专利名称：截短tau蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及在阿耳茨海默氏病及相关疾病中特异发现的N端和C端截短患病形式的tau蛋白。
本发明还涉及用于筛选和测试有效抑制、中和和消除N端和C端双重截短tau蛋白或预防其形成的潜在药物的方法，以及用于筛选和测试其作用模式以中和由所述双重截短患病形式tau蛋白引起的微管装配和/或动力学改变为基础的潜在药物的方法。
阿耳茨海默氏病是痴呆的最常见原因。在少于5％的病例中，阿耳茨海默氏病与淀粉状前体蛋白、早衰素(presenilin)-1、或早衰素-2基因中的一种或多种特定突变几乎完全共分离(1)；而在超过95％的病例中，尚不清楚确切的病因。
与病因无关，阿耳茨海默氏病的组织病理学特征是存在具有配对螺旋细丝(PHF)的神经原纤维缠结的大量神经元和作为大脑中老年斑主要成分的β-淀粉状蛋白的胞外沉积。尽管现在还不知道阿耳茨海默氏病的这两个标志性损伤之间直接相互关系(如果有的话)的确切本质，但是神经原纤维变性的存在似乎是疾病的临床表现即痴呆所必需的(2、3、4)。神经原纤维变性的存在表现为神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle)、营养不良神经突、和神经细丝(neuropilthread)。这些结构的主要蛋白质亚基是微管相关蛋白tau(5、6)。
在健康人大脑中，tau存在通过衍生自单一基因座的转录本的可变mRNA剪接生成的六种蛋白质同种型(isoform)。tau蛋白的不同之处在于它们在分子的C末端附近是包含三个(t3L、t3S、或t3)还是四个(t4L、t4S、或t4)32或32个氨基酸的微管结合结构域(重复，R)，而且在N端部分包含两个(t3L、t4L)、一个(t3S、t4S)、或零个(t3、t4)29个氨基酸的插入片段(7、8)。在生理条件下，tau蛋白参与微管的装配、空间组织、稳定和行为。在生理条件下，健康人大脑中存在该蛋白质的六种同种型。然而，在AD中，已知tau蛋白经历许多不同的翻译后修饰(超磷酸化、便在化、糖基化)。关于tau基因中特定突变和与17号染色体连锁的帕金森氏病额颞痴呆疾病(FTDP-17)的共分离的最近发现证实了tau蛋白中的某些异�？赡苁腔疾「鎏逯猩窬湫院统沾舻闹饕�(9、10)。还不知道导致阿耳茨海默氏病中tau修饰和配对螺旋细丝(PHF)形成的分子事件。这解释了大量病理学事件诸如tau蛋白的病理性再分布、轴突转运失败、或维持轴突微管功能失败的观察结果(11、12、13)。至今，最近发现任何蛋白质都能在体外形成细丝(14)质疑PHF细丝形成在阿耳茨海默氏病中的重要性。
许多作者认为阿耳茨海默氏病中配对螺旋细丝的形成代表以异常磷酸化为基础的神经原纤维病理学的主要事件。PHF装配的tau蛋白以磷酸化依赖的方式与某些抗体发生反应，说明特定的磷酸化状况(15、16)。另外，观察到PHF衍生的tau蛋白在SDS凝胶中显示电泳迁移率降低，这可能与它的磷酸化模式有关(Steiner等人，EMBO J.，93539-3544，1990)。类似的，有人提出PHF衍生tau因磷酸化而相对于正常tau蛋白具有较低的微管亲和力，因为当正常tau在体外通过某些激酶磷酸化时发现相似作用(17、18)。tau是最易溶解的已知蛋白质之一(19、20、21)，因此它在阿耳茨海默氏病中的聚集特别神秘。另一方面，还不知道导致阿耳茨海默氏病中细丝形成的tau蛋白修饰方式的机制。tau的磷酸化影响tau形成聚集体的潜力，对微管聚合产生刺激性或抑制性作用，这可能依赖磷酸化位点(22-27)。许多体外研究证明在存在还原剂二硫苏糖醇(DTT)、不饱和游离脂肪酸、RNA或葡糖胺聚糖时，正常tau可以转变成细丝(28-31、38)。另外，细丝形成过程还可以通过由Cys322氧化生成的交联tau的存在得到加速(32)。在不同细丝装配研究中变化的参数，包括tau蛋白浓度、pH和离子强度，比生理条件下的细胞质水平高许多倍。扫描透射电子显微镜术(STEM)对体外形成tau细丝的检验显示，这些细丝与天然的配对螺旋细丝不同(33)。在缺乏聚糖或RNA时，在含有未磷酸化(ubiquitination)或磷酸化野生型tau的样品中检测不到PHF样细丝。此外，有人提出磷酸化在阿耳茨海默氏病中可能发挥保护作用(34)。对于便在化和糖基化，提出了导致PHF装配的tau修饰导致微管分解并干扰重要的神经元过程诸如轴突转运的类似建议(30、35、36、37)。然而，上述翻译后修饰都不能独自提供关于导致其与阿耳茨海默氏病临床表现有关的机能失调的tau变化起动的分子解释。
因此，仍然不清楚上述哪种tau修饰涉及阿耳茨海默氏病的发病机理。
至今尚未获得关于导致早期tau蛋白复合物形成的翻译后事件的模式或调控的可靠资料。为了预防这些复合物的形成和为了中和其任何相关病理作用，需要阐明患病tau的精确分子本质和正常tau转变成其N端和C端双重截短形式的调控机制。这一详细知识将能够构建用于阿耳茨海默氏治疗学和诊断学的工具。
Zelman等人(J.P.Neurochem.，72(2)741-750，1999)提出微管结合蛋白tau的切割产物存在于外伤性脑损伤个体的脑脊髓液中并反映了神经元损伤。然而，在此报告中没有做出与阿耳茨海默氏病的联系。
Novak(Acta Virologica，38173-189，1994)在关于“tau介子”的这篇综述中报告了用广谱蛋白酶“链霉蛋白酶(pronase)”人工生成的PHF(“配对螺旋细丝”)的最低蛋白酶抗性单位。
Kontsekova等人(J.Immunol.Meth.，185245-248，1995)公开了用于免疫分析的重组人截短tau蛋白的快速纯化方法，其中利用了人tau蛋白的热抵抗力。其中使用的重组tau类似物的结构或生物特性或功能都未有描述。
在Novak等人(EMBO J.，12(1)365-370，1993)中，在体外人工制备了配对螺旋细丝(PHF核心)，其中通过蛋白酶链霉蛋白酶的体外消化回收了最小的蛋白酶抗性tau单位。使用单克隆抗体MN423检测该最小的蛋白酶抗性tau单位。然而，此文中描述的tau多肽不具有与“真实世界”tau蛋白共同的生物结构性病理特性，尤其是与阿耳茨海默氏病有关的tau蛋白。
Fasulo等人(Alzheimer′s Research，2(5)195-200，1996)报告了PHF核心tau重组类似物的过度表达不足以在配对螺旋细丝中诱发其tau聚集和装配。这些资料与Abraha等人(J.Cell.Science，113(21)3737-3745，2000)的发表物相反，显然是由于此发表物中描述的不常见的非生理学测定系统(来自猴肾的细胞系)。
Fasulo等人(J.Neurochem.，75624-633，2000)描述了诱发凋亡的tau片段。然而，本发明中描述的阿耳茨海默氏病相关tau蛋白都不能诱发凋亡。
Esposito等人(J.Peptide Science，6550-559，2000)描述了tau蛋白的C末端19个氨基酸和正常健康tau蛋白。Novak等人(Chem.Papers，52429-430，1998)和Ugolini等人(NeuroReport，83709-3712，1997)的论文也涉及C末端截短tau蛋白还有凋亡。最近的发表物显示阿耳茨海默氏病与凋亡过程无关。
在Abraha等人(J.Cell Science，113(21)3737-3745，2000)中描述了体外实验以显示tau蛋白单一结构域对细丝形成的贡献。因此，装配了在体外生成的一组重组tau分子。没有生成或测定这些蛋白质在细菌中的生物学或病理学活性。此外，此论文中没有描述关于衍生自阿耳茨海默氏病患者大脑的tau蛋白的资料。
在Jicha等人(J.Neuroscience Research，55713-723，1999)中描述了对单克隆抗体Alz50和MC-1的表位的分子分析。这两种抗体都依赖tau分子的功能性N末端，尤其是第7-9位氨基酸。此文件中没有提及tau截短。
Brandt等人(J.Biol.Chem.，2683414-3419，1993)分析了正常健康人tau蛋白的不同结构域。为此，在细菌中生成了重组tau片段。然而，此文件中没有描述阿耳茨海默氏相关截短tau片段。
Philippe等人(J.Neuroscience Research，46709-719，1996)公开了抗淀粉状前体蛋白单克隆抗体。作者描述了tau反应性抗体的生成，尽管这种抗体最初是针对淀粉状前体蛋白而生成的。此文件中没有描述病理学相关阿耳茨海默氏tau片段。
WO 94/18560 A1公开了用于在脑脊髓液中检测人tau蛋白的免疫测定法，用于检测细胞中枢神经细胞病患者。此测定法不能鉴别正常tau与中枢神经细胞病患者的tau，但是能够检测样品中tau蛋白的总量。
因此，本发明的一个目标是提供这些与阿耳茨海默氏病神经元病理性机能失调有关的可靠标记。此外，用于确认这些tau衍生多肽的存在并测定其活性的合适工具将是用于阿耳茨海默氏诊断学和治疗学的有用手段。
因此，本发明提供了N端和C端双重截短tau分子，特征在于下列特征(“IA型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前236个N端氨基酸和至少后45个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；-所述分子在体外微管装配实验中阻止正常tau蛋白促进微管装配；且-所述分子在体外微管装配实验中对促进微管装配的所述阻止可以通过针对该分子的特异性抑制性中和单抗来消除。
在下文中，称谓“N端和C端双重截短tau蛋白”用于描述在阿耳茨海默氏病大脑中出现且与阿耳茨海默氏病神经元病理性机能失调密切相关的两类截短tau衍生物。具体而言，这些蛋白质代表了通过修饰微管相关生物学功能诸如微管装配或胞内转运来展现病理功能的一类分子。在下文中，术语“蛋白质复合物”用于由tau和/或双重截短tau蛋白的生理学相关分子组成的同型二聚体、异型二聚体或多聚体复合物形式的N端和C端双重截短tau蛋白。
在用于本文时，术语“tau”指健康人大脑中存在的在它们的微管结合结构域中包含三重复(tau44)和四重复(tau43)的那组最短的天然存在同种型，如先前所述(39、40)tau43(383个氨基酸，缺失外显子2和3(第45-102位)；tau44(352个氨基酸，缺失外显子2、3、和10(分别是第45-102位和第275-307位)。在下文中，术语“野生型tau”与“正常tau蛋白”同义，指衍生自健康大脑的tau蛋白。
合适微管装配实验(或者也常常称为“微管聚合实验”)是例如(19)和(20)中所述。术语“阻止”包括对正常tau促进活性20％或更多，优选50％或更多的任何显著抑制。
依照本发明特别优选的IA型tau分子包含选自SEQ ID NO1-3的氨基酸序列。
另外，本发明提供了N端和C端双重截短tau分子，特征在于下列特征(“IB型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前238个N端氨基酸和至少后40个C端氨基酸或相对于含三重复的tau44而言截短前207个N端氨基酸和至少后50个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；且-所述分子在体外微管装配实验中不阻止野生型tau蛋白促进微管装配。
优选的IB型tau分子的特征是包含选自SEQ ID NO4-10的氨基酸序列。
本发明还提供了N端和C端双重截短tau分子，特征在于下列特征(“IIA型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前68个N端氨基酸和至少后40个C端氨基酸或相对于含三重复的tau44而言截短前68个N端氨基酸和至少后20个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；-所述分子在体外微管装配实验中具有比野生型tau更高的微管装配促进活性；-所述微管装配促进活性可以在体外微管装配实验中通过针对该分子的特异性抑制性中和单抗来消除；且-所述分子的病理活性依赖其由微管聚合促进活性定义的与微管网络的结合。
优选的是，增强的微管装配促进活性是分光光度法测量时比野生型tau高至少20％，尤其是高至少50％。
优选的IIA型tau分子的特征是包含选自SEQ ID NO11-18的氨基酸序列。
此外，本发明提供了N端和C端双重截短tau分子，特征在于下列特征(“IIB型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前68个N端氨基酸和至少后40个C端氨基酸或相对于含三重复的tau44而言截短前68个N端氨基酸和至少后20个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；且-所述分子在体外微管装配实验中具有与野生型tau不同的病理性微管装配促进活性。
依照本发明优选的IIB型tau分子的特征是包含选自SEQ ID NO19和20的氨基酸序列。
依照本发明的新型tau多肽(IA、IB、IIA、和IIB)具有典型且独特的定位特征，因为它们专门位于阿耳茨海默氏患病大脑组织中。此外，这些多肽与未聚合微管蛋白(α/β二聚体)和聚合形式(如微管)的相互作用也是独特的。
依照另一个方面，本发明提供了用于制备依照本发明的分子(IA、IB、IIA、和IIB型)的方法，特征是通过下列步骤a)构建携带双重截短tau分子编码序列的重组原核表达质粒，其中缺失包括至少前236个氨基酸和后40个氨基酸或前68个氨基酸和后20个氨基酸或其组合；b)在容许表达所述N端和C端双重截短tau分子的条件下培养所述细菌；
