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专利名称：一种小动物全脑标本的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种标本的制备方法，特别是涉及一种小动物全脑标本的制备方法。
背景技术：
制作脑部神经元染色标本，观察神经元形态，在临床诊断和科学研究中都应用广泛。它 主要涉及两种技术神经元染色和标本包埋技术。其中神经元染色技术主要包括两类 Golgi-Cox染色，普通染料(如苏木精，亚甲基蓝)染色。包埋技术按包埋剂的不同主要分 为石蜡包埋、火棉胶包埋和树脂包埋等。
根据染色技术和包埋技术的不同组合，目前常用的神经元染色标本制备方法主要有以下 几类
石蜡切片标本临床病理分析通常制作石蜡标本。其主要步骤是标本整体石蜡包埋， 再切片，然后使用普通染料对切片染色，最后装裱切片。
火棉胶全脑标本其主要步骤是标本先整体Golgi-Cox染色，再整体火棉胶包埋。
树脂切片标本其主要步骤是标本整体树脂包埋，再半薄切片，然后使用美蓝-品红 等染料对切片进行染色，最后装裱切片。
以上各方法的主要性能参数如表l所示
表l
标本 制作流程 石蜡切片标本 整体包埋，切片后染
色
火棉胶全脑标本 整体染色，再包埋
染色方法 包埋剂切片厚度(微米)
染料染色 石蜡 4-20
Golgi-Cox法 火棉胶
5—200树脂切片标本 整体包埋，切片后染色染料染色 树脂 0.5-2
以上方法能满足很多需要，但有以下不足无法在三个方向以相同的亚微米级分辨率观
察全脑神经元三维形态。石蜡标本和火棉胶标本的切片较厚，观察神经元三维形态时，纵向
分辨率(5微米)远低于横向分辨率(亚微米)。树脂切片标本虽然能获得亚微米切片，但 是制作的标本不是全脑标本，且染色方法仅仅只染神经元胞体而不染神经元的树突和轴突， 因此无法观察全脑神经元的完整形态。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种小动物全脑标本的制备方法，可以染较多神经元， 能同时染神经元胞体、树突和轴突，对比度高，不易褪色，能够在亚微米尺度观察全脑神经 元三维形态结构。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种小动物全脑标本的制备方法，其包括如下步骤
a取小动物脑样本，将小动物深度麻醉，断头处死，取脑，脑样本可以为取自大鼠、小 鼠、青蛙、兔、猫等的全脑，也可以为脑的一部分，将其固定浸染； b将固定染色后的脑样本黑化，所用黑化液为PH值大于10的碱液； c将上述得到的脑样本进行脱水，包括100 %重量脱水剂脱水；
d将黑化后的脑样本采用包埋剂进行浸胶，包括连续两次100%重量的包埋剂浸胶； e将经包埋剂浸胶后的脑样本放入包埋盒中，加入100%重量包埋剂浸没脑样本； f将浸没脑样本的包埋盒加热，使包埋剂聚合，聚合温度为35 8(TC，聚合时间为6小 时 4天。
上述制备方法，其中，所述步骤b和c之间还包括步骤bl将黑化后的脑样本用流水冲洗 ，冲洗时间为O. 5 24小时。
上述制备方法，其中，固定液可以为Golgi-Cox法固定液，也可采用钨酸盐改良Cox法固 定液，所述固定液的组成为
升汞 0. 1% 10%重量
重铬酸钾0. 1% 10%重量
铬酸钾 0. 1% 10%重量
钨酸钠或钨酸钾0% 10%重量
5蒸馏水 余量。
上述制备方法，其中，所述步骤a中固定浸染在l 2天后换固定液一次，之后每隔20 30天换固定液一次，至少换液3次，固定浸染的温度为0 10(TC。
上述制备方法，其中，所述步骤b中，所述黑化液为氢氧化锂、氨水、氢氧化钠或氢氧 化钾。
上述制备方法，其中，所述步骤c中所用脱水剂为酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、蔗糖 或它们的组合。
上述制备方法，其中，所述步骤c中脱水为采用不同浓度的脱水剂进行梯度脱水，之后 采用100%重量脱水剂脱水，各浓度脱水剂的脱水时间为O. 5 12小时，采用梯度脱水可以有 效防止标本的变形，采用越密集的梯度越有利于防止变形，如果不关心变形，可以不采用梯 度脱水，直接进行100%重量脱水。
上述制备方法，其中，所述步骤d或e中所用包埋剂为SPURR环氧树脂包埋剂，也可以采 用环氧树脂618和环氧树脂812包埋剂，这几种包埋剂均为市场上可以买到的包埋剂。
上述制备方法，其中，所述步骤d中采用不同浓度的包埋剂进行梯度包埋剂浸胶，之后 采用100%重量包埋剂浸胶，浸胶温度为室温，各浓度包埋剂的浸胶时间为O. 5 12小时，采 用梯度包埋剂浸胶可以有效防止标本的变形，采用越密集的梯度越有利于防止变形，如果不 关心变形问题，可以不采用梯度包埋剂浸胶，直接进行100%重量包埋剂浸胶。
