专利名称：用于测定碱性磷酸酶和消除血红蛋白干扰的方法
技术领域：
本发明涉及到一种用于通过光学测量测定一个样品中的碱性磷酸酶的方法，该方法通过特定波长组合的手段消除了游离的血红蛋白或血液代用品的干扰，本发明还涉及到一种在碱性磷酸酶的测定中消除游离的血红蛋白或血液代用品的干扰的方法以及特定波长的组合在消除游离的血红蛋白或血液代用品的干扰中的使用。
溶血作用已知可以严重干扰一些用于测定分析的诊断方法。溶血作用被理解为红血球的任何的损坏，例如，通过机械，渗透压，化学和酶对红血球细胞膜的作用而造成的损坏。作为溶血作用的后果，血色素血红蛋白(Hb)被释放并且不能从样品中去除。血红蛋白的存在是有问题的，这是因为，一方面，在一些情况下血红蛋白的吸收光谱同被检测的物质和指示剂(生色原)的吸收光谱有较大的重叠，这可导致在光度检测中的错误。在另一方面，血红蛋白还可以同样品成分发生化学反应而形成也可导致失败的测量的物质。
近来，基于血红蛋白而制造的血液代用品(Blutersatzmittel)被越来越频繁的用于医疗目的，例如在大量失血后使用。血液代用品中的血红蛋白可以是天然的或合成的。通常还使用了类似Hb的化合物。同溶血作用相比，在以血液代用品进行的治疗中血液、血清或血浆中的Hb成分可能高于2000mg/dl。因此含有血液代用品的样品中的干扰通常比发生溶血的样品更加显著，这是因为从一开始血红蛋白或其合成的类似物就处于游离状态。
游离的血红蛋白所造成的干扰在对碱性磷酸酶的光度测定中尤其严重。在415nm下测量4-硝基酚的形成(吸光度的增加)以测定碱性磷酸酶。血红蛋白在415nm下也有吸收。血红蛋白的存在在两方面干扰了碱性磷酸酶的测定一方面，在碱性环境中，Hb的光谱以一种时间依赖的方式变化(吸光度增加)，另一方面，超过一特定的Hb含量时测量设备将达到光度计的极限。
此前的工艺中已有多种在血清或血浆样品的分析中消除血红蛋白光谱和化学影响的方法发表。
由于在自动分析仪上操作简单，除第一种测量波长(主波长(HauptmeBwellenlnge))外，通常还使用第二种测量波长(次波长(HebenmeBwellenlnge))以消除诸如血红蛋白、胆红素和脂血这样的干扰物质的干扰效应或至少使该效应最小化。在Clin.Chem.25/6，951-959(1979)中Hahn等人提及次波长必须被选择以使其接近生色原的最小吸收和干扰物质的最大吸收。但是，使用所提及的测量程序以消除碱性磷酸酶测定中的干扰是不可能的。
Jay和Provasek在C1in.Chem.39/9，1804-1810(1993)中述及碱性磷酸酶测定中的溶血作用干扰是由于Hb光谱的时间依赖的变化所导致。该干扰可通过数学校正算法确定(测定样品中Hb浓度，在一定量下，校正碱性磷酸酶的测定值，该定量与测定的Hb量相等)。
Jay和Provasek提及的数学校正消除了可达至少800mg/dL Hg的干扰，然而，使用户困挠的是，需要另外测定Hb含量，随后还需额外的数学校正步骤。
Jay和Provasek(见上文)还描述了通过速率空白法消除干扰的方法。
通过速率空白(rate-blank)测量以校正溶血作用干扰也在EP-A-0695805中有描述。在该方法中，在对样品中的一个组分进行实际的光度测定之前对样品进行预反应以测定样品的溶血作用的程度。随后获得的测量值以一个数值对进行校正，用于校正的该数值通过将溶血程度同干扰物质在测量误差中的作用量相联系而确定。
Hb干扰可以通过速率空白测量而消除，但最高只限于Hb含量为ca.1200mg/dl，这是由于在更高的Hb含量下达到了光度计的极限。这对于消除溶血作用的干扰可能足够，但根本不足以消除血液代用品所造成的干扰。
另一种在白蛋白测定中消除血红蛋白干扰的方法也被公布(PCT申请WO 97/45728)，该方法通过主波长和次波长的特定组合达到了对血红蛋白干扰的消除。但是，在该PCT申请中所提及的波长组合不能用于碱性磷酸酶测定，这是由于在这些波长下不能获得4一硝基酚的测量信号。
待审的出版物WO 97/45733述及可以通过在单独的紫外测试中使用波长546和570可以消除血红蛋白的干扰。但是，该方法只能用于使用340nm主测量波长的的酶学紫外测试。尽管单独通过使用次波长546或570nm可以达到对Hb干扰的完全消除，但这对于酶学生色原的测试，例如波长在415nm范围内的碱性磷酸酶的检测是不可能的。
美国专利5,766,872提及577nm的次波长可在淀粉酶的测定中降低溶血作用的干扰。但是，被引用的测量数据表明在Hb含量为500mg/dl时测出的数值有达到8％的明显偏差。这对于消除溶血作用的干扰可能足够，但有可能在较高的Hb含量(例如在以血液代用品进行治疗时的Hb含量)下，由于使用ca.415nm为主波长，这一测出的数值的偏差将变得更大并且对Hb干扰的消除不足。
在先前的领域中，在高浓度的Hb存在下，例如在含有血液代用品的样品中，没有任何方法已知可用于无干扰地测定碱性磷酸酶。
因此，本文目的为开发一种改进的方法以用于样品中的碱性磷酸酶的测定，该方法能较大地克服先前工艺的不足。本文还特别意图提供一种简单并且对用户友好的方法以消除在测定碱性磷酸酶时血红蛋白和基于血红蛋白的血液代用品所造成的干扰。
