专利名称：花生种皮抗黄曲霉基因PnAG1的克隆及其荧光定量检测方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl及其编码蛋白以及荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
花生是世界四大油料作物之一，也是我国单产、总产最高的油料作物和经济作物， 其产量占世界花生总产量的45%。多年来，花生一直是我国出口创汇额最高的油料作物。 但由于花生受病虫害及黄曲霉污染较为普遍，往往造成减产及品质下降等，尤其是黄曲霉 毒素污染，近年来因欧盟、东盟、日本等花生进口大国提高花生黄曲霉毒素和农药残余物的 检测标准，以及我国花生产区黄曲霉毒素污染问题长期不能得到解决，从而使花生黄曲霉 毒素含量超标，成为我国花生出口的一个重要限制因素。因此，对花生抗病品种的研究成为 热点问题。关于花生抗黄曲霉侵染机理的研究主要集中在探讨花生固有的抗性物质和感染 黄曲霉后的诱发防卫反应等。其中，固有抗性物质研究则集中在研究荚壳和种衣的完整性 对防止黄曲霉侵染的重要性，显微和超显微观察显示，抗感品种间种皮的结构存在较大的 差异，抗病品种的种皮细胞壁较厚，表皮细胞之间结合紧密，栅栏细胞层严密厚实，裂缝和 气孔较少；而感病品种的种皮细胞壁则相对较�。赴浣岷辖鲜杷桑逊旌推捉洗�。 研究表明，花生种皮是抵抗黄曲霉侵染的天然屏障，种皮完整性对提高抗性极为有利，花生 的种皮成分与黄曲霉抗性密切相关，能够降低黄曲霉菌对花生的侵染。植物在进化过程中逐渐形成自身的防御机制，以抵抗病虫害。其中包括结构性防 御(如厚角质层)、抑制剂(酚类化合物、单宁、凝集素等)、酶(几丁质酶和葡聚糖酶等) 及特定的病原菌识别机制。在这种识别机制中包括细胞壁的增厚、抗性基因的表达和细胞 凋亡。目前的研究工作主要集中在抗性基因的克隆方面。对亚麻抗锈病遗传性和锈菌致 病性的遗传分析，使得人们第一次发现了基因对基因的相互作用。根据Flor的“基因对基 因”假说，植物与病原菌之间存在着共进化的关系，寄主植物的每一个抗病基因，在病原菌 中都存在与之相对应的“无毒基因”，而病原菌中又存在与“无毒基因”相对应的“毒性基 因”，含有“无毒基因”和“毒性基因”的病原菌对含抗病基因的寄主分别表现为非亲和性和 亲和性。有研究表明无毒基因具有多样性，而与之相对应的抗性基因则种类有限，只有五 禾中，其中，NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat，参考 Ellis J and Jones D. Structure and function of proteins controlling stain-specific pathogen resistance in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology,1998,1 288~293)家 族是最丰富的一种，包括抗真菌、细菌、病毒、线虫等。目前，已经从玉米、水稻、小麦、甘 薯等植物中成功克隆出抗病基因，通过对这些抗病基因的氨基酸序列分析发现，大部分 植物抗病基因编码NBS-LRR类抗病蛋白，如小麦抗叶锈病基因和霜霉病基因等。NBS (核 苷酸结合位点)抗病基因是植物抗病基因中一个最大的类别，NBS保守结构域含有许多保守的基序，如p-loop、Kinase 2、Kinase 3a和跨膜结构域GLPL等(参考Ellis J and Jones D. Structure and function of proteins controlling stain-specific pathogen resistance in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology,1998,1 288~293), NBS 结构域可能结合了抗病信号的传递，在植物抗病反应中起着重要的作用。花生由于基因组复杂，使用转座子标签技术和图位克隆法克隆抗病基因相当困难，而从上述分析可以发现，根据NBS结构域的保守区域设计简并引物，从花生中克隆NBS 抗病基因是一种简便、有效、可行的好方法。通过此方法，已在大豆、甘薯、玉米等植物中克 隆出抗黄曲霉基因，而花生与大豆、甘薯、玉米等同源性很高，因此，可以推测出，在花生中 可能存在NBS-LRR类抗病基因与黄曲霉抗性相关。本发明通过对NBS结构域保守区域及一 些已克隆抗病基因的分析，设计一对简并引物，在花生中克隆出NBS抗病基因，并对其进行 进一步分析，为花生抗黄曲霉品种的育成奠定基础。目前鉴定花生黄曲霉抗性的方法只能通过对接种后黄曲霉毒素的含量来间接获 得，而且所采用的方法，例如薄层色谱法和高压液相色谱法，都具有操作复杂、检测费用高 并且对设备的要求较高等特点，不能有效地用于花生抗性育种研究。在花生黄曲霉抗性基 因分离鉴定的基础上，可以实现在分子水平对花生抗黄曲霉基因的检测，到目前为止，对花 生种皮抗黄曲霉基因的检测方法还未见相关报道。荧光定量PCR技术具有快速、灵敏度高 和特异性好等特点，因此对花生种皮抗黄曲霉基因的荧光定量检测方法的建立，将有助于 优质抗黄曲霉花生新品系的快速鉴定和筛选。