c)收集细菌，优选通过离心；d)重悬细菌沉淀；e)超声处理所述细菌；f)通过凝胶过滤将所述经过超声处理的细菌分级；并g)通过微管装配实验监测得到的级分的活性，从而鉴定I型和II型tau分子的不同活性。
优选的是，截短如上文关于IA、IB、IIA和IIB型分子的定义。微管装配实验活性优选如上文的定义，尤其是关于IA。
此外，本发明提供了用于制备依照本发明的分子的方法，特征是通过下列步骤a)提供阿耳茨海默氏患病大脑组织；b)将所述患病大脑组织在缓冲液尤其是Tris缓冲液中匀浆；c)将所述经过匀浆的大脑组织进行硫酸铵沉淀；d)重新溶于PIPES缓冲液；e)通过凝胶过滤将所述重新溶解的材料分级；并f)通过微管装配实验监测得到的级分的活性，从而鉴定I型和II型tau分子的不同活性。
微管装配实验活性优选如上文的定义，尤其是关于IA。
本发明还提供了用于测试有效分解(disassembling)IA型分子与微管蛋白的复合物的物质的方法，包括下列步骤a)容许IA型分子与微管蛋白之间形成蛋白质复合物；并b)将蛋白质复合物与待测物质一起保温，并鉴定那些容许野生型tau的微管装配促进能力恢复的物质。
另外，本发明还提供了用于测试在表达野生型tau的细胞系统中有效抑制IA型分子起动与微管蛋白形成复合物的物质的方法，包括下列步骤a)将编码IA型分子的功能基因导入表达正常tau蛋白的细胞，处于合适调控区的控制之下；b)容许IA型分子与微管蛋白分子之间形成蛋白质复合物；
c)将待测物质施加到包含所述复合物的细胞上；并d)检验所述物质对上文定义的IA型生物学活性的效果。本发明还提供了用于将微管体外转变成病理状态的方法，特征是将微管蛋白与IIA型在容许所述IIA型分子与微管相互作用的生理条件下保温而生成病理性微管。
依照另一个方面，本发明提供了用于对能够中和IIA型分子的病理学效果的物质筛选它们消除和/或中和IIA型分子并恢复由II型分子引起的生理性微管参数和功能的特性的方法，包括下列步骤a)在存在IIA型分子和微管蛋白时形成病理性微管；b)将物质、IIA型和微管蛋白的混合物与待筛选物质一起保温；并c)检验在消除由IIA型分子引起的病理性微管形成方面的结果。依照本发明，还提供了用于测试有效抑制IIA型分子在促进异常微管形成中的体内活性和在表达IIA型分子的细胞系统中的功能的物质的方法，包括下列步骤a)将编码IIA型分子的功能基因导入表达野生型tau的细胞，处于合适调控区的控制之下；b)容许IIA型tau分子与微管之间形成复合物，由此所述复合物参与病理性微管的形成；c)将待测物质施加到包含所述复合物的细胞上；并d)检验所述物质对IIA型生物学活性的效果，尤其是对微管网络及其相关功能的修饰。
依照另一个方面，本发明还提供了表达依照本发明的分子(IA、IB、IIA或IIB型)的转基因动物，尤其是IA和/或IIA。
本发明还涉及依照本发明的转基因动物作为阿耳茨海默氏病的动物模型的用途，尤其是用于筛选和测试治疗阿耳茨海默氏病的药物。
通过本发明提供了包含依照本发明的分子(IA、IB、IIA或IIB)尤其是IA和IIA和制药学可接受载体尤其是佐剂的疫苗。
本发明还提供了IA型分子与野生型tau形成复合物起动的抑制剂。这些抑制剂的具体范例是包含结合部分像单克隆抗体DC44的物质，尤其是DC44或其结合片段，诸如Fab，所述DC44以保藏号02060767保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，Porton Down，Salisbury，英国)。
由此，本发明提供了(1)N端和C端截短患病形式的tau蛋白的分子和功能鉴定和表征。这些分子通过修饰微管相关生物学功能诸如微管装配或胞内转运而在阿耳茨海默氏病中发挥它们的病理学功能；(2)对蛋白质表位特异的抗体；(3)中和所述蛋白质的病理学活性的抗体；(4)用于筛选并测试有效抑制、中和和消除N端和C端双重截短tau蛋白或预防其形成的治疗性候选药物(包括抗体)的方法；(5)可用于药物筛选的携带编码各种双重截短tau蛋白的基因构建体作为转基因或转基因组合的动物模型的开发；(6)包含针对所述双重截短tau蛋白和针对它们的起源所涉及的蛋白酶的抑制剂的药物组合物；(7)用于筛选生成N端和C端双重截短tau分子的分子的方法；(8)识别所述分子和/或与其相互作用的诊断性和治疗性组合物；(9)基于所述双重截短蛋白的抗原性的疫苗的开发；(10)涉及所述蛋白质及其表位和/或抗体或其它特异探针且用于阿耳茨海默氏病和与tau病理性变化有关的其它疾病的体外和体内诊断的方法。
因此，本发明涉及专门在阿耳茨海默氏病中存在的N端和C端双重截短形式的病理性tau蛋白及其表位的表征。
蛋白质降解是蛋白质生理性消除过程中发生的常见现象，包括生成各种大小的中间截短产物，通常具有较短半衰期。at蛋白也不例外，它在含野生型tau的健康大脑中经历这种过程。在下文中，术语“野生型at”包括在健康个体的大脑中发现的tau蛋白的所有六种天然存在的同种型形式。在细菌中生成在阿耳茨海默氏患病大脑中发现的各种较短截短形式at，纯化至各种程度，用于探查at蛋白的生理学功能、用于绘制它们的结构域和磷酸化表位、或用于试图理解具有模棱两可结果的阿耳茨海默氏病和其它神经变性疾病中配对螺旋装配的机制的实验(23-27、34、41、42)。普通术语“N端和C端双重截短形式的tau蛋白”指阿耳茨海默氏病中的任何tau蛋白，分子的两个末端都丧失了至少一个氨基酸。贯穿对来自阿耳茨海默氏患病大脑的提取物中双重截短tau的分析，在本发明期间发现这些分子中的一些展示独特的结构和功能特征，从而能够将它们与在阿耳茨海默氏患病大脑组织中发现的其它tau片段鉴别开来。根据这一鉴别提供了新的设计，定义了与健康tau不同的N端和C端双重截短tau分子的两类主要病理性分子I型和II型tau分子。这两类可以各自根据分子结构进一步细分成两个亚类，分别称为IA和B型、IIA和B型。
IA型和IIA型代表通过病理加工生成的衍生自微管相关蛋白tau的患病分子的不同结构和功能类型。N端和C端截短tau分子代表患病分子，衍生自微管相关蛋白tau、且在特定病理过程中出现，是阿耳茨海默氏病的特征。这是所有四类tau衍生蛋白的共同特征。所有类别的其它共同特征是N端和C端截短、它们的神经元内和神经元外定位、以及与正常健康tau的功能区别。
范例SEQ ID NO1-3描述了称为“IA型”的那类分子。这些截短tau分子在担当关键(中枢)活性单位和驱动病理性tau与微管蛋白相互作用方面与正常tau不同。IA型和IB型分子在微管装配中不具有任何促进活性。令人惊讶的是，IA型能够阻止正常tau促进微管装配(实施例1)。不管相似一级序列特征和分子量，IB型在体外不显示这种功能活性(实施例2)。这提示IA型与微管蛋白的强结合活性，从而提供对tau生理学的显性失活效果。因此，IA型分子最有可能引起功能性微管网络的持续慢性神经元损耗，而且参与与阿耳茨海默氏病临床严重性直接有关的神经原纤维结构。出乎意料的是，尽管与IA型分子具有相似分子量和序列，IB型(如SEQ ID NO4-10)不展示IA类成员的病理学活性(见实施例2)。与这些类别相反，IIA型双重截短tau衍生物结合微管并促进它们的病理性装配(实施例3)。在下文中，由IIA型促进的微管称为“病理性微管”。令人惊讶的是，具有相似序列和分子量范围的分子(IIB型)缺乏这些高微管聚合能力。在微管装配实验中，它们发挥的水平与全长tau蛋白看到的相同(见实施例3)。
这两类(IIA和B型)的N端和C端截短tau衍生物在细胞水平干扰轴突转运，导致突触丧失，最终导致阿耳茨海默氏病患者中的神经元机能失调和认知损伤。同时，患病神经元易受各种形式压力的伤害，诸如氧化压力(实施例4)。尽管与IIA型具有相似分子量，IIB型在进行分光光度法测量时额外促进微管装配至使用全长健康tau(野生型tau)看到的水平。
在本发明IA和IB型和IIA和B型的另一个优选实施方案中，可以通过下列步骤获得所述分子的重组形式(a)构建携带所述双重截短tau分子(I和II型)编码序列的重组原核表达质粒；(b)在容许表达N端和C端双重截短tau分子(I和II型)的条件下培养细菌；(c)通过离心收集细菌；(d)将来自500ml培养的细菌沉淀重悬于缓冲液A(20mM PIPESpH6.9、50mM NaCl、1mM EGTA、1mM MgSO4、2mM DTT、0.1mM PMSF)；(e)在冰上超声处理1分钟(3次)，于2℃以45000rpm离心15分钟(转子TLA-120，2，Beckmann Optima TLX)；(f)在Phosphocellulose、或MONO S HR 5/5或5ml HiTrap SPSepharose HP柱上在溶于缓冲液A的线性梯度0-1M NaCl中进行层析，通过SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定得到的蛋白质。
在本发明的一个优选实施方案中，所述IA型的N端和C端双重截短成员包含下列氨基酸序列来自四重复tau(tau43)的衍生物将标以R4SEQ ID NO1(239-333，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile
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在本发明的这个实施方案中，所述表位特异位于IA型(SEQ ID NO1-3)和IIA型(SEQ ID NO11-18)成员的一级结构中，而且它们的数目、异质性和特异性取决于各个类别每个成员的特定结构构象并由其添加。因此，每个分子的奇异点不仅依赖其一级结构以及它对微管装配的作用，而且还依赖其构成其表位的二级和三级结构。它们中的一些能够形成特别重要的“构象区”，它们对所述分子的活性贡献巨大。
术语“构象区”在用于本文时指对它的活性有所贡献的分子一个区域的成簇的表位。
在一个特别优选的实施方案中，包含在I型和II型分子中的、包含对应于第239-267位残基(SEQ ID NO1-9和11-14、19 R4)的氨基酸“Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val TyrLys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu”且包含对应于第217-236位残基(SEQ ID NO10、15-18、20 R3)的氨基酸“Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys ValThr Ser Lys Cys Gly Ser Leu”的构象区称为序列“A”。
在本发明的还有一个优选实施方案中，鉴定了所述构象区中的所述表位，并通过缺失诱变测定了它们的相对贡献。通过显示所有这些表位以各种程度对IA型分子的活性有所贡献的突变形式证明了它们的重要性以及它们与对微管的功能的关系(实施例5)。这些各个表位包含下列氨基酸序列Aile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lyspro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu(对应于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-267位残基)。表位缺失突变体具有SEQ ID NO21(268-333，R4；del 239-267)gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys serglu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leuasp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thrhis lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his glyala gluA1ile lys his val pro gly gly gly ser(对应于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-247位残基)。缺失突变体具有SEQ ID NO22(248-333，R4；del 239-247)val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lyscys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln valglu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lysile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lyslys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lysthr asp his gly ala gluA2ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lyspro val asp leu(对应于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-257位残基)。缺失突变体具有SEQ ID NO23(258-333，R4；del 239-257)
ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lyspro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lysasp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his valpro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe argglu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala gluA3ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lyspro val asp leu ser lys val thr ser(对应于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-262位残基)。缺失突变体具有SEQ ID NO24(263-333，R4；del 239-262)lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly glnval glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg val gln serlys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asnlys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn ala lys alalys thr asp his gly ala gluA4ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thrser(对应于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第246-262位残基)。表位缺失突变体具有SEQ ID NO25(239-333，R4；del 248-262)ile lys his val pro gly gly gly lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala gluA5asp leu ser lys val thr ser(对应于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第256-262位残基和SEQ ID NO10、15-18、20中的第225-231位残基，R3)。表位缺失突变体具有SEQ ID NO26(239-333，R4；del 256-262)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly
gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg val glnser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly glyasn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn ala lysala lys thr asp his gly ala gluA6Lys Cys Gly Ser Leu(对应于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第263-267位残基和SEQ ID NO10、15-18、20中的第232-236位残基，R3)。表位缺失突变体具有SEQ ID NO27(239-333，R4；del 263-267)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser gly asn ile his his lys pro glygly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp argval gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro glygly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asnala lys ala lys thr asp his gly ala glu同样可以理解的是，并非肽中的所有氨基酸都必须对特定抗体实际识别的特定位点有所贡献。
在本发明的一个优选实施方案中，所述IA型患病tau蛋白具有下列特性a)所述蛋白质是N端和C端截短的(实施例6)；b)所述蛋白质存在于阿耳茨海默氏患病组织中，而正常健康大脑中缺乏(实施例6)；c)在体外微管装配实验中它们阻止正常tau蛋白促进微管装配(实施例7)；d)在使用正常tau的微管装配实验中，它们的抑制活性可以通过特异性抑制性中和单克隆抗体来消除(实施例11)；e)它们的病理学活性依赖正常健康tau中不存在的氨基酸序列与结构构象的组合(实施例6)；f)所述蛋白质在构象上与正常tau蛋白不同(实施例6)。在一个最优选的实施方案中，本发明涉及IA型的N端和C端截短患病tau形式SEQ ID NO1-3及其“构象区”(序列“A”)和表位A1-A6。
IB型tau蛋白在下列特性方面有所不同a)IB型蛋白是N端和C端截短的(实施例6)；b)所述蛋白质可能存在于正常健康人大脑中；c)在体外微管装配实验中，它们不阻止正常tau蛋白促进微管装配(实施例2和7)；d)它们不显示修饰微管装配的病理学活性(实施例2和7)；e)IB型分子在构象上与正常tau不同(实施例6)。
本发明的另一个实施方案是所述方法(包括多种提取方法，它们中的许多本身是本领域知道的)与关于双重截短形式tau的功能测定法的组合，从而鉴定影响tau和微管功能的其它分子。由大脑提取物获得的tau蛋白可能随着具体大脑组织样品的阶段而在所提取的N端和C端双重截短tau分子的功能性中有所变化(实施例6)。本领域熟练技术人员知道如何将本发明的方法用于多种不同目的，这都属于本发明的范围之内。
在另一个优选实施方案中，本发明尤其涉及SEQ ID NO1作为IA型分子成员的原型。
本发明的还有一个目标是提供用于将正常tau蛋白体外转变成阿耳茨海默氏蛋白的方法，其中将微管蛋白与本发明的IA型分子一起在容许所述微管蛋白与所述IA型分子相互作用的条件下温育。
术语“容许IA型分子或其肽衍生物与微管蛋白相互作用”指容许IA型分子的活性、优选最佳活性的条件。该活性导致与微管蛋白的结合并抑制其在微管装配中的生理性功能。
在另一个实施方案中，IA型分子可以通过其衍生物而得到抑制或中和。正如本发明关于筛选抑制性分子时所述，可以对IA型肽及其衍生物诸如含有缺失或突变的肽测试或筛选它们对微管聚合的作用。
正常tau蛋白可以衍生自天然或重组来源。然而，为了完成本发明的方法，使用重组材料较为有利。
上文所述方法专门提供了足够数量的IA型N端和C端双重截短tau蛋白用于多种目的可以建立新型抑制剂的体外筛选系统，其预防由病理性双重截短tau IA型引起的对微管装配的抑制。
因此，可用于本发明组合物的抑制剂是能够调控IA型分子与微管蛋白的病理性相互作用的任何抑制剂。这种抑制性分子的作用模式由与IA型或正常tau的相互作用组成。
这些“抑制剂”可能对IA型分子所包括的表位是特异的，通过例如阻断表位，或者可能针对IA型分子上的多个结构域，只要它们阻止或扰乱其病理性或生理性活性。可以通过测量正常tau的残余微管装配促进活性而定量抑制效果。作为抑制剂的来源，可以使用确定化学结构和组成的小分子库、肽库、抗体库，或是游离于溶液中，或是展示在噬菌体或细菌或核糖体(核糖体展示)的合成表面的表面上，还有本领域知道的相似技术。
本发明的另一个目标是提供用于测试有效分解IA型复合物的分子和化合物的方法(I型体外测定法)，包括下列步骤a)容许IA型分子或由其衍生的肽与微管蛋白或与IA型分子相互作用的其它分子之间形成蛋白质复合物；b)将蛋白质复合物与待测药物一起保温；c)检验步骤(b)保温在恢复健康tau同种型的微管装配促进活性方面的结果。
本发明的还有一个目标是提供用于测试有效预防或降低对健康tau同种型的正常体外活性的抑制的药物的方法，其包括a)预计待测给定药物联合IA型分子或由其衍生的肽不会干扰正常tau及其体外功能；b)将IA型分子与待测药物一起在存在正常tau和微管蛋白下保温；c)检验步骤(a)和(b)保温在存在或缺乏IA型分子对微管聚合的抑制活性方面的结果(实施例8)。
术语在缺乏所述药物时“容许IA型分子或由其衍生的肽与微管蛋白之间形成复合物”指容许IA型分子与所述微管蛋白相互作用而导致对微管形成的抑制的条件。
本领域熟练技术人员知道如何将本发明的方法用于多种不同目的，这都属于本发明的范围之内。
在另一个方面中，本发明涉及用于测试有效抑制IA型分子在表达tau或tau衍生蛋白的细胞系统中起动复合物形成的药物的方法(I型细胞测定法)，包括下列步骤a)将编码IA型分子的功能基因导入表达正常tau蛋白的细胞，处于合适调控区的控制之下；b)容许IA型分子与微管蛋白分子之间形成蛋白质复合物；c)将待测物质施加到包含所述复合物的细胞上；d)检验所述药物对IA型生物学活性诸如微管结构和功能修饰的作用。
用于步骤(a)的术语“表达tau蛋白的细胞”指有能力由编码IA型分子或其衍生物的基因构建体表达N端和C端双重截短tau形式的细胞。本领域熟练技术人员知道导入编码IA型分子的基因的实验步骤的顺序与本发明方法的目的无关的事实。
所述方法是特别有利的，因为该筛选系统基于连续生长细胞系，这提供了体内状况的相近的情形。此外，胞内定位的IA型分子的充足供应容许筛选有效抑制IA型分子的生物学效果的药物。
在一个优选实施方案中，表达IA型分子的所述细胞是成神经细胞瘤、或嗜铬细胞瘤细胞或衍生自表达IA型分子的转基因动物的神经细胞原代培养物。
称为“II型”的那类分子由N端和C端双重截短tau蛋白分子(如SEQID NO11-20所述序列)组成。这一类的代表位于神经元内和神经元外，而且在功能上与正常健康tau不同。
本发明的这一类蛋白质的发现和分离提供了(1)导致特定微管结合和微管装配异常促进(实施例3)且对其载体造成病理性后果(实施例4)的tau修饰的分子描述和表征；(2)对蛋白质表位特异的抗体和(3)中和所述II型分子的病理学活性的抗体(实施例12)；(4)用于筛选和测试有效抑制、中和和消除所述II型蛋白质的治疗性候选药物的方法或(5)用于筛选和测试有效抑制tau衍生蛋白诸如II型分子形成的治疗性候选药物的方法；(6)可用于药物筛选的携带编码各种N端和C端双重截短tau蛋白的基因构建体作为转基因或转基因组合的动物模型的开发；(7)包含针对所述双重截短tau蛋白的抑制剂及其蛋白酶的药物组合物；(8)识别所述分子和/或与其相互作用的诊断性和治疗性组合物；(9)基于所述双重截短蛋白的疫苗的开发；和(10)涉及所述蛋白质及其表位和/或抗体或其它特异性探针且用于阿耳茨海默氏病和与tau病理性变化有关的其它疾病的体外和体内诊断的方法。
与IA和B型类别相反，IIA型分子在进行分光光度法测量时促进病理性微管装配的水平显著高于由正常健康tau同种型促进的微管装配(分别见实施例1和3)。令人惊讶的是，具有相似序列和分子量范围的N端和C端双重截短tau分子的一个亚类(IIB型)缺乏这些“高”微管聚合能力。在微管装配实验中，这一亚类的分子发挥的水平与全长tau蛋白看到的相同(实施例3)。
因此，本发明涉及在阿耳茨海默氏病中发现的一类新的经修饰tau蛋白，称为IIA型tau蛋白。这一类由N端和C端双重截短tau分子组成(SEQ ID NO11-18)。
术语II型分子指在结构和功能上不仅与正常健康tau而且与IA和IB型tau类别显著不同的那类的成员。这一亚类的分子结合微管并促进它们的病理性装配，比健康tau同种型的正常微管装配显著更高(实施例3)。IIA型N端和C端双重截短tau分子在细胞水平干扰轴突成分的转运，导致突触丧失和神经元功能障碍，最终导致阿耳茨海默氏病神经元中和实验条件下的整个生物体的认知损伤(分别见实施例15和16)。同时，患病神经元易受各种形式压力的伤害，诸如例如氧化压力(实施例4)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述IIA型的N端和C端双重截短成员包含下列氨基酸序列