通过一种方法该目的已经达到，该方法用于通过光学测量测定样品中的碱性磷酸酶，它在权利要求中有更详尽描述。该方法的特征在于使用450±10nm作为主测波长以及使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种作为次测波长。在优选情况下，只使用所述的次测波长中的一种。
令人惊奇的是，当变化主波长和刺激波长时，碱性磷酸酶的Hb干扰可被有效地消除。对于Hb干扰的令人满意的消除，仅仅变化主波长或仅仅变化次波长是不够的。
由于4-硝基酚的吸收谱，测量碱性磷酸酶不仅可以在415nm下进行，而且在450±10nm也可进行。尽管此时主吸收波长不在检测反应通常的最大吸收处而是在其侧翼，但获得的测出信号对碱性磷酸酶的精确测定是足够的。
新的主测量波长450±10nm的选择已经导致了血红蛋白干扰的轻微减低，但只有将主波长450±10nm同次波长480±10nm、546±10nm或575±10nm中的至少一种进行组合才能令人惊奇地获得对干扰的完全消除。次波长570nm被证明是特别适合的。次波长450±10nm已经证明非常适合于消除以ICFF法测定碱性磷酸酶时的血红蛋白干扰(实施例2)。
其它的次波长如340，376，505，600，660和770nm已经证明不适合消除血红蛋白干扰。
本发明的方法使得血红蛋白或类血红蛋白的化合物对碱性磷酸酶测定的干扰能够首次以简单的方式被消除，Hb含量可达到至少3000mg/dl。对Hb干扰的消除的上限决定于光度计的效能。因此本发明的方法可预期获得对含量高达6500mg/dl的血红蛋白的干扰的消除。本发明可进一步应用于碱性磷酸酶的多种检测试剂，如实施例1-3所示。
本发明的方法适用于任何存在有游离的血红蛋白的样品的测定。在本发明的理解中，术语游离的血红蛋白被用于区分存在于完整的红血球中的血红蛋白。含有游离的血红蛋白的样品的例子为发生溶血的血清或血浆样品或含有血液代用品的样品。属于本发明的理解中的术语游离血红蛋白的血液代用品的例子为衍生的、多聚化的、修饰或交联的血红蛋白衍生物并且特别包括人类血红蛋白或牛血红蛋白，例如DCL血红蛋白(琥珀酰水杨酸(Diaspirin)交联的血红蛋白)或重组产生的血红蛋白。
本发明还涉及到一种用于在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离的血红蛋白所导致的干扰的方法。该方法的特征在于使用450±10nm作为主测波长以及使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种作为次测波长。
本发明的一个进一步的主题内容是主测波长450±10nm同次测波长480±10nm、546±10nm或575±10nm中的至少一种进行组合使用以在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离血红蛋白或基于血红蛋白制造的血液代用品所造成的干扰。
本发明通过以下的实施例来阐明实施例通用方法一种含有Hb的溶液被加入一个血清库的一部分以产生至少为3000mg/dl的Hb含量。同一血清库的相同体积的另一部分同相等量的NaCl溶液(154mmol/l)相混合。两部分随后以不同的比例相互混合以获得一Hb浓度系列，包含11个样品，其中较低的样品不含Hb而最高的样品含至少3000mg/dl的Hb。
实施例1根据SFBC法测定碱性磷酸酶根据Ann.Biol.Clin.Vol.35，271(1977)，按照SociétéFrancaise de Biologie Clinique的建议的测定该测定在一台Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析仪上进行。
以下的试剂被使用试剂1930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液pH 10.5；1.03mmol/l天冬氨酸镁试剂2930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液pH 10.5；1.03mmol/l天冬氨酸镁；98mmol/l 4-硝基苯基磷酸盐测试程序如下向11μl样品加入250μl试剂1，5分钟后加入50μl试剂2。再过50秒钟后，在4分钟的期间内测定分析物，在此期间测量吸光度的变化。以下的主测波长(λ1)和次级检测波长(λ2)的组合被用于测量λ1/λ2＝415/546nm，415/570nm，415/660nm，450/660nm，(对比)，450/546nm和450/570nm(发明)。
碱性磷酸酶通过Jay和Provasek所述的速率空白测量来测定以作为进一步的比较(称作415/660nm RB)。
结果如表1所示。可以见到，同其它的波长组合或速率空白测量相比较，当使用本发明的测量波长组合450/546nm或450/570nm时血红蛋白的影响被明显降低。表137℃下测出碱性磷酸酶的U/l含量
*在该情况下使用了一种交联的血红蛋白。
实施例2根据IFCC法测定碱性磷酸酶根据J.Clin.Chem.Clin.Biochem.Vol.21，731-748(1983)，按照International Federation of ClinicalChemistry的建议的测定该测定在一台Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析仪上进行。
