申请日期2004年7月2日 优先权日2004年7月2日
发明者李京华, 岳丽娜, 邵英光, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所
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