来自四重复tau(tau43)的衍生物标以R4SEQ ID NO11(69-333，R4)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lysthr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asnval gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro glygly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys valthr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly glygly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg valgln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly glygly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn alalys ala lys thr asp his gly ala gluSEQ ID NO12(93-333，R4)ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln alaasn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr propro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr serser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro serleu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val argthr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr alapro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly serthr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ileasn lys lys leu asp leu ser asn val gln ser lys cys gly ser lysasp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyrlys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu glyasn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glulys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu aspasn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr hislys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly alagluSEQ ID NO13(69-363，R4)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys
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pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly serthr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile valtyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leugly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys serglu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leuasp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thrhis lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his glyala gluSEQ ID NO16(69-302，R3)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lysthr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lysval thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro glygly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp argval gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro glygly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asnala lys ala lys thr asp his gly ala gluSEQ ID NO17(93-332，R3)ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln alaasn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr propro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr serser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro serleu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val argthr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr alapro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly serthr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile valtyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leugly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys serglu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu
asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thrhis lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his glyala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser proarg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val aspSEQ ID NO18(69-332，R3)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lysthr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lysval thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro glygly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp argval gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro glygly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asnala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser proval val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser serthr gly ser ile asp met val asp在本发明的一个优选实施方案中，所述IIB型的N端和C端双重截短成员包含下列氨基酸序列SEQ ID NO19(6-378，R4)gln glu phe glu val met glu asp his ala gly thr tyr gly leu glyasp arg lys asp gln gly gly tyr thr met his gln asp gln glu glyasp thr asp ala gly leu lys ala glu glu ala gly ile gly asp thrpro ser leu glu asp glu ala ala gly his val thr gln ala arg metval ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lysgly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala propro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thrpro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys sergly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro glyser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu prolys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala
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在本发明的一个优选实施方案中，所述IIA型患病tau蛋白具有下列特性a)所述蛋白质是N端和C端截短的(实施例6)；b)是微管装配的有效病理性促进剂(实施例3；图28C)；c)它们的病理性微管装配促进活性可以通过特定化合物来消除，例如抑制性单克隆抗体或其衍生物(实施例12)；d)所述蛋白质不存在于正常健康大脑中(实施例6)；e)显著损伤胞内转运功能(实施例16)；f)它们的病理学活性依赖结合微管网络的高亲和力及其功能损伤(实施例3)；g)它们在构象上与正常tau不同(实施例6)。
在本发明的另一个优选实施方案中，IIB型分子具有下列特性a)所述蛋白是N端和C端截短的；b)在促进微管装配中不如IIA型有效；c)所述蛋白质不存在于正常健康大脑中；d)有可能通过结合微管而损伤其功能，然而程度低于IIA型时观察到的；e)它们在构象上与正常tau不同。
在本发明的还有一个优选实施方案中，以与关于I型分子所述相似的方式鉴定了IIA和B型分子的表位。通过显示所有这些表位以各种程度对N端和C端双重截短tau分子活性有所贡献的突变形式诸如在IA型的范例中所示证明了它们对II型分子的重要性以及它们与对微管的功能的关系。
因此，可用于本发明组合物的抑制剂是能够调控IIA型分子与微管导致“病理性微管”的病理性相互作用的任何抑制剂。此处所用术语“病理性微管”指经过II型分子修饰的微管。这种抑制性分子的作用模式由与微管、微管相关分子包括tau及其病理性衍生物的相互作用组成。作为抑制剂的来源，可以使用确定化学结构和组成的小分子库、肽库、抗体库，或是游离于溶液中，或是展示在合成表面上或噬菌体或细菌或核糖体(核糖体展示)上，还有本领域知道的相似技术。
在一个优选实施方案中，这些“抑制剂”可能对IIA型分子所包括的表位是特异的，通过例如阻断表位，或者可能针对IIA型分子上的多个结构域，只要它们在体外或在体内阻止或扰乱其病理或生物活性。可以通过例如测量正常tau的残余微管装配促进活性或者通过测量胞内微管参数诸如生长物(outgrowth)、稳定性或胞内转运而在定量该抑制效果。
在另一个实施方案中，IIA型分子可以通过其衍生物而得到抑制或中和，例如在各自细胞中表达的显性失活蛋白质(dominant negativeprotein)。正如本发明关于筛选抑制性分子时所述，可以对IIA型肽及其衍生物诸如含有缺失或突变的肽测试或筛选它们对抑制N端和C端双重截短tau分子的病理学效果的作用。
通过抑制对微管结构和功能的损伤来实现治疗性效果。
因此，本发明的另一个目标是提供包含本发明IIA型tau分子的特异抑制剂的药物组合物，任选联合制药学可接受载体和/或稀释剂。
在另一个优选实施方案中，本发明尤其涉及SEQ ID NO11作为IIA型分子成员的原型。
本发明的还有目标是提供用于将正常微管体外转变成病理性状态的方法，其中将正常tau蛋白与本发明的IIA或B型一起在容许所述IIA或B型与微管生成病理性微管相互作用的条件下保温。
本发明还涉及容许对任何分子文库筛选能够中和IIA型分子病理性效果的化合物的筛选测定法。在本发明中，对测试分子筛选它们消除和/或中和IIA型分子和恢复由II型分子引起的生理性微管参数和功能的特性。所述药物筛选测定法由下列步骤组成(1)在存在IIA型分子和微管蛋白时在合适条件下形成病理性微管(分别见实施例3和4)；(2)将这些病理性微管与待测候选药物一起保温；(3)检验在中和IIA型分子对微管的作用方面的结果(分别见实施例9和12)。