上述制备方法，其中，在所述步骤a固定浸染之后和所述步骤c的100X重量脱水剂脱水 前，采用普通染料对脑样本进行复染，即可以在固定染色后黑化前进行复染，可以在流水冲 洗前或后复染，可以在梯度脱水过程中进行，例如在进行90%重量脱水剂脱水后100%重量 脱水剂脱水前进行复染，或者，在所述步骤f之后将制得的标本进行切片，再对切片进行普 通染料染色；所述的普通染料为亚甲基蓝、Nissl染色液、苏木精、伊红、苯胺蓝或中性红
本发明的小动物全脑标本的制备方法，能染较多神经元，能同时染神经元胞体、树突和 轴突，对比度高，不易褪色；制得的标本适合50纳米到100微米各种不同厚度的切片；宏观 上进行全脑整体染色，微观上可实现连续亚微米切片，因此就能横向、纵向都以相同的亚微 米级分辨率观察全脑标本显微结构(如神经元)的三维形态；该方法能制作大量染色的连续 切片，以用于需要批量切片的场合。


图1为本发明实施例2 5的小动物全脑标本的制备流程图2为实施例2的横向分辨率为0. 3微米*0. 3微米，厚度为O. 3微米的鼠脑切片局部图像。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例详细描述本发明。 实施例l
1、 取材取成年小鼠，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、 固定、染色新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为(TC，染色90天，定 期换新液，固定l天后换液一次，以后每隔20天换液一次，至少换液3次，固定液配方为
升汞 7%重量 重铬酸钾 7%重量 铬酸钾 5%重量 蒸馏水 81%重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗 处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、 黑化把染色后的全脑样本浸入PH值大于10的氢氧化锂中24小时，脑样本变为墨绿
色；
4、 梯度脱水脑样本依次经50% (重量)酒精，70% (重量)酒精，85% (重量)酒精 ，95% (重量)酒精，100% (重量)酒精，100%酒精丙酮(重量比1:1)， 100%重量丙酮脱 水各2小时，然后在100%重量丙酮中脱水12小时；
5、 浸胶标本依次经50%重量包埋剂，75%重量包埋剂，和连续两次100%重量包埋剂室 温下浸胶各8小时，包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: 7. 6重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
6、 包埋把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋剂，浸没脑样
本；
7、 聚合把浸没脑样本的包埋盒置于6(TC烘箱中加热36小时，聚合完毕把标本放到干 燥器中静置待其冷却。实施例2
1、 取材取成年小鼠，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、 固定、染色新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为25。C，染色120天， 定期换新液，固定2天后换液一次，以后每隔25天换液一次，至少换液3次，固定液配方为
升汞 10%重量 重铬酸钾 10%重量 铬酸钾 10%重量 钨酸钠 5%重量 蒸馏水 65%重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗 处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、 黑化把染色后的全脑样本浸入PH值大于10的氢氧化钠中12小时，脑样本变为墨绿
色；
4、 流水冲洗将脑样本用流水冲洗24小时；
5、 梯度脱水脑样本依次经20% (重量)酒精，30% (重量)酒精，50% (重量)酒精 ，70% (重量)酒精，100% (重量)酒精，脱水各0.5小时，之后再用100% (重量)酒精 脱水10小时；
6、 浸胶标本依次经30%重量包埋剂，50%重量包埋剂，70%重量包埋剂，和100%重量 包埋剂室温下浸胶各O. 5小时，之后再在100%重量包埋剂中室温下浸胶12小时，包埋剂采用 spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: 6重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
7、 包埋把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋剂，浸没脑样
本；
8、 聚合把浸没脑样本的包埋盒置于8(TC烘箱中加热6小时，聚合完毕把标本放到干燥 器中静置待其冷却。