发明内容
本发明的目的是从花生中分离克隆得到一种花生种皮抗黄曲霉基因。本发明的另一个目的是获得花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl的编码蛋白。本发明的另一个目的是提供一种针对上述花生种皮抗黄曲霉基因的荧光定量PCR 检测方法，它能有效克服现有技术中存在的缺陷，具有特异性强、灵敏度高和稳定性好的特
点ο本发明提供如下多个技术方案1、一种克隆获得花生种皮抗黄曲霉基因的方法，包括如下步骤(1)提取高抗黄曲霉花生品种的种皮基因组DNA ；(2)以如下引物为简并引物进行PCR扩增；Pfl :5’ GGNATGGGNGGNGTNGGNAARACNAC-3‘Prl :5，NACYTTNAGNGCNAGNGGNAGNCC-3，(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、回收和纯化，进行序列测序，将测序结果 进行拼接，得到目的基因序列；其中上述获得的目的基因序列为编码SEQ ID NO :4所示蛋白的核苷酸序列，进一 步优选的是如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。上述方法还可进一步包括对获得的基因序列进行生物信息学分析，包括氨基酸序 列分析、保守结构域分析、开放阅读框分析和/或同源性分析，进一步确定获得的基因序列 是抗黄曲霉基因序列。2、一种实时荧光定量PCR检测花生种皮抗黄曲霉基因的mRNA表达水平的方法，包括如下步骤 (1)提取花生种皮总RNA，反转录为cDNA ；以该cDNA为模板，以 PFAGl 5 ‘ -GCGGATCCATGGGTGGTTTTGGTAATACT-3‘PRAGl 5' -TGCTCGAGTTACTTTTAGTGCCAGTGGT-3‘为引物进行PCR扩增，将PCR产物与载体进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌， 提取质粒，计算出质�？奖词唤竦玫闹柿Ｒ来蜗∈停�6个梯度，每个梯度重复三次，作 为实时荧光定量PCR反应的标准品模板；用上述标准品模板进行荧光定量PCR，所用荧光定量PCR引物为LEFT PRIMER :5，AGGGATTCGATCTGAAAGCA-3，RIGHT PRIMER :5，TACTCCATTTGTCGGCATCA-3，每个循环结束后收集荧光信号；以质粒稀释浓度倍数为X轴，以荧光量进入指数期增长时的循环数为Y轴，作图得 标准曲线；(2)提取不同花生品种或同一花生品种的不同时期种皮总RNA，反转录为cDNA ；以 该cDNA为模板，以LEFT PRIMER :5，AGGGATTCGATCTGAAAGCA-3，RIGHT PRIMER :5，TACTCCATTTGTCGGCATCA-3，为引物进行荧光定量PCR，重复三次，反应条件同步骤(1)；每个循环结束后收集 荧光信号，对照步骤(1)获得的标准曲线，即得出所测样品的抗黄曲霉基因拷贝数，以此确 定不同花生品种或同一花生品种的不同时期花生种皮抗黄曲霉基因mRNA表达水平。所述的花生种皮抗黄曲霉基因为编码SEQ ID NO 4所示蛋白的核苷酸序列，进一 步优选的是如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。上述步骤(1)和⑵的荧光定量PCR反应条件为95°C预变性2min，95°C 15 秒-57°C 15秒-72°C 20秒40个循环，每个循环结束后收集荧光信号，最后一步为72°C延伸 2min。荧光域值设置为3 15个循环的荧光信号强度标准偏差的10倍。有益效果1、通过抗病基因的保守结构域特别设计简并引物克隆得到花生抗黄曲霉基因。2、克隆出的新基因为花生抗黄曲霉品种的选育提供基�。纯赏ü蚣际踅� PnAGl转入花生，从而培育出抗黄曲霉花生新品种。3、本发明公开的花生抗黄曲霉基因荧光定量检测方法，实验设计简单，测定目的 基因表达量只需设计一对引物即可；无需要设计多个探针即可快速检验多个基因；荧光定 量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期。在此阶段，各反应组分浓度相对稳定， 没有副作用，Ct与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比Ct值能更稳定，更精确地反 映起始模板的拷贝数；能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，操作简单、自动化 程度高，并且速度快、高通量。