可以建立抑制剂的体外筛选系统，它减轻由病理性N端和C端双重截短tau IIA型引起的对微管的作用。这些“抑制剂”可能对IIA型分子所包含的表位是特异的，通过例如阻断表位，或者可能针对IIA型分子上的多个结构域，只要它们阻止或扰乱其活性。可以通过测量微管装配动力学而对抑制效果定量。作为抑制剂的来源，可以使用确定化学结构和组成的小分子文库、肽库、抗体库，或是游离于溶液中，或是展示在噬菌体或细菌或核糖体(核糖体展示)的合成表面的表面上，还有本领域知道的相似技术。
对于本发明的目标而言，待测药物有效减少IIA型分子的数量和/或其活性从而实现辅助治疗效果是足够的，尽管优选完全消除IIA型活性。
本领域熟练技术人员知道如何将本发明的方法用于多种不同目的，这都属于本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目标是提供用于在活细胞即表达II型分子的神经元或神经元样细胞中确认药物的方法(II型细胞测定法)。或者，可以使用衍生自转基因动物的原代神经元培养物或衍生自表达IIA型分子的多种来源的其它原代神经元细胞。
上文所用术语“表达II型分子的神经元”指稳定表达分子的细胞或有能力表达IIA型分子的细胞和通过细胞培养技术或通过下文例示的转基因技术导入了功能性IIA型基因的细胞。
在一个优选实施方案中，表达IIA型分子的所述细胞是成神经细胞瘤或嗜铬细胞瘤细胞或衍生自表达IIA型分子的转基因动物的神经细胞原代培养物。
本领域熟练技术人员知道导入编码IIA型分子的基因的顺序与本发明方法的目的无关的事实。
本发明涉及用于测试在表达IIA型分子的细胞系统中在促进异常微管形成和功能方面有效抑制IIA型的药物的方法，包括下列步骤a)将编码II型分子的功能基因导入表达正常tau蛋白的细胞，处于合适调控区的控制之下；
b)容许IIA型tau与微管(病理性微管)之间形成复合物；c)将待测药物施加到包含得到的复合物的细胞上；并d)检验所述药物对IIA型生物学活性的效果，诸如微管网络及其相关功能的修饰。
本发明的还有一个最优选实施方案是表达IIA型分子的神经元的表型。在合适条件下表达这些分子的神经元引起胞内转运过程的扰乱。另外，表达IIA型分子的神经元在合适压力条件下经历细胞死亡(实施例4)。
所述方法是特别有利的，因为所涉及系统基于连续生长细胞系的使用，提供了体内状况的相近的情形，还提供了胞内定位的IIA型分子的充足供应，它的生成容许对药物筛选有效减轻胞内IIA型作用的药物。
在一个优选实施方案中，使该细胞测定法的读出(readout)适应低通量或高通量定量系统。术语“合适条件”在联合导致微管转运破坏或损伤和/或神经元死亡的所述表型时指容许实施例中所示所述表型出现的任何条件。
为了本发明的目标，通过该系统筛选的或在系统中确认的潜在药物或第三种来源的药物有效降低表型的水平从而在治疗中实现功能是足够的，尽管优选通过药物完全清除或减少患病表型。
除了稳定培养细胞系或原代细胞，各个方面还可以延伸至使用衍生自在其神经元中表达IIA或B型分子的完整动物的细胞的类似读出系统(下文将例示转基因动物模型)。
本领域技术人员知道如何将本发明的方法用于多种不同目的，这都属于本发明的保护范围之内。
在一个优选实施方案中，稳定表达N端和C端双重截短IIA型tau形式的所述细胞和转基因动物容许绘制疾病途径，产生珍贵信息而导致与阿耳茨海默氏病发病机理有关的新分子及其诊断和治疗。这些筛选和鉴定方法包括基于mRNA表达的筛选技术以及基于蛋白质的技术。
在一个优选实施方案中，所述I型和IIA和B型分子或其衍生物还提供了重组DNA构建体，可以将其导入非人动物基因组而提供携带并表达上文所述病理性N端和C端双重截短形式IA型、IIA和B型的转基因动物模型。依照本发明的转基因动物包括直接导入了构建体的动物以及这些动物的保留了表达构建体的能力的后代。转基因序列指与普遍表达或组织特异性启动子功能性相连的多核苷酸序列。编码IA型和IIA和B型分子的转基因DNA优选由动物或人来源衍生的cDNA和/或基因组DNA。表达所述I型和IIA和B型分子的转基因动物预计在细胞和/或器官水平发展在表型上与阿耳茨海默氏病有关的功能变化。这些包括组织学变化、RNA表达变化、细胞生理学参数变化，而且优选AD特征性的行为变化。在转基因动物的成熟神经元中，先前没有测试I型和IIA和B型分子的表达。预计I型、IIA和B型转基因在转基因动物中的表达水平(即转基因mRNA水平)是在转基因动物中获得一致病理生理学效果的重要参数。通过携带转基因的动物的繁殖和杂交，可以增强、削弱、或调节病理学特征，诸如通过例如将转基因导入目前担当疾病模型的动物系、表达其它转基因的动物、或缺乏基因的功能性表达的动物(见实施例14)。
更具体的说，本发明提供了转基因非人动物细胞，其中编码人I型和IIA和B型分子的DNA在合适的普遍或组织特异性启动子的转录控制下表达，包括其可调控修饰。
依照本发明操作的细胞可以通过任何已知转染技术来制备。可以通过直接的遗传操作来导入DNA序列，或者导入较早世代的细胞。由此，可以由转基因动物获得细胞并在体外培养。同样，可以依照完全建立的方法来生成转基因动物，诸如胚胎操作，例如通过胚胎干细胞的基因转移、早期胚胎的逆转录病毒感染、或前核显微注射。优选前核显微注射技术。将由本发明重组DNA构建体获得的转录单位注射到动物胚胎的前核中，并繁殖获得的转基因生成者(founder)。可以使用本领域众所周知的多种技术来分析在后代中获得的结果。基于本发明细胞和动物的模型可用于例如鉴定和评估潜在治疗剂在神经变性疾病中的功效，其中可以分析tau和N端和C端双重截短tau衍生分子还有与阿耳茨海默氏病有关的其它分子诸如APP及其衍生物。具体而言，这些模型可用于有可能预防本文所述N端和C端双重截短tau衍生分子的病理性作用的检测剂的筛选或鉴定测定法。
因此，本发明的另一个方面包括用于测试特定状况的潜在治疗剂的方法，特别是神经变性疾�。叛D，其中将由表达所述双重截短形式tau的转基因动物衍生的细胞用作靶细胞。更具体的说，它包括这样一种方法，其中将治疗剂诸如例如抗体或其衍生物施用于本发明的转基因动物，或者通过杂交或遗传操作导入所述动物，并通过上文所示测定系统进一步测试。此外，本发明包括由这种方法组成或包括这种方法的筛选和鉴定测定法，以及包含本发明细胞的筛选测定试剂盒。本发明给出了使用表达本发明I型和IIA和B型分子的细胞系筛选潜在治疗剂的方法(见实施例15)。可以以类似方式使用本发明的细胞和动物。
本发明的另一个目标是提供包含针对N端和C端双重截短形式tau蛋白的特异抑制剂的制药学组合物，任选联合制药学可接受载体和/或稀释剂。
术语“针对N端和C端双重截短tau的特异抑制剂”指特异抑制所述双重截短tau蛋白的作用的物质。抑制剂的本质可以是在本发明的测试系统中展示期望抑制活性的抗体及其经过改造、衍生的分子，任何肽或确定化学组合物。
本发明的另一个目标是特异识别本发明表位且能够部分或完全抑制N端和C端双重截短tau分子病理学活性的抗体或其衍生物。
术语“包含本发明表位的寡肽或多肽”指在其二维或三维结构中重构本发明表位的肽，得到针对该表位的抗体的特异识别。此外，所述寡肽或多肽可以仅仅由展示所述表位的氨基酸组成，或者它们可以包含额外氨基酸。所述寡肽或多肽的构建在本领域是众所周知的。
在一个优选实施方案中，本发明涉及单克隆抗体及其衍生物，或是天然的或是重组的、固定化的、游离于溶液中或展示在各种分子或细菌、病毒、或其它表面的表面上。抗体及其衍生物能够部分或完全抑制N端和C端双重截短tau分子的生物学活性。使用针对由阿耳茨海默氏患病大脑组织分离的所述双重截短tau分子生成的单克隆抗体DC44显示了这种特异抗体活性(分别见实施例10和11)。
所述抗体还有许多其它变体(DC82、DC136等)，而且可以是血清衍生抗体或单克隆抗体或其任何衍生物。针对期望表位的单克隆和多克隆两种抗体的生成在本领域是众所周知的(43)。另外，所述抗体可以是天然的，或者是通过遗传过程衍生的抗体，诸如通过本领域完全理解的技术衍生的嵌合抗体。此外，所述抗体还指保留其结合特定表位的能力的抗体片段，诸如Fab片段或单链Fv minibody、或胞内表达的称为intrabody的单链抗体。
在一个最优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗阿耳茨海默氏病的药物组合物。
同样，可以对有所需要的患者以处理该病例的医师认为合适的路径和剂量施用所述药物组合物。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述制药学组合物包含结合上文所列表位的任何部分或基团而导致其改变和/或部分或完全中和的至少一种单克隆抗体或小分子或其衍生物作为特异抑制剂(分别见实施例10、11、和12)。
本发明的另一个目标是提供用于检测和/或监测阿耳茨海默氏病的诊断性组合物，包括a)本发明的表位；b)本发明的抗体或其衍生分子。
本发明的诊断性组合物可以包含例如特异识别IA型或IIA型分子类别成员之一或其表位或者待测样品中IA型或IIA型分子的增强水平的本发明抗体。在另一个实施方案中，所述诊断性组合物可以包含针对本发明表位之一的本发明抗体。由此，可以通过用识别本发明表位的抗体处理所述样品来检测阿耳茨海默氏病状况相关样品。可以使用针对本发明抗体且已被本领域已知方法标记的二抗来显现抗体-表位(半抗原)复合物(43)。
在本发明的还有一个实施方案中，所述诊断性组合物可以由本发明表位和本发明抗体组成。用所述抗体处理样品，如果所述抗体与所述样品的结合与所述抗体与用作参照样品的本发明所述表位的结合有关，则可以得出有关相应患者的疾病状况方面的结论。
在还有一个实施方案中，诊断性组合物可以包含IA型或IIA型分子和本发明的抗体。可以在样品的正常tau中和能力方面监测这两类分子的活性，与本发明的重组IA型分子(如SEQ ID NO1)和IIA型分子(SEQID NO11-18)进行比较。由定量的异常I型分子活性，可以推导所述样品中所含分子的水平，由此得出患者的状况。可以通过例如测量未与I型分子反应的正常tau的残余活性来推导IA型活性。可以通过在微管装配实验中测量II型分子的更多活性来推导II型活性。
本领域熟练技术人员能够联合任何上述本发明目标设计其它测试系统。可以理解，所有能够想到的组合都属于本发明的保护范围内。
本发明的另一个目标是提供用于在体外诊断和/或监测阿耳茨海默氏病的方法，包括测定患者的脑脊髓液分离物、关于N端和C端双重截短tau分子IA型和IIA型分子或其表位的存在及其正常tau抑制活性的水平进行神经组织活检。
“患者的脑脊髓液分离物”通过标准医学流程获得。
在另一个实施方案中，本发明涉及分别与IA型或IIA型所述氨基酸序列相同或同源的I型和II型分子，以及由其衍生的能够在动物中诱导免疫应答的分子和免疫原性片段。依照本发明，发现I型和II型这两类分子都可作为免疫原用于生成抑制性抗体，以及作为疫苗的主要部分用于针对疾病的免疫。
通过肠胃外施用，上文所列所有序列和表位以及由患病大脑组织分离的I型和II型都具有免疫原性且导致特异性针对所述I型和II型蛋白质及其衍生物的抗体的生成(分别见实施例10和13)。
在一个最优选的实施方案中，I型和II型分子或其衍生物能够诱导针对所述分子一级、二级和/或三级结构的免疫应答。在宿主中，由此发生的免疫应答因而能够鉴别健康和患病形式的tau及其衍生物。本发明的这一特征可以用于疫苗，因为该N端和C端双重截短tau形式在诱导疾病特异性免疫应答中的独特品质。
可以理解，对于本文所包含的病理性N端和C端双重截短tau多肽，在阿耳茨海默氏病的个别病例中存在天然变异。这些变异可能存在于整个序列中的氨基酸差异或是所述序列中氨基酸的缺失、替换、插入、倒置或添加。本发明例示性实施方案中的这些氨基酸替换属于本发明的范围之内。由此，认为不必影响多肽免疫原性的天然变异是依照本发明的所述双重截短形式的tau多肽的免疫原性等同变体。
然而，在将IA和IIA型N端和C端双重截短tau多肽用于例如接种目的或用于生成抗体时，不必使用本发明中描述的完整多肽。也有可能使用这些多肽的能够诱导针对整个多肽的免疫应答的片段，即所谓的免疫原性片段。
因此，本发明的这个实施方案不仅涉及依照本发明的多肽，而且还涉及那些多肽的仍然能够诱导针对多肽的免疫应答的衍生片段(即所谓的免疫原性片段)。
为了例示目的，给出了重组IA和IIA型肽或衍生自患病人阿耳茨海默氏大脑的IA和IIA型N端和C端双重截短患病tau级分在动物中的免疫原性(实施例3)。
通过下列实施例和附图进一步描述本发明，而非加以限制。
图1使用N端和C端双重截短tau IA型和IB型分子的微管装配。
图2N端和C端双重截短tau IA型和IB型分子对微管装配的抑制。
图3N端和C端双重截短tau IIA和IIB型分子在微管装配中的活性。
图4神经元细胞中表达的IIA型N端和C端双重截短tau显著增加它们对氧化压力的敏感性。
图5单克隆抗体对患病tau IA型蛋白质及其缺失突变体的亲和力。单克隆抗体对患病tau IA型蛋白质及其缺失突变体的表观亲和力。第一列列出了“原型”tau IA型蛋白质(SEQ ID NO1)和各种缺失突变体。中间一列是本发明所指表位。最后一列所述表观亲和力是通过竞争性ELISA测量的，而且显示为50％竞争原型tau IA型蛋白质所需要的相应抗原浓度。
图6来自AD大脑的tau蛋白在Superdex 200柱上的分级。
图7来自AD大脑的三次分开分离的级分#19中的IA型抑制活性。
图8N端和C端双重截短tau I型分子在AD大脑中的证明。
图9tau I型在AD大脑而非健康大脑中的存在。
图10N端和C端双重截短tau II型分子的免疫反应性。
图11重组tau I-II型的构建(SEQ ID NO1-24)。
图12AD大脑衍生和重组tau IA型对正常健康tau的抑制作用。
图13对中和tau IA型分子的候选药物的第一轮筛选(第一步)。