以下的试剂被使用试剂1360mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液pH 10.4(30℃)；2.04mmol/l乙酸镁；1.02mmol/l硫酸锌；2.04mmol/l N-(2-羟乙基)-乙二胺三乙酸试剂2360mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液pH 10.4(30℃)；2.04mmol/l乙酸镁；1.02mmol/l硫酸锌；2.04mmol/l N-(2-羟乙基)-乙二胺三乙酸104mmol/l 4-硝基苯磷酸盐测试程序如下向7μl样品加入250μl试剂1，5分钟后加入60μl试剂2。再过50秒钟后，在4分钟的期间内测定分析物，在此4分钟的期间测量吸光度的变化。以下的主测波长(λ1)和次级检测波长(λ2)的组合被用于测量λ1/λ2＝415/700nm，(对比例)，450/480nm(发明)。
结果如表2所示。可以见到，同先前的测量波长组合415/700nm相比较，当使用本发明的测量波长组合450/480nm时血红蛋白的影响被明显降低，而且在高浓度的Hb下无负值出现。
表237℃下测出碱性磷酸酶的U/l含量
*在该情况下使用了一种重组产生的血红蛋白。
实施例3根据DGKC法测定碱性磷酸酶根据Z.Klin.Chem.Klin.Biochem.Vol.10，290(1972)，按照“Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie”的建议的测定该测定在一台Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析仪上进行。
以下的试剂被使用试剂11.02mmol/l二乙醇胺缓冲液pH 9.8；0.51mmol/l氯化镁试剂21.02mmol/l二乙醇胺缓冲液pH 9.8；0.51mmol/l氯化镁61mmol/l 4-硝基酚磷酸盐测试程序如下向4μl样品加入250μl试剂1.5分钟后加入50μl试剂2。再过50秒钟后，在4分钟的期间内测定分析物，在此期间测量吸光度的变化。以下的主测波长(λ1)和次级检测波长(λ2)的组合被用于测量λ1/λ2＝415/770(对比)，450/546nm(发明)。
结果如表3所示。可以见到，同先前的测量波长组合415/700nm相比较，当使用本发明的测量波长组合450/546nm时血红蛋白的影响被明显降低，而且在高浓度的Hb下无负值出现。表337℃下测出碱性磷酸酶的U/l含量
*在该情况下使用了一种多聚化的血红蛋白。
权利要求
1.通过光学测量测定样品中的碱性磷酸酶的方法，其中450±10nm被用作主测波长，并且使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种作为次测波长。
2.权利要求1的方法，其中480±10nm被用作次测波长。
3.权利要求1的方法，其中546±10nm被用作次测波长。
4.权利要求1的方法，其中575±10nm被用作次测波长。
5.权利要求1的方法，其中570nm被用作次测波长。
6.前述权利要求之一所要求的方法，其中测定在血清或血浆样品中进行。
7.前述权利要求之一所要求的方法，其中被测定的样品含有游离的血红蛋白或基于血红蛋白的血液代用品。
8.权利要求7的方法，其中血液代用品含有一种衍生的，多聚化的，经修饰或交联的人类血红蛋白，牛血红蛋白或一种重组生产的血红蛋白。
9.前述权利要求之一所要求的方法，其样品含有最高达6500mg/dl的血红蛋白。
10.用于在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离的血红蛋白或血液代用品所造成的干扰的方法，其中450±10nm被用作主测波长，并且使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种作为次测波长。
11.一种主测波长450±10nm同次波长480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种的组合的应用，以在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离的血红蛋白或血液代用品所造成的干扰。
全文摘要
本发明涉及到一种用于通过光学测量测定一个样品中的碱性磷酸酶的方法,该方法通过特定波长组合的手段消除了游离的血红蛋白或血液代用品的干扰,本发明还涉及到一种在碱性磷酸酶的测定中消除游离的血红蛋白或血液代用品的干扰的方法以及特定波长的组合在消除游离的血红蛋白或血液代用品的干扰中的使用。
文档编号G01N21/27GK1329672SQ99814175
公开日2002年1月2日 申请日期1999年10月5日 优先权日1998年10月8日
发明者R·维谢特, W·特雷贝尔 申请人:罗赫诊断器材股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