图1 花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl的开放读码框分析结果图2 花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl编码蛋白的保守区域分析结果
图3 花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl编码蛋白与大豆，蓖麻，苜蓿，毛白杨LRR氨基 酸序列进行Clustalx分析的结果图中 1 为 Populus trichocarpa clone 17221944 TIR-NBS-LRR type disease resistance protein (以 Populus 不出)，Genebank 序列号为 DQ513250. 1 ;2 为 Ricinus communis disease resistance protein RGA2 (以 Ricinus 不出),Genebank 序列号为 XM 002517604. 1 ;3 为 Medicago truncatula disease resistance protein (以 Medicago 不 [ii) ,Genebankj^^ljABE87630. 1 ；4力Glycine max NB-LRR type disease resistance protein Rpsl-k-1 (以 Rpsl-k-1 示出)，Genebank 序列号为 AAX89382. 1 ；5 为 Glycine max NB-LRR type disease resistance protein Rpsl_k_2 (以 Rpsl_k_2 不出)，Genebank 序 列号为AAX89383. 1 ；6为PnAGl序列(以AGl示出)。图4 花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl的标准曲线 图5 花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl标准曲线的溶解曲线
具体实施例方式实施例1 花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl的获得花生种皮抗黄曲霉基因PnAGl是根据NBS-LRR保守结构域P-loop和GLPL设计简 并引物，利用简并引物进行PCR克隆得到的1、提取花生高抗黄曲霉品种Jll种皮基因组DNA。Jll由山东省花生研究所提供(此只是示例性的)，采用CTAB法提取花生基因组 DNA,具体操作步骤如下(1)1. 5ml离心管中加入750ul CTAB提取液。(2)取花生种皮Ig左右于研钵中，加入液氮研磨，取0. 2g左右加入到预先已加入 CTAB提取液的离心管中，轻轻颠倒混勻。(3)60°C水浴温育 25min。(4)4°C,12000rpm离心lOmin，取上清于另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊 醇(V/V = 24 1)，轻轻混勻，重复3次。(5)4°C，12000rpm离心lOmin，取上清液于另一 1. 5ml离心管中，加入等体积_20°C 预冷的异丙醇，轻轻颠倒混勻，低温(4°C )放置30min。(6) 4°C, 12000rpm 离心 lOmin。(7)去上清，70%乙醇洗涤沉淀后置于超净工作台上吹干。(8)加入 80ul TE 溶解 DNA。(9)加入 1. 5ul Rnase (10mg/ml)，30°C保温 4h 以除去 RNA，_20°C保存备用。提取的DNA利用琼脂糖凝胶电泳分离，并利用紫外分光光度计对其纯度及浓度进 行测定。上述提取方法和提取条件只是示例性的，本领域技术人员可以对其中的条件进行 适当优化，也可用其它方法提取花生种皮基因组DNA。2、简并引物设计及合成简并引物Pfl 5' -GGNATGGGNGGNGTNGGNAARACNAC-3‘ (SEQ ID NO 1)