图14对具有针对正常tau的选择性的中和IA型分子的候选药物的第二轮筛选(第二步)。
图15对中和tau IIA型的候选药物的第一轮筛选。
图16对能够中和tau IIA型分子并将它们与正常tau鉴别开来的候选药物的第二轮筛选(第二步)。
图17通过ELISA测定的prefused小鼠血清中的特异性抗体水平。
图18单克隆抗体与AD大脑衍生tau(级分#19)和对照健康大脑衍生tau的ELISA反应性(DC20具有无关特异性的单克隆抗体。所示数据代表三次平行实验的平均值)。
图19单克隆抗体与重组tau分子的ELISA反应性(DC20具有无关特异性的单克隆抗体。所示数据代表三次平行实验的平均值)。
图20对针对AD大脑衍生tau IA型(级分#19)的中和抗体的筛选。
图21对针对重组tau IA型(SEQ ID NO1)的中和抗体的筛选。
图22对能够中和tau IA型分子并将它们与健康tau鉴别开来的候选药物的筛选。
图23单克隆抗体对重组tau IIA型(SEQ ID NO12)的病理活性的中和。
图24通过ELISA检测的针对重组tau IIA型(SEQ ID NO12)的抗体水平。
图25转基因动物的基因分型。小图A显示了亲代转基因动物的基因分型。第1、2、3、和4道来自基因组DNA的DNA双重截短序列的特异扩增指示由养母后代尾巴提取的基因组DNA中特定转基因的存在。这些动物代表带有双重截短IIA型tau分子的亲代转基因动物。在此实施例中，显示了阳性(+C)和阴性(-C)以及两个额外阴性样品(5、6)(M＝大小标记)。箭头指示在转基因阳性动物中期待的预期PCR片段大小。小图BF1代动物的基因分型。由尾尖提取基因组DNA，并鉴定双重截短tau特异DNA序列，显示于第1道。第2和3道显示阴性对照。F1代中tau特异DNA片段的鉴定证实了这些转基因的可遗传性。
图26F1代转基因动物中双重截短人tau转录本的基因表达。由新鲜冷冻的转基因动物组织提取RNA，并进行逆转录，随后是cDNA的特异扩增。一个实施例在第1和2道中显示表达转基因的动物。第3-5道代表不进行表达的对照，第5道显示使用这种方法时非转基因动物中典型显现的非特异信号。此实施例指示实验动物中由转基因表达的双重截短tau特异mRNA的存在。
图27体外分化6天后由IIA型分子过度表达引起的细胞死亡。经过双重截短tau IIA型转染的SY5Y细胞(IIA型)与未转染对照神经元样细胞(模拟物)的各自细胞存活率的比较。
图28A使用来自表达IIA型双重截短分子和全长tau的稳定转染细胞的tau细胞级分显示了IIA型分子与微管的结合亲和力增加。如上所述分离游离tau(FT)、微管结合tau(MT)、和核相关tau(NAT)。B有机化合物F123对tau IA和IIA型微管聚合实验的抑制；C通过电子显微镜分析显示的吸收测量与微管聚合之间的直接比较。
图29用MitoFluor染色的对数生长SH-SY5Y细胞。线粒体在细胞体和过程中的规则分布。
图30用MitoFluor染色的表达tau IIA型分子的对数生长SH-SY5Y细胞。绿色标记的线粒体在细胞中心体区域周围的核周群集。
实施例实施例1N端和C端双重截短tau IA型和IB型分子的微管装配健康tau的生理功能在于对稳定微管(MT)。可以通过微管装配实验(MAA)来测量这一功能。在此实施例中，使用三类tau分子来进行MAA反应正常健康人的tau、重组形式的tau IA型(SEQ ID NO1)和IB型(SEQ ID NO4)。在分开的反应中分别测定正常人的tau、tauIA型和IB型。将tau的每一种制剂(0.1mg/ml)与纯化的猪脑微管蛋白(1mg/ml)和GTP(1mM)在聚合缓冲液(100mM PIPES pH6.9、1mM MgSO4、2mM EGTA)中混合。最后加入tau以起动对MT装配的促进。温和且快速混匀后，将样品转移到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计(Beckman Coulter DU640)中于37℃平衡。以10秒为间隔连续监测340nm的混浊度达20分钟。顶部的曲线1(图1)显示了正常健康tau的微管装配促进能力。相反，IA型(曲线2)和IB型(曲线3)都不展示正常tau的这一活性，而且在MAA中缺乏任何MT装配促进作用。
实施例2N端和C端双重截短tau IA型和IB型分子对微管装配的抑制tau IA型和IB型分子在应用于MT装配实验(MAA)时都缺乏功能活性。令人惊讶的是，tau IA型分子在微管装配中对微管蛋白显示抑制效果。相反，IB型分子(尽管具有相似的一级结构)在MAA中不抑制微管蛋白的功能活性。为了抑制微管装配，使用重组形式的tau IA型(SEQID NO1)和IB型(SEQ ID NO4)。使用IA型和IB型蛋白质分别进行装配抑制反应。将人微管蛋白(2mg/ml)与IA型分子(0.2mg/ml)或IB型分子(0.2mg/ml)混合。将混合物于37℃保温1小时并温和摇动。向置于冰上的混合物中加入于聚合缓冲液(100mM PIPES pH6.9、1mMMgSO4、2mM EGTA)中的正常人tau(0.1mg/ml)和GTP(混合物中微管蛋白的终浓度是1mg/ml而GTP的终浓度是1mM)。温和且快速混匀后，将样品转移到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计(BeckmanCoulter DU640)中于37℃平衡。以10秒为间隔测量340nm的混浊度变化达5分钟。顶部的曲线1(图2)证明了正常人tau独自就完全能够诱导微管蛋白聚合。微管蛋白与IA型的预保温消除微管装配(图2，底部曲线2)。相反，微管蛋白与IB型(尽管与IA型具有相同的分子量范围)的预保温不抑制正常tau的微管装配能力(图2，曲线3)。
表N端和C端双重截短tau分子对微管聚合的影响 SEQ ID NO11-14、19的编号依照最短的R4同种型SEQ ID NO15-18、20的编号依照最短的R3同种型
SEQ ID NO11-14、19的编号依照最短的R4同种型SEQ ID NO15-18、20的编号依照最短的R3同种型实施例3N端和C端双重截短tau IIA型和IIB型分子在微管装配中的活性令人惊讶的发现，与IA型分子相反，IIA型双重截短tau衍生物促进病理微管装配(见图3和图28C)。使用三类分子来进行微管装配反应天然健康人的tau同种型、阿耳茨海默氏tau IIA型(SEQ ID NO12)和tau IIB型(SEQ ID NO19)。进行三个分开的反应，每个反应使用tau的一种制剂(健康tau、重组tau IIA型或IIB型)。将每一种tau制剂(0.1mg/ml)与微管蛋白和GTP(微管蛋白的终浓度是1mg/ml而GTP的终浓度是1mM)混合，所有试剂都溶于聚合缓冲液(100mM PIPESpH6.9、1mM MgSO4、2mM EGTA)。温和且快速混匀后，将样品转移到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计(Beckman Coulter DU640)中于37℃平衡。以10秒为间隔测量340nm的混浊度变化达5分钟。在此实验中，与健康tau的生理微管装配(图3，曲线2)相比，重组tau IIA型显示对病理微管装配的极高(3倍)促进(图3，顶部曲线1)。相反，IIB型分子尽管是N端和C端双重截短的但是在MAA中不表现如IIA型而是只以健康tau的水平促进微管装配(图3，曲线3)。
实施例4可以在体外在暴露于多种氧化压力的表达所述分子的成神经细胞瘤上证明由于患病tau II型蛋白引起的扰乱的压力保护机制在此实施例中，利用3-morpholinosydnonimine(SIN-1)的氧化分解，它生成超氧阴离子和一氧化氮，它们发生反应而形成peroxynitrite。这种非常活泼的自由基能够进一步氧化主要是细胞膜系统。本领域技术人员还将能够对培养的成神经细胞瘤细胞施加另一种氧化压力来源，而且将能够获得与此处所述使用SIN-1时相同的效果。
如下测试攻击作用1.将SIN-1以多种浓度(0-3.32mM)施加于分别表达tau IIA型蛋蛋白质SEQ ID NO15和SEQ ID NO11的人神经元细胞系；2.通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)反应测定法来测量细胞存活以测定50％细胞存活的过氧化氢有效浓度(EC50)。本领域技术人员知道评估细胞存活的不同方法，用于测量本发明中描述的作用；3.对成神经细胞瘤细胞系比较在存在或缺乏患病tau IIA型蛋白质表达时的EC50值，并通过t检验评估EC50值差异的统计学显著性。在含10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％NEAA、50U/L庆大霉素的MEM/F12中培养细胞。由3-morpholinosydnonimine(SIN-1)在无血清培养基中的1M储液(如47.5mg溶于230ml)进行稀释。在MEM/F12w/o血清中制备MTT储液(2.6mg/ml)，并过滤除菌。
通过本领域众所周知的方法培养细胞。以2×104细胞/孔接种96孔板。半块板接种表达tau II型分子的细胞，另半块板接种不进行表达的细胞。每36-48个小时更换培养基。5天后，以0-3.3mM的浓度范围添加SIN-1，并将板保温24小时。每个浓度测定六份。SIN-1保温后，添加MTT储液至终浓度200mg/ml，并将板继续保温1小时。丢弃培养基；用纸巾擦干板面。每个孔加入50ml DMSO，并将板于室温保温过夜。在ELISA读板仪上测量540nm的吸光度(于690nm校正背景)，并将减去背景的数值用于EC50计算，这是本领域众所周知的。
使用t检验测试表达IIA型蛋白质与不表达所述蛋白质的成神经细胞瘤细胞之间EC50浓度对数的差异的显著性，两种IIA型患病tau蛋白的P值都小于0.001。tau蛋白SEQ ID NO12和SEQ ID NO18的表达将成神经细胞瘤细胞对氧化压力的抵抗力降低了50％。
所述实施例的结果(图4)有助于解释患病形式tau蛋白的病理作用。
本领域技术人员能够结合任何上述本发明目标来设计其它测试系统。可以理解，所有能够想到的组合都属于本发明的保护范围之内。
依照图4的图表反映了存在tau IIA型时神经元细胞对氧化压力的相对抵抗力的降低。不含所述蛋白质的细胞(对照)的抵抗力表述成100％(左柱)，表达患病tau蛋白的神经元细胞的抵抗力显示为对照值的百分比(中柱和右柱)。抵抗力定义为50％细胞死亡的培养液中由SIN-1生成的自由基浓度。结果分别反映了双重截短tau蛋白IIA型SEQ ID NO12(93-333，R4)和SEQ ID NO18(69-332，R3)的测量结果。
实施例5各个表位对双重截短tau IA型构象的贡献通过整个构象区(区段A)或其各个部分(称为表位且称作A1-A6)的连续缺失来测定tau IA型中“构象区”(区段A)或其部分的重要性。由于IA型分子的构象与它们的功能关系紧密，因此根据它在使用tau单克隆抗体时的反应性来测量每个表位(A1-A6)对“区段A”整个构象的贡献(图5)。
原型tau IA型(SEQ ID NO1)具有10nM的亲和力。分别缺失了表位A1、A2、和A5的各种缺失突变体SEQ ID NO22、23、和26显示，这些区域的贡献表现为亲和力(20-40nM)降低了2-4倍；而在SEQ IDNO24、25、和27中分别缺失表位A3、A4、和A6贡献更大，亲和力损失10-30倍(100-300nM)。只有在缺失整个区段A(突变体SEQ ID NO21)后，亲和力显著降低，相对于原型tau IA型的亲和力降低了三个数量级。
实施例6N端和C端双重截短tau I型和II型的分离制备阿耳茨海默氏大脑衍生tau I型和II型分子将来自神经病理学确认的阿耳茨海默氏病病例的患病人大脑组织作为来源用于分离双重截短tau IA、IB、和IIA蛋白。由阿耳茨海默氏大脑制备tau基于TRIS缓冲液中的组织匀浆与通过饱和硫酸铵沉淀的裂解物分级的联合。将组织在冷的20mM TRIS pH8、0.32mM蔗糖、10mM b-merkaptoethanol、5mM EGTA、10mM EDTA、5mM MgSO4、1mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化钠、5mM苯甲脒、5μg/ml亮肽素、1.5μg/ml抑胃酶肽、2μg/ml抑酶肽中用Heidolph DIAX 900匀浆器于4℃匀浆10分钟。将匀浆液于4℃以27000g离心30分钟以除去细胞碎片。通过添加44.12％(v/v)饱和硫酸铵而由大脑组织上清液沉淀tau蛋白。于25℃保温20分钟并温和混匀后，将样品于25℃以20000g离心10分钟。将沉淀重悬于500μl 100mMPIPES pH6.9、2mM EGTA、1mM MgSO4，并在相同缓冲液中透析。将此制剂通过凝胶过滤在Superdex 200柱(Amersham-Pharmacia-Biotech)上分级，并通过SDS-PAGE(梯度5-20％聚丙烯酰胺)分离级分，依照标准流程使用抗tau抗体DC25通过免疫印迹检测tau蛋白(图6)。测试各个级分对微管装配的作用。
tau IA型和IB型的分离级分#19(图7)含有对应于代表双重截短IA型和IB型分子的分子量(12kDa)的tau分子-此级分显示最高的抑制能力。使用三种抗tau抗体通过Western印迹分析来鉴定此级分DC25(识别截短和全长这两种蛋白质)、DC39(对完整C末端特异)、和Alz50(对完整N末端特异)(图8)。这些抗体的免疫反应性证明了只在来自AD大脑的级分中N端和C端双重截短I型蛋白质的缺乏。通过相同方法由正常健康大脑制备的相应级分既不显示抑制活性又不显示特异免疫反应性(图9)。通过夹心RIA测定tau蛋白的浓度。使用Bradford测定法测定总蛋白浓度。tau制剂保存于-20℃直至使用。