图2为本实施例的横向分辨率为0. 3微米*0. 3微米，厚度为O. 3微米的鼠脑切片局部图像实施例3
1、 取材取青蛙，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、 固定、染色新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为5(TC，染色120天， 定期换新液，固定2天后换液一次，以后每隔30天换液一次，至少换液3次，固定液配方为
升汞 0. 1%重量
重铬酸钾 1.5%重量 铬酸钾 1%重量 钨酸钾 0. 1%重量
蒸馏水 97. 3%重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗 处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、 黑化把染色后的全脑样本浸入PH值大于10的氨水中1小时，脑样本变为墨绿色；
4、 流水冲洗将脑样本用流水冲洗O. 5小时；
5、 梯度脱水脑样本依次经10% (重量)正丁醇，30% (重量)正丁醇，50% (重量) 正丁醇，70% (重量)正丁醇，100% (重量)正丁醇，脱水各5小时，之后再用100% (重
量)正丁醇脱水12小时；
6、 浸胶脑样本依次经20%重量包埋剂，40%重量包埋剂，60%重量包埋剂，80%重量 包埋剂和100%重量包埋剂室温下浸胶各2小时，之后再在100 %重量包埋剂中室温下浸胶10小 时，包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: IO重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
7、 包埋把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋剂，浸没脑样
本；
8、 聚合把浸没脑样本的包埋盒置于35。C烘箱中加热96小时，聚合完毕把标本放到干 燥器中静置待其冷却；
9、 将得到的标本切片，用普通染料亚甲基篮溶液对标本进行复染。 实施例4
1、取材取成年大鼠，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
92、 固定、染色新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为10(TC，染色100天
，定期换新液，固定l天后换液一次，以后每隔30天换液一次，至少换液3次，固定液配方为
升汞 2%重量 重铬酸钾 0. 1%重量
铬酸钾 0. 1%重量
钨酸钾 0. 8%重量
蒸馏水 97%重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗 处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、 复染用普通染料苏木精对上述脑样本进行复染；
4、 黑化把复染后的脑样本浸入PH值大于10的氢氧化钾中15小时，脑样本变为墨绿色
5、 流水冲洗将脑样本用流水冲洗2小时；
6、 脱水脑样本经连续两次100% (重量)叔丁醇脱水12小时；
7、 浸胶脑样本经连续两次100%重量包埋剂室温下浸胶12小时，包埋剂采用spurr环
氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方 ERL-4221: IO重量份 DER-736: 8. 5重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
8、 包埋把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋剂，浸没脑样
本；
9、 聚合把浸没脑样本的包埋盒置于5(TC烘箱中加热80小时，聚合完毕把标本放到干 燥器中静置待其冷却。
实施例5
1、 取材取成年兔，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、 固定、染色新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为25。C，染色90天， 定期换新液，固定2天后换液一次，以后每隔20天换液一次，至少换液3次，固定液配方为
升汞 10%重量重铬酸钾 5%重量 铬酸钾 8%重量 钨酸钾 10%重量 蒸馏水 67%重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗 处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、 黑化把复染后的脑样本浸入PH值大于10的氢氧化锂中20小时，脑样本变为墨绿色
4、 流水冲洗将脑样本用流水冲洗24小时；