Prl 5' -NACYTTNAGNGCNAGNGGNAGNCC-3，(SEQ ID NO 2)简并引物由宝生物工程有限公司合成。3、PnAGl基因序列克隆取0. 5 μ 1上述花生种皮基因组DNA为模板，利用简并引物进行PCR扩增，PCR反 应体系如表1所示。表IPCR反应体系
权利要求
一种克隆获得花生种皮抗黄曲霉基因的方法，其特征在于包括如下步骤(1)提取高抗黄曲霉花生品种的种皮基因组DNA；(2)以如下引物为简并引物进行PCR扩增；Pf15’ GGNATGGGNGGNGTNGGNAARACNAC 3’Pr15’ NACYTTNAGNGCNAGNGGNAGNCC 3’(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、回收和纯化，进行序列测序，将测序结果进行拼接，得到目的基因序列；其中所述获得的目的基因序列为编码SEQ ID NO4所示蛋白的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核苷酸序列是如SEQID N0:3所示的 核苷酸序列。
3.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于还进一步包括对获得的基因序列进 行生物信息学分析的步骤，包括氨基酸序列分析、保守结构域分析、开放阅读框分析和/或 同源性分析。
4.一种实时荧光定量PCR检测花生种皮抗黄曲霉基因的mRNA表达水平的方法，其特征 在于包括如下步骤(1)提取花生种皮总RNA，反转录为cDNA；以该cDNA为模板，以 PFAGl 5' -GCGGATCCATGGGTGGTTTTGGTAATACT-3'PRAGl 5' -TGCTCGAGTTACTTTTAGTGCCAGTGGT-3'为引物进行PCR扩增，将PCR产物与载体进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌，提取 质粒，计算出质粒拷贝数；将获得的质粒依次稀释，做6个梯度，每个梯度重复三次，作为实 时荧光定量PCR反应的标准品模板；用上述标准品模板进行荧光定量PCR，所用荧光定量PCR引物为 LEFT PRIMER 5' -AGGGATTCGATCTGAAAGCA-3‘ RIGHT PRIMER 5' -TACTCCATTTGTCGGCATCA-3‘ 每个循环结束后收集荧光信号；以质粒稀释浓度倍数为X轴，以荧光量进入指数期增长时的循环数为Y轴，作图得标准 曲线；(2)提取不同花生品种或同一花生品种的不同时期种皮总RNA，反转录为cDNA；以该 cDNA为模板，以LEFT PRIMER 5' -AGGGATTCGATCTGAAAGCA-3‘ RIGHTPRIMER 5' -TACTCCATTTGTCGGCATCA-3’为引物进行荧光定量PCR，重复三次，反应条件同步骤(1)；每个循环结束后收集荧光 信号，对照步骤(1)获得的标准曲线，即得出所测样品的抗黄曲霉基因拷贝数，以此确定不 同花生品种或同一花生品种的不同时期花生种皮抗黄曲霉基因mRNA表达水平； 所述的花生种皮抗黄曲霉基因为编码SEQ ID NO :4所示蛋白的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的核苷酸序列是如SEQID N0:3所示的 核苷酸序列。
6.如权利要求4或5任一所述的方法，其特征在于所述步骤⑴和⑵的荧光定量PCR 反应条件为95°C预变性2min，95°C 15秒_57°C 15秒_72°C 20秒40个循环，每个循环结束后收集荧光信号，最后一步为72°C延伸2min ；荧光域值设置为3 15个循环的荧光信号强度标准偏差的10倍。
全文摘要
该发明涉及一种花生种皮抗黄曲霉基因PnAG1的克隆及其荧光定量检测方法。利用简并引物对花生种皮基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行回收、测序和拼接，获得新的花生种皮抗黄曲霉基因PnAG1。利用实时定量PCR检测PnAG1基因mRNA表达水平，以此确定不同花生品种或同一花生品种的不同时期花生种皮抗黄曲霉基因mRNA表达水平。
文档编号G01N21/64GK101988056SQ20101055731
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者单世华 申请人:山东省花生研究所
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