tau IIA型的分离包含对应于分子量30kDa的tau分子的级分#15(图6)代表双重截短IIA型分子。级分#15显示异常高的微管装配促进活性。使用三种抗tau抗体通过Western印迹分析来鉴定此级分DC25(识别截短和全长这两种蛋白质)、DC39(对完整C末端特异)、和Alz50(对完整N末端特异)(图10)。这些抗体的免疫反应性证明了只在衍生自AD大脑的级分中N端和C端双重截短II型蛋白质的存在。通过夹心RIA测定tau蛋白的浓度。使用Bradford测定法测定总蛋白浓度。
重组tau I型和II型蛋白的克隆、表达和纯化重组截短tau蛋白的基因衍生自同种型tau43和tau44的人cDNA。使用NdeI-EcoRI限制性位点将cDNA插入片段克隆到pET17b(Novagen)载体中。(图11)(Studier等人，Meth.Enzym.，18560-89，1990)。
通过由cDNA PCR扩增相关区域来制备重组N端和C端双重截短tau分子(SEQ ID NO1-24)。使用引入翻译起始密码子(ATG)、终止密码子(TGA)、和NdeI-EcoRI限制性位点的特异引物。
通过反相PCR生成在tau cDNA中携带A4-A6表位(SEQ IDNO25-27)缺失的质粒，如图11所示(底图)。
实施例7AD大脑衍生和重组tau IA型在微管装配实验中对正常健康tau的抑制作用tau IA型的AD大脑提取物和重组分子能够在使用天然健康tau同种型时抑制微管装配促进。对于这些实验，健康人tau分离自年龄匹配对照大脑，而tau IA型分离自AD患者大脑(见实施例6，图6，级分#19)。如实施例6所示生成并纯化重组tau IA型(SEQ ID NO1)和IB型(SEQID NO4，阴性对照)。在这些实验中，将大脑衍生健康tau同种型(0.1mg/ml)、AD大脑衍生或重组tau IA型或IB型(0.2mg/ml)与微管蛋白混合。分别测定每种组合。将测试混合物在水浴中于37℃保温1小时并温和摇动。向置于冰上的混合物中加入GTP和/或正常tau(微管蛋白的终浓度是1mg/ml而GTP的终浓度是1mM)，所有试剂都溶于聚合缓冲液(100mM PIPES pH6.9、1mM MgSO4、2mM EGTA)。温和且快速混匀后，将样品转移到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计(Beckman Coulter DU640)中于37℃平衡。以10秒为间隔测量340nm的混浊度变化达5分钟。数据显示AD大脑衍生和重组这两种双重截短IA型分子都抑制正常tau促进微管装配的能力(图12，曲线2、3)。相反，重组IB型不能抑制由正常人tau诱发的微管蛋白聚合促进活性(图12，曲线4)。曲线1(图12)代表由正常tau促进的微管装配。
实施例8中和tau IA型病理活性的候选药物的筛选测定法利用双重截短tau IA型分子抑制健康正常tau促进微管聚合的活性的能力，设计用于选择能够中和IA型分子抑制活性的化合物的筛选测定法。患病tau IA型可以衍生自AD大脑或重组来源，然而有利的是使用重组材料。可以通过测量正常健康tau促进微管装配的残余能力来定量确定候选药物的中和作用。该测定法分两步进行1.筛选中和tau IA型的候选药物。将原型重组IA型分子(SEQ IDNO1)(终浓度100mg/ml)与每种候选药物(终浓度50mg/ml)的分别混合物于37℃预保温1小时。保温后，于4℃向混合物中添加微管蛋白、GTP和健康tau(终浓度微管蛋白-1mg/ml，GTP-1mM，健康tau-100mg/ml)。快速混匀后，将样品加载到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计中于37℃平衡。测量340nm的混浊度变化。通过测量正常健康tau的残余微管装配促进能力来选择能中和IA型活性的候选药物(图13；将候选药物与IA型分子一起预保温，并测定IA型在微管装配中的中和效率。底部曲线1和顶部曲线2代表所测候选药物针对患病IA型分子的阴性(无中和)和阳性(100％)中和活性。中部曲线指示三种不同候选药物的IA型中和的不同效率)。显然，选择阳性药物的阈值是任意的，而且可以由IA型的完全中和至部分中和而变化。
2.选择中和IA型分子并将它们与正常健康tau鉴别开来的候选药物。对具有针对tau IA型分子的中和活性的选定候选物筛选与正常健康tau的反应性以选择只对IA型特异的分子。将正常健康tau(终浓度100mg/ml)与每种候选药物(终浓度50mg/ml)的分开混合物于37℃预保温1小时。保温后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(终浓度微管蛋白1mg/ml，GTP 1mM)。快速混匀后，将样品加载到石英微量比色杯中。测量340nm的混浊度变化。选择那些显示不干扰健康tau的MT聚合促进活性的候选药物(图14)。
实施例9中和tau IIA型的病理活性的候选药物的筛选测定法本发明显示了tau IIA型分子具有出乎意料的促进微管蛋白聚合的高潜能，这构成了用于选择中和IIA型蛋白质所述活性的化合物的筛选测定法的基础。可以通过测量IIA型分子的残余微管装配活性来对IIA型的中和作用定量。该测定法分两步进行1.筛选中和tau IIA型的治疗性候选药物。将tau IIA型(SEQ ID NO12)(终浓度100mg/ml)与每种候选药物(终浓度50mg/ml)的分别混合物于37℃预保温1小时。保温后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(终浓度微管蛋白1mg/ml，GTP-1mM)。快速混匀后，将样品加载到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计中于37℃平衡。测量340nm的混浊度变化。选择显著降低微管装配速率的候选药物用于测定法的第二步(图15；将候选药物与IIA型分子一起预保温，并在微管装配中测定IIA型的中和效率。底部曲线1代表各种候选药物的阳性(100％)中和活性，而顶部曲线2指示患病IIA型分子没有中和。中部曲线指示多种候选药物在IIA型中和方面的不同效率)。
2.选择中和IIA型分子并将它们与正常健康tau鉴别开来的候选药物。将每种候选药物(终浓度50mg/ml)与正常健康tau(终浓度100mg/ml)的分别混合物于37℃预保温1小时。然后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(终浓度微管蛋白1mg/ml，GTP-1mM)。快速混匀后，将样品转移到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计中平衡于37℃。测量340nm的混浊度变化。选择不干扰健康tau的候选药物(图16；将第一步中选择的候选药物与健康tau一起预保温，并测定对微管装配的作用。底部曲线1代表健康tau的最大抑制，而顶部曲线2指示不抑制健康tau。中部曲线显示具有针对健康tau的不同抑制活性的候选药物)。
实施例10中和N端和C端双重截短IA型和IIA型分子的单克隆抗体的制备免疫方案和融合流程将由人阿耳茨海默氏大脑分离的N端和C端双重截短tau I型蛋白质(级分#19，实施例6)用作免疫原。用溶于完全弗氏佐剂的所述蛋白质(50mg/小鼠)对Balb/c小鼠进行皮下引发，并用相同蛋白质(50mg/小鼠)以4周为间隔进行3次腹膜内加强。采集prefusion血清，并通过ELISA测试针对tau的特异性抗体水平(图17；在ELISA中在相同抗原上测试经过AD衍生tau免疫的小鼠血清中特异性抗体水平。所有5份血清都对所述tau蛋白显示高抗tau结合活性。图17代表一只经免疫小鼠中的特异性抗体水平。使用来自用无关蛋白质免疫的小鼠的血清作为对照)。使用本领域众所周知的修正流程(M.Kohler和C.Milstein，1975)，将小鼠脾细胞与NS/0骨髓瘤细胞融合。
依照图18所示结果，单克隆抗体DC44、DC82和DC136识别来自阿耳茨海默氏大脑的N端和C端双重截短IA型和IIA型分子。对于这些抗体，在使用通过相同方法由正常人大脑制备的分离物时没有观察到反应性(图18)。相反，单克隆抗体DC25在ELISA中与来自病理大脑和正常健康大脑的所述蛋白质发生反应(图18)。这一抗体不能鉴别tau的病理形式(AD-tau)与正常人tau。这一初级筛选后，将杂交瘤亚克隆到软琼脂糖中，这是本领域熟练技术人员众所周知的技术，最后生成分泌具有相同独特型的抗体的同源杂交瘤群体。
在与筛选测定法相同的ELISA中，对这些克隆的杂交瘤克隆进一步检查与重组全长tau同种型和双重截短tau IA型(SEQ ID NO1)和IIA型(SEQ ID NO12)分子的反应性。
实施例11使用单克隆抗体对AD大脑衍生和重组N端和C端截短IA型分子的病理活性的中和对选定的单克隆抗体DC44、DC82、DC136、和DC25进一步鉴定它们中和由阿耳茨海默氏大脑分离的天然tau IA型的活性的能力(见实施例6)。所述tau分离物(终浓度100mg/ml)与所测抗体(终浓度50mg/ml)一起于37℃预保温1小时。保温后，于4℃向混合物中添加微管蛋白、正常人tau和GTP(终浓度微管蛋白-1mg/ml，健康人tau-100mg/ml，GTP-1mM)。快速混匀后，将样品转移到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计中平衡于37℃。测量340nm的混浊度变化。单克隆抗体DC136、DC44和DC82能够抑制所述蛋白质的病理活性(图20；将抗体与天然tau IA型(级分#19)一起预保温，随后与健康人tau、微管蛋白、和GTP混合。于37℃5分钟后分光光度法测定微管形成。柱代表三次独立实验的平均值。MAA-使用健康人tau的微管装配实验。MAIA-使用与tau IA型一起预保温的健康人tau的微管装配抑制实验(不含抗体))。在一个类似实验中，用重组原型tau IA型(SEQ ID NO1)测试抗体，显示中和活性的相似模式(图21)。对照抗体DC25在ELISA和Western印迹测试中识别所有形式的截短和正常tau，但是在微管装配实验中不干扰AD大脑衍生IA型活性。这些结果说明，与抗体DC136、DC44和DC82相比，抗体DC25与tau的独特区域发生反应。相反，抗体DC136、DC44和DC82结合涉及IA型分子病理学的表位。
下一个选择步骤针对能够鉴别健康与IA型分子的抗体。将正常健康tau(终浓度100mg/ml)与所测抗体(终浓度50mg/ml)的混合物于37℃预保温1小时。保温后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(终浓度微管蛋白-1mg/ml，GTP-1mM)。快速混匀后，将样品转移到石英微量比色杯中，并在控温分光光度计中平衡于37℃。测量340nm的混浊度变化。抗体DC136、DC44、DC82和DC25都不能在微管装配中抑制正常健康tau(图22；将中和tau IA型的抗体与健康tau一起预保温，随后与微管蛋白和GTP混合。于37℃保温5分钟后分光光度法测定微管形成。柱显示三次独立实验的平均值。MAA-使用健康tau的微管装配实验。使用中和健康tau的抗体作为阴性对照)。这些数据证明抗体DC136、DC44、和DC82识别涉及截短患病形式tau与健康tau蛋白相互作用的特定表位。
实施例12单克隆抗体对IIA型活性的中和使用实施例8B所述方法，对先前为了它们的tau IA型中和活性而分离的抗体测试它们针对重组tau IIA型(SEQ ID NO12)的中和能力。所有三种中和性单克隆抗体DC44、DC82、和DC136都能够降低N端和C端双重截短tau IIA型分子的病理活性(图23；将抗体与重组tau IIA型一起预保温，然后与微管蛋白和GTP混合。于37℃保温5分钟后分光光度法测定微管形成。柱代表三次独立实验的平均值。MAA-使用tauIIA型的微管装配实验(不含抗体))。这说明所述抗体的表位至少由IA型SEQ ID NO1与IIA型SEQ ID NO12共享。对于抗体DC25，没有观察到IIA型抑制活性。
实施例13重组N端和C端双重截短tau IA和IIA型分子的免疫原性免疫方案在本发明的一个优选实施方案中，将所述重组tau IA和IIA型蛋白质用于接种目的或用于引起特异中和患病tau IA和IIA型分子的病理活性的抗体。在给定实施例中，将重组N端和C端双重截短tau IIA型(SEQ ID NO12)用作免疫原。用溶于完全弗氏佐剂的所述蛋白质(50mg/小鼠)对Balb/c小鼠进行皮下引发，并用溶于不完全弗氏佐剂的相同蛋白质(50mg/小鼠)以4周为间隔进行3次腹膜内加强。采集免疫血清，并通过ELISA测定针对各自重组抗原tau的特异性抗体水平(图24)。
实施例14转基因动物由尾尖提取DNA使用Dneasy组织试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。