5、 梯度脱水脑样本依次经10% (重量)丙酮，30% (重量)丙酮，50% (重量)丙酮 ，70% (重量)丙酮，脱水各2小时，之后用普通染料苯胺蓝对脑样本进行复染，之后再经
连续两次100% (重量)正丁醇脱水12小时；
6、 浸胶脑样本依次经40%重量包埋剂，55%重量包埋剂，70%重量包埋剂，85%重量 包埋剂和100%重量包埋剂室温下浸胶各4小时，之后再在100%包埋剂中室温下浸胶12小时， 包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: 7. l重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
7、 包埋把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋剂，浸没脑样
本；
8、 聚合:把浸没脑样本的包埋盒置于6(TC烘箱中加热45小时，聚合完毕把标本放到干燥器 中静置待其冷却。
权利要求
权利要求1一种小动物全脑标本的制备方法，其包括如下步骤a取小动物脑样本，将其固定浸染；b将固定染色后的脑样本黑化，所用黑化液为PH值大于10的碱液，黑化时间为1～24小时；c将上述得到的脑样本进行脱水，包括100％重量脱水剂脱水；d将黑化后的脑样本采用包埋剂进行浸胶，包括连续两次100％重量的包埋剂浸胶；e将经包埋剂浸胶后的脑样本放入包埋盒中，加入100％重量包埋剂浸没脑样本；f将浸没脑样本的包埋盒加热，使包埋剂聚合，聚合温度为35～80℃，聚合时间为6小时～96小时。
2.如权利要求l所述的制备方法，其中，所述步骤b和c之间还包括步 骤bl将黑化后的脑样本用流水冲洗，冲洗时间为O. 5 24小时。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤a中固定浸染的 固定液的组成为升汞 0. 1% 10%重量重铬酸钾 0. 1% 10%重量 铬酸钾 0. 1% 10%重量钨酸钠或钨酸钾0% 10%重量 蒸馏水 余量。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤a中固定浸染在1 2天后换固定液一次，之后每隔20 30天换固定液一次，至少换液3次，固定浸染的温度为0 100。C。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤b中，所述黑化 液为氢氧化锂、氨水、氢氧化钠或氢氧化钾。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤c中所用脱水剂 为酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、蔗糖或它们的组合。
7.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤c中脱水为采用 不同浓度的脱水剂进行梯度脱水，之后采用100%重量脱水剂脱水，各浓度脱水剂的脱水时 间为O. 5 12小时。
8.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤d或e中所用包 埋剂为SPURR环氧树脂包埋剂。
9.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤d中采用不同浓 度的包埋剂进行梯度包埋剂浸胶，之后采用100%重量包埋剂浸胶，各浓度包埋剂的浸胶时 间为O. 5 12小时。
10.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，在所述步骤a固定浸染 之后和所述步骤c的100X重量脱水剂脱水前，采用普通染料对脑样本进行复染，或者，在所 述步骤f之后将制得的标本进行切片，再对切片进行普通染料染色；所述的普通染料为亚甲 基蓝、Nissl染色液、苏木精、伊红、苯胺蓝或中性红。
全文摘要
本发明公开一种小动物全脑标本的制备方法，其包括如下步骤a.取小动物脑样本，将其固定浸染；b.将固定染色后的脑样本黑化，所用黑化液为pH值大于10的碱液，黑化时间为1～24小时；c.将上述得到的脑样本进行脱水，包括100％重量脱水剂脱水；d.将黑化后的脑样本采用包埋剂进行浸胶，包括连续两次100％重量的包埋剂浸胶；e.将经包埋剂浸胶后的脑样本放入包埋盒中，加入100％重量包埋剂浸没脑样本；f将浸没脑样本的包埋盒加热，使包埋剂聚合，聚合温度为35～80℃，聚合时间为6小时～96小时。本发明的小动物全脑标本的制备方法可以染较多神经元，能同时染神经元胞体、树突和轴突，对比度高，不易褪色，能够在亚微米尺度观察全脑神经元三维形态结构。
文档编号G01N1/30GK101458182SQ20081030643
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者斌 张, 李安安, 王冰然, 骆清铭, 辉 龚 申请人:华中科技大学