基因分型(图25)对衍生自亲代转基因动物的基因组DNA进行编码双重截短tau形式的转基因的特异扩增，并显示于图25A。对F1代基因组DNA的进一步分析揭示了转基因是可遗传的，因为它们在亲代的后代中也得到鉴定。因此，编码双重截短tau的转基因固定在动物的染色体DNA中(图25B-F1代的基因分型)。此实施例中所使用的动物具有特定遗传背景，特征是自发性高血压和其它阿耳茨海默氏病相关致病因素(risk factor)，诸如异常脂血症或糖尿病。因此，这种动物系通过结合最频繁发生的阿耳茨海默氏病致病因素诸如高血压和糖尿病而代表独特的实验性阿耳茨海默氏模型。
使用如Sambrook等人，《Molecular Cloning，A LaboratoryManual》即《分子克隆，实验室指南》，CSH实验室，纽约，2001所述的分子生物学标准技术来生成转基因。将编码双重截短tau的cDNA导入表达载体，该载体连接普遍性或组织特异性方式指导表达的启动子。通过前核注射将基因片段导入一日龄胚胎(不受限制)。使用来自尾尖的基因组DNA对得到的后代进行基因分型。
转基因表达的分析(图26)运用普遍知道的方法诸如RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳，通过RT-PCR分析来评估由转基因衍生的mRNA的表达。
图25的小图A显示了亲代转基因动物的基因分型。第1、2、3、和4道来自基因组DNA的DNA双重截短序列的特异扩增指示由养母(fostermother)后代尾巴提取的基因组DNA中特定转基因的存在。这些动物代表携带双重截短IIA型tau分子的亲代转基因动物。在此实施例中，显示了阳性(+C)和阴性(-C)以及两个额外阴性样品(5、6)(M＝大小标记)。箭头指示在转基因阳性动物中期待的预期PCR片段大小。图25的小图BF1代动物的基因分型。由尾尖提取基因组DNA，并鉴定双重截短tau特异DNA序列，显示于第1道。第2和3道显示阴性对照。F1代中tau特异DNA片段的鉴定证实了这些转基因的可遗传性。
图26由新鲜冷冻的转基因动物组织提取RNA，并进行逆转录，随后是cDNA的特异扩增。一个实施例在第1和2道中显示表达转基因的动物。第3-5道代表不进行表达的对照，第5道显示使用这种方法时非转基因动物中典型显现的非特异信号。此实施例指示实验动物中由转基因表达的双重截短tau特异mRNA的存在。
实施例15AIIA型分子的过度表达在已分化神经元样分子中引起细胞死亡在成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y中，使用本领域熟练技术人员知道的标准化体外分化条件证明了由IIA型分子引起的细胞死亡。在表达IIA型双重截短tau的稳定转染细胞中测试该作用，并与未转染细胞进行比较。一式三份使用台盼蓝(trypan blue)排除测定法对细胞存活率手工定量，并使用单向ANOVA检验进行统计学评估。体外分化6天后发现了过度表达IIA型双重截短tau的细胞与野生型细胞之间细胞存活率的显著差异(p＜0.001)。IIA型双重截短tau的过度生成(占总蛋白量的0.5％)引起细胞存活率降低3倍(图27；用双重截短tau IIA型转染的SY5Y细胞(IIA型)与未转染对照神经元样细胞(模拟物)各自细胞存活率的比较)。
与先前显示的构造类似，使用编码双重截短I型分子的构建体建立了相似系统。
II型双重截短tau分子显示对微管系统的结合亲和力增加。
由表达IIA型双重截短tau和全长tau的稳定转染SH-SY5Y细胞分离游离tau级分(FT)、微管相关级分(MT)和核级分(NAT)。对与微管结合的tau的定量显示双重截短IIA型tau与微管的亲和力相对于全长形式增加(超过50％)(图28A；使用来自表达IIA型双重截短分子和全长tau的稳定转染细胞的细胞级分证明了IIA型分子与微管的结合亲和力增加。如上所述分离游离tau(FT)、微管结合tau(MT)和核相关tau(NAT))。依照本领域所使用的标准细胞生物学分级方法对tau的量定量，随后是Western印迹分析。使用定量的重组tau蛋白计算校准曲线。
B对有机物F123[C34-59O14-23H32-44N6-8]n分析它在微管聚合实验中的抑制效果(1)将F123与tau(正常tau和IA型tau浓度100μg/ml；IIA型tau浓度60μg/ml)一起于37℃保温1小时；(2)添加微管蛋白(浓度＝1mg/ml)；
(3)测量340nm/5分钟(注意所有稀释用PIPES缓冲液进行)。
C对正常健康tau和阿耳茨海默氏tau II型分析它们的微管装配促进能力。在此实施例中，由tau43代表的正常tau形成典型微管，如电子显微镜检查所示(见图28C)。然而，阿耳茨海默氏tau II型生成具有典型模式的病理微管(见图28C)。
实施例16真核细胞中N端和C端双重截短tau II型过度表达的功能后果在成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y中进行显示由过度表达IIA型分子引起的线粒体转运改变的病理表型。通过在活的野生型SH-SY5Y细胞与转染细胞中比较线粒体再分布来检验N端和C端双重截短tau II型分子的影响。使用本领域熟练技术人员知道的细胞生物学转运测定法。简而言之，依照标准实验室技术在LabTekII室(Nunc)上培养细胞至相等密度(70％汇合)，并使用Fugene 6(Roche)依照制造商的指示进行转染。遵循制造商的指示进行线粒体染色(MitoFluor Red 594，Molecular Probes)。用配备63x油浸接物镜和荧光滤镜的Axiovert200M荧光显微镜(ZEISS)检查活细胞。用CCD相机(Photometrics，Cool snap HQ；Hamamatsu)联合软件程序MetaMorph(UniversalImaging)照相。
使用线粒体特异染料MitoFluor(Molecular Probes)，在经诱导与未诱导SH-SY5Y细胞中比较线粒体定位。染色证实了IIA型双重截短tau分子在SH-SY5Y细胞中对线粒体转运的消极作用，导致核周线粒体在中心体附近群集，指示截短末端针对胞内力量的功能优势(图30)。
作为对照，对数生长细胞(图29)显示线粒体在细胞体和细胞周边的规则分布。总之，N端和C端双重截短IIA型蛋白质因而能够影响胞内转运机制，进而影响线粒体再分布。此实验设置显示用于测试针对IIA型分子的抑制活性的合适方法。
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权利要求
1.N端和C端双重截短tau分子，特征在于(“IA型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前236个N端氨基酸和至少后45个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；-所述分子在体外微管装配实验中阻止正常tau蛋白促进微管装配；且-所述微管装配促进的阻止作用可以在微管装配实验中通过针对该分子的特异性抑制性中和单抗来消除。
2.依照权利要求1的IA型tau分子，特征是包含选自SEQ ID NO1-3的氨基酸序列。
3.N端和C端双重截短tau分子，特征在于(“IB型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前238个N端氨基酸和至少后40个C端氨基酸或相对于含三重复的tau44而言截短前207个N端氨基酸和至少后50个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；且-所述分子在体外微管装配实验中不阻止野生型tau蛋白促进微管装配。
4.依照权利要求3的IB型tau分子，特征是包含选自SEQ ID NO4-10的氨基酸序列。
5.N端和C端双重截短tau分子，特征在于(“IIA型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前68个N端氨基酸和至少后40个C端氨基酸或相对于含三重复的tau44而言截短前68个N端氨基酸和至少后20个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；-所述分子在体外微管装配实验中具有比野生型tau更高的微管装配促进活性；-所述分子在体外微管装配实验中的所述微管装配促进活性可以通过针对该分子的特异性抑制性中和单抗来消除；且-所述分子的病理活性依赖其由微管聚合促进活性限定的与微管网络的结合。
6.依照权利要求5的IIA型tau分子，特征是包含选自SEQ ID NO11-18的氨基酸序列。
7.N端和C端双重截短tau分子，特征在于(“IIB型tau分子”)-所述分子相对于含四重复的tau43而言截短至少前68个N端氨基酸和至少后40个C端氨基酸或相对于含三重复的tau44而言截短前68个N端氨基酸和至少后20个C端氨基酸；-所述分子能够在阿耳茨海默氏患病大脑组织中检测到，但不能在正常健康大脑组织中检测到；且-所述分子在体外微管装配实验中具有与野生型tau不同的病理微管装配促进活性。
8.依照权利要求7的IIB型tau分子，特征是包含选自SEQ ID NO19-20的氨基酸序列。
9.用于制备依照权利要求1-8任一项的分子的方法，特征是通过下列步骤a)构建携带双重截短tau分子编码序列的重组原核表达质粒，其中缺失包括至少前236个氨基酸和后40个氨基酸或前68个氨基酸和后20个氨基酸或其组合；b)在容许表达所述N端和C端双重截短tau分子的条件下培养所述细菌；c)收集细菌，优选通过离心；d)重悬细菌沉淀；e)超声处理所述细菌；f)通过凝胶过滤将所述经过超声处理的细菌分级；并g)通过微管装配实验监测得到的级分的活性，从而鉴定I型和II型tau分子的不同活性。
10.依照权利要求9的方法，特征是截短如权利要求1-8任一项的定义。
11.依照权利要求9或10的方法，特征是微管装配实验活性如权利要求1-8任一项的定义。
12.用于制备依照权利要求1-8任一项的分子的方法，特征是通过下列步骤a)提供阿耳茨海默氏患病大脑组织；b)将所述患病大脑组织在缓冲液尤其是Tris缓冲液中匀浆；c)将所述经过匀浆的大脑组织进行硫酸铵沉淀；d)重新溶于PIPES缓冲液；e)通过凝胶过滤将所述重新溶解的材料分级；并f)通过微管装配实验监测得到的级分的活性，从而鉴定I型和II型tau分子的不同活性。
13.依照权利要求12的方法，特征是微管装配实验活性如权利要求1-8任一项的定义。
14.用于测试有效分解依照权利要求1或2的分子(IA型分子)与微管蛋白的复合物的物质的方法，包括下列步骤h)容许IA型分子与微管蛋白之间形成蛋白质复合物；并i)将蛋白质复合物与待测物质一起保温，并鉴定那些抑制IA型分子和/或容许野生型tau的微管装配促进能力和微管的正常功能恢复的物质。
15.用于测试在表达野生型tau的细胞系统中有效抑制依照权利要求1或2的分子(IA型分子)起动与微管蛋白形成复合物的物质的方法，包括下列步骤a)将编码IA型分子的功能基因导入表达正常tau蛋白的细胞，处于合适调控区的控制之下；b)容许IA型分子与微管蛋白分子之间形成蛋白质复合物；c)将待测物质施加到包含所述复合物的细胞上；并d)检验所述物质对权利要求1中定义的IA型生物活性的作用。
16.用于将微管体外转变成病理状态的方法，特征是将野生型tau蛋白与依照权利要求5或6的IIA型一起在容许所述IIA型分子与微管相互作用的生理条件下保温而生成病理微管。
17.用于对能够中和依照权利要求5或6的IIA型分子的病理作用的物质筛选它们消除和/或中和IIA型分子并恢复由II型分子引起的生理微管参数和功能的特性的方法，包括下列步骤a)依照权利要求16在存在IIA型分子和微管蛋白下形成病理微管；b)将物质、IIA型和微管蛋白的混合物与待测物质一起保温；并c)检验在减少由IIA型分子引起的病理微管形成方面的结果。
18.用于测试在表达IIA型分子的细胞系统中有效抑制依照权利要求5或6的IIA型分子在促进异常微管形成方面的体内活性和功能的物质的方法，包括下列步骤a)将编码IIA型分子的功能基因导入表达野生型tau的细胞，处于合适调控区的控制之下；b)容许IIA型tau分子与微管之间形成复合物，由此所述复合物参与病理微管的形成；c)将待测物质施加到包含所述复合物的细胞上；并d)检验所述物质对IIA型生物活性的作用，尤其是对微管网络及其相关功能的修饰。
19.表达依照权利要求1-8任一项的分子的转基因动物。
20.依照权利要求19的转基因动物作为阿耳茨海默氏病的动物模型的用途，尤其是用于筛选和测试治疗阿耳茨海默氏病的药物。
21.包含依照权利要求1-8任一项尤其是依照权利要求1、2、5、或6的分子和制药学可接受载体尤其是佐剂的疫苗。
22.依照权利要求1或2的分子与微管蛋白形成复合物起动的抑制剂。
23.依照权利要求22的抑制剂，特征是它包含结合部分，如以保藏号02060767保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Porton Down，Salisbury，英国的单克隆抗体DC44。
全文摘要
本发明描述了新型N端和C端双重截短tau分子(“IA、IB、IIA、和IIB型tau分子”)，以及由重组和生物这两种来源提供这些分子的方法。此外，还提供了结合阿耳茨海默氏病的诊断和治疗方法使用这些分子的筛选方法。
文档编号G01N33/68GK1668641SQ03816647
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月9日 优先权日2002年7月12日
发明者E·康特赛克瓦 申请人:阿克松神经科学研究和发展股份有限公司
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